实用组织化学技术-常规病理组织学和组织化学(研究生)
组织化学课件研究生组化课件1
4．核酸显示法 显示DNA的传统方法为Feulgen反
应。切片先经稀盐酸处理后， 使细胞内
DNA水解，打开DNA分子中胶氧核糖核 酸和嘌呤碱之间的连接按键，使其释放 出醛基，再用Schiff试剂处理，形成紫红 色反应产物。
如用甲基绿-派若宁反应，可同时显 示细胞内的DNA和RNA甲基绿与细胞核 中的DNA结合呈蓝绿色，派若宁与核仁 及胞质内的RNA结合呈红色。
组织化学是近代的一个创造，是形 态与功能相结合，动态研究生命活动的 理想手段。
尽管如此，正如其它学科一样，组 织化学技术有一定的局限性。即使电子 显微镜的运用提供了很高的分辨力，组 织化学定量分析技术仍须经历相当长一 段时间，才能达到直接化学方法的准确 性。
• 随着科学技术的不断进步，多学科之间 的相互渗透，将推动组织化学的发展。
②脱水（dehydtation）、透明（clearing） 与包埋（embedding）:把固定好的材料 用乙醇将组织内的水分脱掉 ，经二甲苯 透明 后，再浸入已融化的石蜡中进行浸 透、包埋 。
③切片 （section）与染色 （staining）： 用切片机（microtome）切成5～10μm的 薄片，贴于载玻片上，脱蜡后进行染色， 最常用的染色法是苏木精 （hematoxylin,haematoxylin)和伊红 （eosin）染色简称HE染色。
苏木精为碱性染料，可使细胞核内的染
色质及细胞质内的核糖体等染成蓝紫色， 称嗜碱性（basophilia)；伊红是酸性染料， 可使多数细胞的细胞质染成粉红色，称 嗜酸性（acidophilia）；对碱性和酸性染 液亲合力都不强的，称为中性 （neutrophilia）；
④脱水、透明、封固（mounting）：切片 经脱水、透明后，于切片上滴加中性树 胶和盖片进行封固 后，贴标签备用。
组织化学技术
组织化学技术切片染色方法可以显示不同细胞和组织形态，以及细胞和组织中某些化学成分含量的变化。
一、染色的目的任何冰冻切片、石蜡切片等如果不经过染色，在显微镜下只能看到细胞及其它组织成分的轮廓，即使由于组织内部各种物质的折射指数不同，从光线的明暗上能观察到一些组织结构，但也是极其简单有限的，远不能满足观察和借以诊断的目的。
染色的目的，是将染料配制成溶液，将组织切片浸入染色剂内，经过一定的时间，使组织或细胞及其他异常的成分染上不同深浅的颜色，产生不同的折射率，便于在光学显微镜下进行观察。
因此，染色在组织形态学，特别是病理形态诊断、科研和教学工作中，都具有非常重要的意义和实用价值。
二、染色的原理染色就是染色剂和组织细胞相结合的过程。
有关两者结合的原理，有不同的学说，一般认为其过程是化学反应和物理现象。
（一）染色的化学反应在组织细胞内，一般有酸性和碱性区别，酸性物质部分能与溶液中的阳离子结合，碱性物质部分能与溶液中的阴离子结合。
在细胞核中，特别是核内染色质，一般有酸性物质组成（其中主要有核酸），故与碱性染料的亲和力很强，易于染色，以氧化苏木素代表的碱性染料中有染色作用的是阳离子。
在细胞浆中则由碱性物质组成，所以胞浆与酸性染料有较强的亲和力，以伊红染料为代表的酸性染料中有染色作用的是阴离子。
(二) 染色的物理作用1. 毛细作用及渗透作用组织有许多小孔，染料因渗透作用进入组织，它与组织没有牢固的结合，所以是单纯的物理作用，不能称为直接染色作用。
因所谓染色必需是染料留贮于组织内与组织有较稳固的结合。
2. 吸收或溶液作用组织吸收染料，作牢固的结合，组织的着色与溶液颜色相同，但不是和干燥染料的颜色相同。
如复红溶液为红色，所染组织也为红色，而干燥的复红带绿色。
3. 吸附作用吸附作用是固体物理的特性，它能从周围溶液中吸住一些细小的物质微粒，这些微粒可能是溶于溶液中的化合物，也可能是只在溶液中单独存在的离子，如染液中分散的色素粒子进入被染物质的间隙内，由于分子的引力作用，色素粒子被吸附而染色。
组织病理技术(完整版)
一.标本的采集和处理 在组织病理学研究中，制做高质量的组 织切片是关键性的一步，切片质量的好 坏直接影响着病理诊断结果的准确性和 可靠性，而一张好的切片与标本的采集 和处理过程有着密切的关系。
二、标本的固定
将组织浸入某些化学试剂中，使组织、细胞尽 量保持其生活状态时的形态结构和位置，称为 固定。
三、取材 在具体实验过程中，我们不可能将所有 的病理组织都做成切片进行观察，所以， 为达到正确观察或诊断的目的，必须采 集适量的病例组织，这不仅要求标本材 料要尽可能新鲜，而且要有一定的数量 和质量，根据需要确定取材的部位和块 数。
切取组织时，应用锋利的刀、剪，刀刃 宜薄，足够长。一般标本切取的组织块 厚以0.2~0.3cm为宜，对于冰冻切片，取 材组织块略厚度可达0.3~0.4cm，也可根 据情况略作调整。若过厚则固定不好， 组织结构不佳，过薄则切片张数有限， 有漏掉病变部位的可能性。一般来讲， 常规组织病理染色，组织块大小以 1.5cm×1.5cm×0.2～0.3cm为宜
笨和二甲苯都可使组织透明，常用二甲 苯。
透明步骤：低
高梯度透明。
3、浸蜡
经过透明的组织块，进一步移入熔化的 石蜡内浸渍，其目的是以石蜡置换组织 块中的二甲苯，使较软的组织块变成有 一定硬度的组织蜡 中等硬度石蜡
熔化的硬蜡。
4、包埋
组织包埋的方法有多种，如石蜡包埋法、火棉 胶包埋法等；常用的为石蜡包埋法。
理论上，凡需要进行病理检验的各种组织都应 该进行固定。组织离开机体或机体死亡后，若 不固定，细胞在自身酶的作用下会溶解破坏， 结构消失，无法进行形态学检查。
正确的病理诊断是建立在对病理标本正确的 肉眼形态观察和显微镜形态观察之上的，切片 的质量直接影响形态学观察的准确性，而一张 好的切片与组织的固定和取材质量密切相关。
组织化学及免疫组织化学.(DOC)
临床病理学特殊技术第1节组织与细胞化学（histochemistry and cytochemistry）【概念】运用物理和化学的技术方法显示组织细胞结构中的各种化学成分，并对这些化学物质进行定性、定位、定量，从而分析研究生物在生理或病理状态下细胞组织的代谢、机能及形态变化规律。
细胞化学是研究细胞的化学成分及其在细胞活动中的变化和定位的学科。
对细胞中的不同组分进行区别着色是细胞化学中最基础的工作。
组织化学是指利用细胞或组织中的某些化学成分生成有色沉淀物，对细胞组织中的这些化学成分进行定性、定位和定量分析的特殊技术方法。
细胞化学和组织化学的发展是分不开的，都是建立在细胞学、组织学以及生物化学的基础上。
【基本原理】用于组织与细胞化学研究的染料可以是碱性的也可以是酸性的。
酸性染料的生色基团是硝基和醌基；碱性染料的生色基团，包括着偶氮基吲胺基。
染色的原理是基于在酸性染料中具有染色作用的阴离子和细胞内的碱性物质相结合，而碱性染料中的阳离子和细胞内的酸性物质相结合，所以酸性的细胞成分被碱性染料所染色，而碱性的细胞组分则被酸性染料染色。
组织与细胞中的化学成分和其相应的底物呈一系列的化学反应，形成于显微镜下可见到的反应产物呈色。
常见的细胞化学物质成分染色方法见表2-1，组织化学物质成分染色方法见表2-2。
表2-1 细胞化学物质成分的鉴定* 黏多糖类是蛋白多糖分子中的糖链部分，是黏液（人体的粘膜上皮分泌出来的湿滑液体）的主要化学成分。
由于含酸基的不同，而又分为中性黏多糖（中性黏液）、酸性黏多糖（酸性黏液）和混合性黏多糖（混合性黏液）。
多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子机构复杂且庞大的糖类物质。
表2-2 组织化学物质成分的鉴定色素分为人为色素和自生性色素。
人为色素是由于固定剂与组织中某些成分相作用而产生，例如福尔马林色素等。
在某些病理情况下，细胞代谢所产生的沉着的色素，如脂褐素、黑色素、含铁血黄素、嗜银颗粒及组织内的微量金属离子等，需要一些特殊染色加以证明（表2-3）。
组织化学技术
组织化学技术组织化学技术篇一：组织化学组织与细胞化学一、填空题：体视学里是主要的填空题。
二、名词解释1、异染现象染料离子以某种方式使它对所吸收的波长有所改变，因而观察到被染的组织显示与该染料本身颜色不一样，此现象为异染现象。
2、诱发荧光和自发荧光诱发荧光：自发荧光：由于紫外线的照射，标本中的荧光物质吸收光能后，呈现出不同颜色的荧光，这是自发荧光。
3、原位杂交组织化学和免疫组织化学原位杂交组织化学（In situ hybridization histochemistry，ISHH）是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统通过组织化学或免疫组织化学在核酸原有的位置进行细胞内定位。
免疫组织化学（immunohistochemistry）: 将化学反应中呈色反应与免疫学抗原抗体反应结合起来，用标记的特异性抗体（或抗原）对细胞及组织内抗原（或抗体）的分布进行组织或细胞内原位检测的一门技术。
4、点计数（P116）估计面积和面积分数的方法，称为点计数。
5、形态计量术形态计量术(morphometry)是运用数学和统计学原理对组织和细胞内各种成分的数量、体积、表面积等的相对值与绝对值的测量,其中以研究组织和细胞内某种结构的三维立体结构的研究称体视学(sterology)。
6、DAB系统7、各向同性和各向异性指物体的物理、化学等方面的性质不会因方向的不同而有所变化的特性，即某一物体在不同的方向所测得的性能数值完全相同。
材料在各方向的力学和物理性能呈现差异的特性。
8、饲养细胞在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞(Feeder cell)。
9、完全抗原、半抗原和不完全抗原完全抗原:兼有免疫原性和反应原性的物质称完全抗原。
大多数蛋白质是良好的完全抗原。
半抗原:只有反应原性而无免疫原性的物质称半抗原或不完全抗原，绝大多数低分子量的多糖和所有的类脂均属半抗原。
临床病理学技术知识点
临床病理学技术知识点一、知识概述《临床病理学技术》①基本定义：临床病理学技术呢，简单说就是在临床环境下，对病理样本（像组织、细胞这些东西）进行处理和检查的技术。
比如说从病人身上取了一块组织，怎么把它处理好，然后能看到里面有啥毛病，这就得用到这些技术。
②重要程度：在医学这个大领域里，特别是在诊断疾病方面，临床病理学技术可太重要了。
它就像是医生的侦察兵，能让医生清楚知道病人身体到底出了啥问题，是炎症、是肿瘤，还是其他的病。
要是没有这些技术，很多病就只能瞎猜，没法准确诊断来对症下药。
③前置知识：得先有点基础的解剖学知识，不然都不知道身体各个器官组织在哪长着，怎么取样本呢。
还有生理学知识也需要一些，得了解正常的身体机能啥样的，这样才能看出病理样本和正常的差别在哪。
另外，基本的化学知识也不能少，因为在处理样本的时候会用到好多化学试剂和化学反应。
④应用价值：在医院里，得了各种病的病人都要依靠这个技术。
例如有个病人肚子痛，怀疑是肠道有毛病，医生取了肠道组织，通过临床病理学技术进行切片、染色，在显微镜下就能看到细胞有没有异常，是感染了病菌啊，还是发生了恶变之类的。
这样就能给到准确的治疗方案，不浪费病人的时间和医疗资源。
二、知识体系①知识图谱：在整个医学学科里，临床病理学技术处于诊断环节的核心位置。
它联系着基础医学知识，像解剖学、生理学、病理学基础理论这些，同时为临床的各种学科比如内科、外科、肿瘤科等提供诊断依据。
②关联知识：和解剖学关联很大，知道人体结构才能准确取病理样本。
和病理学理论也是相辅相成的，病理学理论告诉咱们疾病的原理，而这个技术就能从实际样本里去验证这些理论。
还有和影像学也有关，有时候影像学先发现一个肿块之类的，然后临床病理学技术就去进一步确定这个肿块到底是啥。
③重难点分析：- 掌握难度：- 就我感觉，这个知识点的难点在样本处理部分。
比如用福尔马林固定样本，浓度啊，固定时间长了短了都会有影响。
样本切片也挺难的，切得薄厚不均匀就没法好好在显微镜下看。
常规组织病理技术
第一章常规组织病理技术病理学是一门研究疾病的病因、发病机制、病理改变（包括代谢、机能和形态结构的改变）和转归的医学基础学科，重点通过对疾病过程中各个器官、组织形态学变化的观察，为临床解决疾病的病理诊断问题。
病理学实验研究的方法多种多样，尤其是近十多年来分子生物学技术以及其它高、新技术在病理领域的应用，进一步拓宽了病理工作者的视野，丰富了病理研究工作的内容，也提高了疾病诊断的准确性。
但是，无论多少新技术、新方法涌现，病理工作最基本，也是最重要的技术仍然是常规组织病理技术，离开它，一切病理诊断或研究都将无从谈起。
本章将简要介绍常规的组织病理技术，包括组织（细胞）取材、固定、包埋、切片、苏木素-伊红染色以及常用的特殊染色方法。
第一节组织与细胞的取材病理标本检查包括大体和显微镜下观察两个方面，一张好的切片与组织取材、固定、染色都有密切的关系。
正确的取材、合适的固定和良好的染色是优质病理工作的基础。
目前，由于免疫组织化学方法已普遍应用于大多数医院病理科和研究单位，而该方法所需的材料，不仅要求组织细胞的形态完整保存，而且要最大程度地保存组织或细胞成分的抗原性。
在保证抗原性不受损伤的同时，还要求抗原不弥散，以保证其准确定位。
这就对组织的取材和固定提出了更高的要求。
任何固定不及时或处理不当的标本，都可能导致产生假阴性或假阳性结果，影响病理诊断的准确性。
一、组织取材组织标本主要取之于活检标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本等。
组织取材的一般原则是：①组织块的厚度为0.2~0.3cm；面积1~1.5cm2，最多不超过2cm2，太大、太厚的组织块常常固定不好；对于冷冻切片，取材组织块可略厚（0.3~0.4cm）；用于免疫组织化学染色的组织块，以1cm×lcm×0.2cm 为好，不要太大，以免浪费试剂；②对于皮肤、腔道器官及囊壁组织等应剪成细条，较长时可将其缠绕成同心圆状；③骨组织需先经过脱钙处理；④新鲜组织若需保存，应将所取组织用锡箔纸包好，放入液氮速冻，然后置于-70℃冰箱中。
组织化学技术教程
组织化学发展到今天，它的技术多 而复杂，但基本技术是容易掌握的。从 样品的取材、固定剂的选择、切片的制 备、孵育反应、各种溶液的配制以及光 镜组织化学技术和电镜组织化学技术等， 每项技术都有明确的要求和规范的操作 程序。进行没项工作，应事先做好准备， 按技术程序进行，可做一定的预备实验， 效果稳定后，再开始实验研究，这样才 能达到预期的科研效果。
⑹ 样品大小适当，光镜样品一般在1.0cm以内， 免疫组织化学样品大约在 : 2cm×1.5cm×0.3cm[厚度控制在0.3cm]。 cm3小块。
二、 固定
1．固定的目的要求 固定是将组织尽可能保持原有生活状态以 适用于某些研究程序的一种方法。固定有 如下几方面的目的。 ⑴ 不仅保持组织生前的形态结构，还要保持
⑶ 灌流故定法
灌流故定法是通过血管的途径，将固定 液灌注到所要固定的器官组织内，将生活的 细胞在原位及时的固定后，在摘取样品的方 法。这种方法的特点是：快速、固定充分， 但是对固定液的温度、压力及取材时间有严 格的要求。
⑷ 培养细胞和外周血细胞固定法
培养细胞核外周血细胞的固定方法比较 特殊，对培养细胞通常取盖片入37℃的 Hanks液中，漂洗两次(每次3—5min)，洗除 血清后，再置于甲醛缓冲固定液内10— 30min。.如果进行电镜观察就以2%戊二醛 固定或采取双重固定法。
60℃＝1h ；石蜡Ⅱ（60℃）2 h。
⑹ 包埋：铁板架包埋或其他容器，有时要求快 速冷却。
⑺ 切片和贴片：在切片机上切片，置水槽中展 片、捞片和贴片。
⑻ 染色 ——HE染色 步骤： 1） 二甲苯5～10分钟，脱去切片中的石蜡。 2）降浓度梯度酒精脱水
（100%→95%→90%→80%→70%）。 每级脱水2～3分钟以除二甲苯。
组织学技术
组织学技术（供动物学、发育生物学硕士研究生用）参考书目1．杜卓民1982 实用组织学技术人民卫生出版社2．芮菊生等1980 组织切片技术人民教育出版社3．郑国昌1979 生物显微技术人民教育出版社组织学技术组织学技术是高等院校生物学、医学、农林院校以及科研单位的一项最基本的实验室技术和工作手段。
无论在教学还是在科研工作中，凡是对人体或生物体进行微细结构观察时，大多数需要依靠组织学技术来完成。
随着科学技术的不断进步，组织学技术在不断的发展，使得组织学的研究方法很多。
目前，组织学的研究方法主要包括一般光镜技术、组织细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放射自显影技术、电镜技术和组织培养技术等六大类。
本课程计划以同学们的实际操作为主，主要掌握一般光镜技术中的石蜡切片技术。
第一章实验室基本设备及常用试剂一、基本设备组织学实验室的常用设备主要有观察组织标本用的显微镜及制作标本用的必要设备和工具。
（一）显微镜种类很多，功能也各不相同。
用于组织切片观察的主要是透射光学显微镜。
该镜所观察的放大倍数为物镜放大率和目镜放大率之积。
为显示观察到的材料的大小，常需要在目镜内安装目镜测微尺。
目镜测微尺为一块圆形玻璃片，普通用测量长度的标尺为直线式，一般长5mm，分成1个大格，每1大格又分成10个小格，共50小格。
目镜测微尺安装在目镜的光阑上，有刻度的一面朝下。
目镜测微尺每1小格所代表的实际长度（10×或40×）要用镜台测微尺进行标定。
参考郑国昌《生物显微技术》P185-189 。
（二）切片机切片机一般有三种类型，即旋转式、滑动式、冰冻式。
这三种切片机均具有三种主要部件：①固定切片刀的刀架。
②夹持组织片的夹具。
③推动组织夹具的微动调节器。
滑动切片机多用于火棉胶切片，故又称火棉胶切片机。
它常用于制作大块标本、囊状器官和易于塌陷的组织切片。
冰冻切片机是将组织切片承托台改换成急速冷冻装置（约-20~-30℃），这种急速冷冻装置可以是液态二氧化碳，也可以用半导体制冷装置。
组织与细胞化学技术-2
试剂方面：因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯或标记过量等
消除方法
A. 加 1抗前加正常血清10~30分，以封闭组织中带电荷的基因，避免与1抗的非 特异性结合。
B . 减少非特异性染色： a.免疫酶组化染色时，加1抗前，用0.3％的H2O2甲醇溶液将组织切片处理30分 （3％H2O2甲醇溶液，5~10分） b.免疫荧光染色时，用0.01~0.05％伊文思蓝稀释荧光抗体
2. 根据标记物是否与特异性第一抗体结合分类
（1）直接法 （2）间接法，灵敏度高于直接法。
附：免疫组织化学标本制备过程及要求 1. 取材
实验动物：麻醉 （处死〕，锋利刀片切成大小适中，厚度3mm- 4mm; 小型实验动物：灌注（流）固定（生理盐水和4％多聚甲醛） 取材
人体材料：活检组织、手术标本、细胞和组织
特性 组成 特异性 亲和力 交叉反应
单克隆抗体与多克隆抗体特性比较
多克隆
单克隆
多种类抗体的混合物
单一种类的抗体
低针对多个抗原决定族 高针对单一的抗原决定族
平均亲和力较高
不定，较低
高
低
五、抗原与抗体特异性结合特点
抗原与抗体的结合具有高度的特异性。在抗体的轻链和重链的可 变区中有3个特殊的易变部位，即在第30位、50-60位和第100位氨基酸 残基附近，这些部位称为超变区。超变区直接参与抗原接合部位的组 成，形成的接合部位是一个浅平穴槽，槽大小约I.5nm×0.6nm×0.6nm 抗原决定族在空间呈互补性地嵌入槽内，借分子间的范德华力、疏水 作用静电引力以及氢键而相互结合。
组织化学技术分类及基本要求
分类
1. 化学方法：在组织切片上生成沉淀以表示定性定位的存在 2. 类化学方法：用特异性染色显示，如胭脂红显示糖原 3. 物理学方法：用荧光分析、组织吸收光谱等研究组织细胞内的化 学成分 4. 显微烧灰方法：对组织中无机物质和微量元素进行测定 5. 免疫学方法：用免疫学原理 6. 分子生物学方法：如原位杂交组织化学技术
常规病理学技术
甲醛的优点： 1、收缩较小 2、固定较为均匀，穿透力强 3、能使组织硬化并富有弹性 4、能保存脂肪及脂类物质 5、成本较低
1%锇酸 1－2h 3. 脱水：逐级丙酮，环氧丙烷 4. 包埋及聚合：浸透、包埋（Epon812）
聚合（硬化）、时间 5. 超薄切片：超薄切片机 6. 染色：饱和醋酸铀、1％柠檬酸铅 7. 透射电镜观察
（二）扫描电镜技术
1. 取材：1×1mm3 2. 固定: 2%戊二醛 2h
1%锇酸 1－2h 3. 脱水：逐级丙酮，环氧丙烷 4. 干燥：临界点干燥，醋酸异戊酯 5. 喷金： 6. 扫描电镜观察
靠，已成为癌症早期诊断的重要手段之一，可广
泛应用于临床和大量人群防癌普查。
三、常规细胞病理学技术
• 一、取材、涂片制备 痰涂片、胸水、腹水及尿液制片
• 二、固定 三、染色 (巴氏染色)
常用固定液
（1）等量95%乙醇和乙醚混合液 （2）氯仿酒精固定液 （3）95%酒精固定液 （4）福尔马林固定液
细胞学研究，固定液选择要根据实验要求 条件而定，如用细胞涂片作原位PCR，固 定液要选用多聚甲醛。
（二）石蜡包埋制样
组织块脱水： 逐级乙醇脱水
透明：二甲苯 浸蜡：65°C 包埋：溶解蜡
人工脱水程序 (适应于3mm厚的组织块)
1、30%酒精 24h 2、50%酒精 24h 3、70%酒精 24h 4、80%酒精 24h 5、90%酒精 12h 6、95%酒精 4h 7、95%酒精 4h
8、100%酒精 2h 9、100%酒精 2h 10 二甲苯 40min 11 二甲苯 40min 12 石蜡（软） 1h 13 石蜡 1h 14 石蜡 1h
边缘组织，剩余组织在病理报告发出后约一 个星期后处理。
组织化学与细胞化学技术培训课件
组织化学与细胞化学技术
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Ab-2（Ho）
Ab-1 （Mo）
Ab-3（Mo）
细胞
免疫酶桥联(APAAP)法染色原理
组织化学与细胞化学技术
28
卵白素（Avidin）
生物素化Biotion （HRP/AP）
ABC复合物
生物素化二抗
Ab-1
ABC法染色
细胞
组织化学与细胞化学技术
原理图
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三、多聚螯合物法(ELPS)
体－抗补体荧光抗体复合物。此法敏感性较高。但其较 易
出现非特异性染色，而且操作过程相对较复杂。
（四）双标记法
运用两种荧光素在不同的激发光下显示不同颜色的特
点，将不同荧光素分别标记所需的特异性抗体。可在同
一
组织化学与细胞化学技术
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单色荧光染色
组织化学与细胞化学技术
20
双色荧光染色
组织化学与细胞化学技术
种，酶反应所需的底物基质液和偶联剂品种也很丰富。在双重 标
记技术中可选用一些显示色差异较明显的显色系统。但往往由 于
组织化学与细胞化学技术
8
1.原 理
过碘酸氧化多糖类中的乙二醇使之成为双醛基，后 者与无色品红结合形成紫红色化合物。定位于含多糖 类的细胞质内。多糖类物质含量决定了色泽的深浅。
2.参考范围:（正常阳性细胞）
①粒细胞系—原粒细胞多呈阴性,通常随细胞不断成 熟阳性反应由弱渐强,至细胞完全成熟后达到最大 强度。其中中性粒细胞呈胞浆内弥散状红色阳性, 嗜酸粒细胞S颗粒之间的胞浆呈红色阳性,嗜碱粒 细胞呈大小不一的颗粒状紫红色阳性。
(二)免疫荧光技术和免疫荧光技术
利用不同荧光素在激发光下呈现不同颜色这一特点,如异硫氰
组织化学与细胞化学技术
（一）直接法
是以荧光标记抗体直接与被检标本内的抗原反应。 依据荧光出现的位置及强弱对被检细胞做出判别。该法的 优点为简单特异。但其缺点也很明显即敏感性较低另需制 备大量特异性的荧光抗体。
（二）间接法
间接法采用抗球蛋白试验原理，先制成荧光素标记抗抗 体。检测中先将特异性抗体与被检标本作用一定的时间 后，充分洗去未结合的游离特异性抗体，然后添加荧光素 标记抗抗体使之形成被检抗原－抗体－荧光素标记抗抗体 复合物，由此显示特异荧光并因复合物上带有较多荧光 标志物，所以其敏感性比直接法要高。
neutrophil alkaline phosphatase ,(NAP)
1.原理
细胞内碱性磷酸酶在碱性环境下水解磷酸萘酚，使 之释放出萘酚，后者与重氮盐偶联形成有色沉淀物。 定位于酶活性所在处。
2.参考范围 ：
中性粒细胞碱性磷酸酶活力正常范围2%～56%, 积分 4～80 分 /100个中性粒细胞
组织化学技术: 应用化学、物理、生物化学、免疫学或分子生物
学的原理和技术与组织学相结合而产生的技术，能在 组织切片定性、定位地显示某种物质的存在与否以及 分布状态。还可进一步用显微分光光度计或图象分析 仪测定光镜切片中该物质反应的强度，获得定量的信 息。
细胞化学技术: 应用组织化学技术于游离细胞的样品(如细胞涂 片)，则称细胞化学技术。
一 组织细胞化学染色
组织细胞化学染色是将形态和功能相结合的细胞科 学。它是在保持完整的细胞形态和细胞结构的前提下, 运用化学反应将被检细胞内的各类化学成分和细胞结构 及生理活性物质原位地显示。因而对于探索化学成分、 生理功能、新陈代谢及细胞生理和病理改变有着重要的 意义。
组织细胞染色的范围一般可分为：蛋白质类（氨基 酸)、核酸类、多糖类、脂类、盐类或金属类，采用的 方法通常为化学结合物理溶解显示及酶-底物反应。
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4. 必须掌握被检测各种酶的特性，如酶的功能、酶存在的 特定部位、酶反应的适宜温度和酸碱度、酶的特异激活剂和 抑制剂、影响酶活性的因素等；
5. 必须做对照实验，借助阳性和阴性对照，正确分析实验 结果，注意识别假阳性结果。
细胞和组织化学方法的基本技术
5. 多聚甲醛缓冲固定液 paraformaldehyde
多聚甲醛 4g，加入0.1mol/L磷酸缓冲液 pH7.2 100ml中，加热60～80℃溶解。
固定15min～24h,0～4℃。
主要用于科研组织标本的固定，尤其用于免疫组 织化学染色的组织固定，保护抗原决定簇不被封闭。
6.戊二醛磷酸缓冲固定液 glutaric dialdehyde 25%戊二醛10ml，加入0.1mol/L磷酸缓冲液
取材 固定 水洗 脱水 透明 浸蜡与包埋 切片 染色:脱蜡、脱苯、水化、染色、脱水、透明 封片
一、取材
基本要求：取材是否正确、恰当，直接影响切片 的制作及正确诊断。
1．取材越快越新鲜越好，防止组织自溶、腐败。 2．取材刀要锋利，切取时刀口垂直地切取；严禁 挤压，严禁用钳镊钳夹，以免使组织或细胞变形造成 人为的损伤。
取材部位如下：
⑴额极； ⑵中央前后回；⑶海马；
⑷内囊； ⑸丘脑；
⑹枕叶；
⑺脉络丛；⑻中脑；
⑼桥脑；
⑽ 延髓； ⑾小脑；
⑿脊髓颈段。
取材时要包括软脑膜、室脑膜或软脊膜（刀要锋 利）。
垂体：取垂体时注意前、中、后叶和垂体柄都要 兼顾，从前向后矢状切。
心：一般悄况下将心房、瓣膜、心室一起取下。 也可分别取一块病变部位连同正常组织。也可单独取 心室肌，乳突肌组织。
实用组织化学技术
中国医科大学法医学院 张国华
细胞和组织化学方法研究的范围
1. 组织细胞中的无机物质：主要包括钾、钙、 锌、铜、汞等金属；氯化物、磷酸盐等盐类；以及 各种无机放射性物质等。
2. 组织细胞中的有机物质：主要包括中性脂肪、 磷脂类、胆固醇、中性和酸性粘多糖类、糖原、粘 液蛋白、淀粉、类淀粉物质、黑色素、脂褐素、胆 色素、氨基酸、肽、蛋白质、DNA、RNA、各种维生 素等。
pH7.2～7.4 90ml中。 固定时间为60min, 0～4℃。
主要用于科研组织标本的固定，尤其用于电镜超 薄切片的小组织块标本的初固定。
①具有强的穿透力，固定均匀，能迅速渗透组织 内部，使组织细胞结构保持生活时期的相③能迅速使组织中的蛋白质，糖、脂肪等物质凝 固而成为不溶性物质。
④使组织达到一定的硬度，便于切片制作、染色。 X⑤价格便宜，容易买到，同时要配制方便。
常用的单纯固定液
乙醇（酒精）alcohol 甲醛（福尔马林）（缓冲液配制） formalin 重铬酸钾 potassium bichromate 苦味酸 picric acid 锇酸 osmic acid 丙酮 acetone 冰醋酸 glacial acetic acid 多聚甲醛缓冲固定液 paraformaldehyde 戊二醛磷酸缓冲固定液 glutaric dialdehyde
肺：常规取材应包括左、右两肺（五个肺叶）， 可根据病变需要决定取材块数，特殊情况下为区别在 哪个肺叶上取的材可用形状做标志，在记录时记清楚。
肾：取材包括被膜、皮质、髓质和肾盂，并要求 区别左、右肾。
胰：常规取胰体部，为长方形必要时加取胰头、 胰尾。
肝：取长方形或三角形均可，带被膜。
脾：取材带被膜。
管腔脏器：取材时注意方向
3．取材大小，一般长l-3厘米，宽1-2厘米，厚度 为0.3-0.5厘米。科研用光镜标本不超过1cm× 1cm× 1cm，电镜标本直径约0.5mm。过大材料在短时间内不 易固定透，影响效果。
4 ．要兼顾病变部位与正常部位。 5 ．尽可能在低温条件下操作，0～4℃。
各器官取材方法：
脑：取材应能反应出脑各部位的变化，一般采用 冠状切面法，全脑包括（桥脑、延脑、小脑和脊髓颈 段及脉络丛）。
⑴ 检材、标本：①材料块不能过大； ② 固定器皿不易过小； ③固定液量不易过少， 大约是固定材料体积的20～40倍。
⑵固定液：根据检验目的不同选择不同固 定液，如做糖元检查就不能用含水的固定液， 做电镜检查就必须用锇酸固定液等。
固定液：用以固定组织的药剂。 固定液分为两大类：
单纯固定液：仅由一种药剂组成。 混合固定液（或复合固定液）：由二种以上的 药剂组成的固定液。 固定液选择标准：
大、小肠：考虑环行肌肉，沿肠管的长轴取 （纵切）；
食管：以横切面为宜；
胃：常规取材以胃底为好；
气管：横切、纵切均要有。
总之管腔脏器的各层构造都要取到。
为了防止标本入固定液后变形，将材料取下后 （如剪开的大小肠、胃等组织）将浆膜面铺在滤纸 上，然后入固定液内，这样能防止或减少组织受压 变形与收缩。
二、组织固定
组织固定的意义： 组织固定是做好切片的重要步骤之一，如果首次固 定失败，再重新固定也不如一次固定成功好，无法补 救。 迅速将检材固定能有效地防止组织及细胞发生死后 的一系列变化。 固定的关键在于取材后尽可能地及时地将取到的材 料进行固定，抑制其死后变化的进展，尽力使组织接 近于生前状态。 另外，在标本制做过程中经过许多步骤，为了防止 组织成份的溶解消失，有必要及时转变为不溶性物质， 从而有利于保存。
组织固定的目的：
⑴ 阻止死后变化，防止组织的自溶与腐 败。
⑵ 使组织的结构保存下来，如蛋白质， 脂肪、糖元、酶等各种成份与生活时的形态 相仿。
⑶ 便于染色，同时对组织有媒染作用， 使不同的组织成份对染料有不同的亲和力， 使细胞各部易于受色。
⑷ 能使组织硬化，为做薄切片打下基础。
组织固定的注意事项：
3. 组织细胞中各种酶类：如碱性磷酸酶、酸性 磷酸酶、胆碱酯酶、细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢 酶、乳酸脱氢酶等--蛋白质。
细胞和组织化学方法的设计要求:
1. 必须最大限度地保存细胞和组织中各种化学成分和/或 酶的活性，以保证定性、定量研究；
2. 必须最有效地保持细胞组织固有的形态结构，以保证化 学成分和各种酶在细胞组织中的定位；