分子信标荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌方法建立及其临床应用

分子信标荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌方法建立及其

临床应用

摘要】目的：探析分子信标荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌方法建立及其

临床应用效果。方法：选取167份肺结核患者痰液为研究标本，分别采用分子信

标荧光定量PCR技术、抗酸染色法、集菌培养法对标本进行检测，回顾性分析三

种检测方法的阳性检出率。结果：分子信标荧光定量PCR技术的阳性检出率为70.66%，抗酸染色法为29.34%，集菌培养法为42.51%，分子信标荧光定量PCR

技术的阳性检出率优于其他两种检测方法（P＜0.05）。结论：分子信标荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌的阳性检出率、特异性、敏感性较高，可为肺结核的

临床诊断和治疗提供借鉴，值得进一步推广和应用。

【关键词】分子信标荧光定量PCR技术；结核分枝杆菌；临床应用效果

【中图分类号】R37 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2015）16-0118-02

结核病临床上较为常见的传染类疾病，结核菌入侵人体的各器官，严重影响

患者的生存质量。结核病的病原检测可为疾病的诊断和治疗提供重要依据，在结

核病的防治中也占据极其重要的地位[1]。本文选取167份肺结核患者痰液为研究

标本，对分子信标荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌方法建立及其临床应用效

果进行评价，具体如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月～2014年12月我院收治的167例肺结核患者为研究资料，其中，男性患者98例，女性患者69例，年龄区间为17～62岁，平均年龄为（35.69±2.33）岁。收集167份肺结核患者痰液为研究标本，进行结核分枝杆菌

检测。

1.2方法

1.2.1分子信标荧光定量PCR技术取0.5ml标本与1ml4%的氢氧化钠溶液混合，在室内温度适宜的条件下，放置10分钟，并进行离心，将上清液去掉。稍

许沉淀后，在标本中融入0.5ml的灭菌蒸馏水，将其摇匀，离心2分钟。洗涤三

次后沉淀，并在沉淀液体中提取50μL的DNA，摇匀，冷却至室温适宜温度，离

心5分钟，取溶液上清液进行分子信标荧光定量PCR（深圳中洪博元生物技术有

限公司）检测，并严格遵守说明实施操作。

1.2.2抗酸染色法首先，使用玻璃片夹将检测标本夹住，放置在火焰高处进

行加热，使其逐渐升温，当标本出现蒸汽后离开。增加染液，继续加热，加热时

间为3～5分钟，标本冷却后，用水冲洗。其次，使用3%盐酸酒精进行脱色，时

间为0.5～1min，并用水冲洗。最后，使用碱性的美兰溶液进行复染，时间为

1min，经水洗，并使用吸水纸将水分吸干，使用油镜观察。

1.2.3集菌培养法抽取标本通过集菌器，使用生理盐水进行灭菌，并通过蛋

白水洗过滤膜进行过滤，至少需过滤三次，每次200ml。再将培养基打入到集菌

器中，完成上述操作后，将其放置在20～25℃的孵室中。

1.3 统计学处理

本研究所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行数据统计，计数资料用%表示，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 分子信标荧光定量PCR方法检测结核分枝杆菌建立

通过对退火温度和Mg2+浓度的反复分析和比对，确定最佳的反应体系如下：上游引物为4.0μL10×buffer（缓冲），7.0mmol/LMg2+，下游引物为200μmol/L dNTP，0.2μmol/L。分子信标探针为0.2μmol/L，DNA模板为4μL，PCR扩增产物

规格为107dp。

2.2 三种检测方法的阳性检出率比较

对167份肺结核患者痰液标本进行检测，采用分子信标荧光定量PCR技术进

行检测，检出阳性例数为118例，阳性检出率为70.66%；采用抗酸染色法进行检测，检出阳性例数为49例，阳性检出率为29.34%；采用集菌培养法进行检测，

检出阳性例数为71例，阳性检出率为42.51%。

经统计学处理，分子信标荧光定量PCR技术的阳性检出率优于其他两种检测

方法，组间有显著差异（P＜0.05）。

3.讨论

针对结核病患者而言，防治和早期诊断是关键。有研究显示[2]，抗酸染色法

和集菌培养法是现阶段临床检测的标准，但仍存在检测灵敏度低、特异性差等问题，影响临床诊断的准确性和有效性。分子信标荧光定量PCR技术是具有空间结

构性的单链DNA，其序列呈现环形、互补。当处于自由状态时，荧光报告的共振

能出现量性转移；当处于靶向序列存在时，分子信标和靶向序列均呈现出延伸性

的线型分子，使基团发出荧光信号，确保探针和靶基因有效结合。

本次研究结果显示，分子信标荧光定量PCR技术的阳性检出率为70.66%，抗酸染色法为29.34%，集菌培养法为42.51%，分子信标荧光定量PCR技术的阳性

检出率优于其他两种检测方法（P＜0.05）。本结果与相关研究结果相符[3]，从结果中可以看出分子信标荧光定量PCR技术在结核分枝杆菌建立和检测中具有极其

重要的应用价值，为结核病的防治提供重要依据。

综上所述，分子信标荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌的阳性检出率、特

异性、敏感性较高，可为肺结核的临床诊断和治疗提供借鉴，值得进一步推广和

应用。

【参考文献】

[1]孙菲,胡苏,邱亚群.基于同源加尾系统的改良分子信标荧光PCR检测香港海

鸥形菌方法的建立[J].实用预防医学,2015,22(1):37-40.

[2]王旭洲,谢飞来,郑智勇.荧光定量PCR检测结核/非结核分枝杆菌在肉芽肿病理诊断中的应用[J].临床与实验病理学杂志,2013,29(8):884-887.

[3]王炜,陈晓,江凌等.HBVDNA定量与基因分型双重分子信标实时PCR方法的

建立及初步应用[J].中华检验医学杂志,2013,36(4):333-338.