海藻糖水解酶蛋白的重组表达

海藻糖水解酶蛋白的重组表达

摘要：用试剂盒法从培养的菌液中提取出玫瑰微球菌QS412菌株基因组，然后用琼脂糖凝胶电泳来检测。筛选合适的引物后，将所提基因组用PCR 进行扩增，扩增后的结果用电泳图来展示。

关键词：海藻糖；玫瑰微球菌；琼脂糖凝胶电泳；引物；PCR

1 综述

1.1 海藻糖的简介

海藻糖，英文名Trehalose ，分子式C 12H 22O 11，英文化学名称（α-D-glucosido-α-D-glucosidemycose ）。由于海藻糖具有稳定细胞膜和蛋白质结构、抗逆保鲜等独特的生物学特性，正越来越多地被人们应用到生产活动、日常生活的诸多方面。

海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。许多对外界恶劣环境表现出

非凡抗逆耐受力的物种，都与它们体内存在大量的海藻糖有直接的关系。而自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖类，均不具备这一功能。这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料，大大拓展了海藻糖作为天然食用甜味糖的功能。 1.2 麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase ）

1995年日本林原生化研究所报道的，用两种他们发现的新酶即低聚麦芽糖基海藻糖生成酶(MTSase)和低聚麦芽糖基海藻糖水解酶(MTHase)进行协同作用，可以由淀粉直接通过酶法转化生产海藻糖。具体途径如下：

麦芽低聚糖海藻糖

麦芽低聚糖

）

麦芽低聚海藻糖合成酶−−−−−−−−→−ase (MTS

麦芽低聚糖

海藻糖麦芽低聚糖海藻糖

）

水解酶（麦芽寡糖基海藻酶

+−−−−−→−ase MTH

该方法指通过微生物中的麦芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase ）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase ）的协同作用，将一定链长的直链淀粉转化为海藻糖。麦芽寡糖基海藻糖合成酶是一种分子内转糖基酶，催化麦芽寡糖(淀粉液化液)还原端的葡萄糖基和相邻的葡萄糖基间的α,α-1,4 葡萄糖苷键转化成α,α-1,1 葡萄糖苷键，生成麦芽寡糖基海藻糖；麦芽寡糖基海藻糖水解酶专一水解麦芽寡糖基海藻糖的麦芽寡糖基和海藻糖基间的α,α-1,4 糖苷键，以上两种酶联合作用，每次从麦芽寡糖生成海藻糖和少两个葡萄糖单位的麦芽寡糖。

1.3 引物设计

1.3.1 引物设计的一般原则

●序列选取应在基因的保守区段

●避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形

成环状发卡结构

●典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低

序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

●Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－

60%

●引物之间的TM相差避免超过2℃

●引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同

的碱基

●为避免的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。

●Taqman探针PCR要求片段长度在80bp－150bp

●引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

1.3.2 Primer Premier 5.0

PRIMER PREMIER是一种用来帮助研究人员设计最适合引物的应用软件。利用它的高级引物搜索、引物数据库、巢式引物设计、引物编辑和分析等功能，可以设计出有高效扩增能力的理想引物，也可以设计出用于扩增长达50kb以上的PCR产物的引物序列。

Primer Premier 5.0的工作页面

1.4 PCR（聚合酶链式反应）

1.4.1 简介

聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction），简称PCR。聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA 的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction ，简称PCR ）又称无细胞分子克隆或特异性DNA 序列体外引物定向酶促扩增技术。 1.4.2 工作原理

类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性—退火(复性)—延伸三个基本反应步骤构成：

模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；

模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；

引物的延伸：DNA 模板—引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

2 实验部分

2.1 材料与方法 2.1.1 材料 2.1.1.1 菌株

玫瑰微球菌QS412菌株由老师购置

2.1.1.2 酶与试剂

试剂盒、2×Taq PCR MasterMix （TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.,LTD ）、其他试剂均为分析纯购于北京化工厂

2.1.1.3 仪器

离心机、PCR 仪、恒温水浴锅、TopPette 手动移液枪（大龙兴创实验仪器有限公司）

2.2 方法

2.2.1 玫瑰微球菌QS412菌株的培养

培养基配方：葡萄糖20g/L 、蛋白胨5g/L 、酵母粉1g/L 、O H HPO K 2423∙ 2g/L ，O H MgSO 247∙ 0.5g/L ，pH 自然。

培养条件：30℃,180rpm