原位杂交技术

复性
RNA
DNA
二、探针（probe）
(一)定义：
是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或
RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞
内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂，
探针的碱基序列是已知的，只能与特定的
核酸分子结合上
(二)探针的分类 根据探针的核酸性质分为
DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针、
提取标本DNA和RNA进行Southern和Northern
印记杂交、qPCR、RT-PCR等。
（4）RNA酶或DNA酶预先处理标本后杂交反应 （5）选用标记的非特异性（载体）序列或不相关 的核酸探针进行杂交。 （6）探针孵育后的检测系统对照
五. 实验结果可能的问题和原因
1. 标本形态结构不佳 取材的标本不新鲜，核酸有不同程度的降解 杂交预处理中蛋白酶消化不当所致
⑵ 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比
DNA-mRNA杂交体稳定 缺点：容易受RNA酶的污染而被降解
3. 寡核苷酸
短链探针(长度10-50个核苷酸)
根据靶分子而设计序列在DNA合成仪上合成 优点：形成杂交体快速(序列短，杂交时易于穿透) 缺点：特异性较低（短链和简单）
(三)探针的标记
2. 化学方法：
焦碳酸二乙酯( DEPC )
RNA酶抑制剂，有毒
(1)取材的器具用火焰灼烧过或高温消毒 (2)标本尽早固定，固定剂可灭活部分RNA酶 (3)所用玻璃器皿均须DEPC水浸泡(37 ℃，2h)，蒸馏 水清洗后高压消毒，然后180℃处理3h以上 (4)塑料器材最好用灭菌的一次性用品或DEPC处理 整个操作过程带手套和口罩。
(二) 基本原理
碱基互补配对原理
加热变性 杂交反应
酶显色反应
带标记物的探针
酶标记的抗探针标记物的抗体
(三)DNA变性(denaturation)
定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开
成两条单链的过程。
方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、 甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。
本质是双链间氢键的断裂
常用免疫酶学显色检测方法有两类：
Dig-HRP检测系统
以DAB/H2O2为底物，结果为棕色；
以4-氯-1-萘酚/ H2O2为底物，结果为蓝色。
Dig-AKP检测体系
以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀。
Diao HL. 2007. Fertil & Steril
地高辛
在植入期子宫中的定位
2. 标记方法 (1)DNA探针标记 ①切口移位法
孵育15～20min
5、用0.1mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗1min 终止蛋白酶K的消化，DEPC-PBS洗2次，5分钟 6、DEPC-PBS-4%多聚甲醛后固定 10-15分钟 7、DEPC-PBS洗2次，5分钟
8、2×SSC洗5分钟
9、不含探针的杂交液中37℃孵育2h
10、2×SSC洗5分钟
(2)RNA探针标记
在体外转录技术中与探针制备同时完成
(3)寡核苷酸探针标记 末端转移法
三、原位杂交技术的基本步骤
观察、照相
百度文库
取材、切片
C C C C C C
显色
杂交
原位杂交技术的基本步骤与原理
原位杂交有很多种方法，但其基本实验程序相近的
包括：组织和器材的特殊处理 取材、固定、切片 杂交前处理 探针的制备和预杂交 杂交反应 杂交后处理 检测杂交信号，进行结果分析
杂交温度下预先孵育切片，以达到封闭或阻
断与核苷酸探针产生非特异性杂交点，降低
背景着色的目的。
(四)杂交反应 标记的探针与检测标本上的靶序列结合而形成杂
交体的过程。 这是原位杂交技术的关键步骤。 包括：探针的准备 双链核酸的变性 杂交反应
1. 探针准备 探针长度：50－100个碱基最佳
探针标记物：地高辛（DIG）
(二)取 材 目的：既要充分保留被测核酸，（特别是 RNA ）不 被降解，又要尽可能维持原有组织或细胞的形态 结构。 基本与免疫组织化学技术相似。 取材过程中避免手指、唾液和未经RNA酶抑制 处理的器具接触标本
标本的储存 所使用的容器 、刀具等均经高压消毒或清洁后 用 DEPC水清洗。 为防止RNA迅速降解，标本离体切小，迅速投入4％ 多聚甲醛溶液内，臵4℃冰箱内2-4小时。
小结
基本实验过程总结 探针制备、标记 →纯化 →变性
↓ 原位杂交 →杂交体探测： ↑ 放射自显影 样品制备 →切片 →通透处理 免疫细胞化学
Thank you！
常用试剂
1．4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA） 配法：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容 器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃， 使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH调pH值至7.0， 使呈清亮状，再加入约500ml 2×PBS，充分混匀（在 冰浴或冷水浴中），可再检测一下 pH，过滤后定容 至1000ml，室温或4℃保存备用。
杂交温度较高、孵育时间长易造成切片的飘浮
或脱片
2. 杂交信号弱 探针链太长不易深入细胞 探针的标记不好 靶序列暴露程度不佳 探针和（或）靶序列的变性条件欠佳
3. 无杂交信号 标本内无靶序列的存在 标本内存在靶序列，因实验某个环节的失 误导致后者可能降解
4. 非特异性着色 探针特异性 组织细胞内的内源性酶 组织细胞内的某些成分与检测系统的抗体非 特异性结合
（一）器材的特殊处理 DNA：稳定性较好，一般不需特殊处理。常规的
石蜡或冷冻切片均适用于组织或细胞内的DNA 原位杂交 RNA：RNA酶几乎无处不在，而且一般的消毒方 法不能将其灭活。因此，当检测RNA或用RNA
作为探针时，从标本准备到杂交结束前，都要
注意预防
去除或抑制RNA酶方法： 1. 物理方法： 对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器具作高温烘 烤（180-200℃干烤4-6小时） 对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒
再将组织移入 30 ％蔗糖 PBS 溶液内， 4℃冰箱内过夜。
次日可将标本储存于-80℃ 低温冰箱内保存。
组织制片 冷冻切片以厚5~30um最佳。
40℃烤箱内干燥2小时后储存在-80℃超低温冰箱
在-20℃可保存２～３周，在-70℃可保存数月之久 石蜡切片，一般不提倡浸入二甲苯溶液。
(三)杂交预处理
DNase I在DNA双链上造成单链切口 DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切 口处将旧链从5末端逐步切除 在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，将 dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新 的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入
②随机引物法
随机引物能与各种单链DNA模板结合
DNA聚合酶按53方向合成一新的 DNA链。 带标记的核苷酸掺入到新合成的DNA 分子中
特点：性能稳定，操作简便，成本低、耗时
短，标记探针可较长时间的保存和使用
地高辛（Digoxigenin 简写Dig-）
类固醇半抗原分子
人及多种动物体内不存在类似的物质，无交 叉反应
特点：敏感性与放射性核素标记的探针相似
较放射性标记系统安全，方便、省时间
定位准确，杂交背景好
地高辛标记探针的显色检测
注意：①配制时应在通风条件下操作，并避
免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因 PFA 有
4. 温度、时间和PH 方法：杂交液滴于切片上，加盖硅化的盖玻片。 杂交的温度：在Tm-25℃左右，大约在30～60℃之间 时间：16－20小时，一般过夜。 PH：6.5－7.5
含50%甲酰胺、盐浓度0.75mol/L左右时，杂交温度：
DNA探针是42℃
RNA探针是50-55℃
寡核苷酸探针是37℃
却，以保持变性后单链状态。
3. 杂交液的组成 探针——预变性的探针 高浓度盐类(柠檬酸钠)——增加杂交体的稳定性 甲酰胺——可降低解链温度 硫酸葡聚糖——对 DNA 有浓缩作用，可提高杂交 的反应速度10倍以上，但不影响探针的洗脱强度 牛血清白蛋白和鲑鱼精 DNA 或 RNA——用于阻止 探针与非特异位点或非目标DNA杂交。
寡核苷酸探针
1. cDNA(complementary DNA) 互补于mRNA的DNA分子 （长度为数百-数千碱基对） 优点 ⑴ 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 ⑵ 较不易被降解 ⑶ 标记方法可靠易行
2. RNA
RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对）
优点：
⑴ 杂交效率比DNA探针高
1. 切片脱蜡及水化
脱蜡及水化过程与普通石蜡切片相同
要求：脱蜡要彻底，否则影响探针对组织细胞 的穿透 RNA杂交: 需DEPC水替代蒸馏水稀释酒精 切片入DEPC水浸泡
2.增强标本通透性与核酸探针穿透性
常用方法：蛋白酶消化、去污剂处理、酸酐
处理和稀酸洗涤等
(1)蛋白酶K（甘氨酸）、胃蛋白酶（4％多聚
形态学实验技术
第四章 原位杂交技术
李成仁 组织胚胎学教研室
Tel：752220，Email：lichengren@sohu.com
中心法则
核酸分子原位杂交
？
免疫组织化学
一、核酸分子原位杂交的基本概念
(一)定义 简称原位杂交
用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核 酸中的互补序列杂交, 从而对组织细胞中的核酸进行 定性、定位和相对定量分析。
(五)杂交后处理 目的：尽可能洗去未杂交或非特异性吸附的探针。 方法：系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。 RNA探针杂交后漂洗液中的可加入RNA酶 原则：是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高
(六)杂交体的检测
生物素标记的探针 酶标记卵白抗生物素抗体 酶标记链霉抗生物素抗体连接 地高辛标记的探针 酶标记抗地高辛抗体 标记酶：HRP、AlP
热变性
熔解温度(, Tm) 变性是在一个相当窄的温 度范围内完成，在这一范 围内，双链 DNA 变性一半 所需要的温度称为 DNA 的 解链温度，又称熔解温度 , Tm)。其大小与G+C含量成 正比。
Tm=（G+C）%×0.41+69.3
解链曲线
DNA复性 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复双螺 旋构象，这一现象称为复性。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，又称为退火。
标本对照、探针对照、杂交体对照、检测系统对照
阴性对照：排除非特异性杂交等因素造成的假阳性
阳性对照：证明杂交步骤及试剂可靠性
对照实验设臵愈多，实验结果的可靠性就愈大。
注意：每次实验都应有阳性对照和阴性对照
常用的实验对照 (1)标本对照：选用已知为阳性或阴性的组织 (2)空白实验: 无探针的杂交液进行杂交 (3)选用其他生物学方法进行对照实验
靶核酸分子
地高辛标记探针
碱性磷酸酶联结的 抗地高辛抗体
(七)原位杂交详细步骤 1、二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。DEPC水洗2次， DEPC-PBS洗2次，5分钟 2、DEPC-PBS处理的Triton-X100处理15分钟 3、DEPC-PBS洗2次，5分钟
4、TE缓冲液稀释的蛋白酶K（5-20μg/m l）37℃
甲醛后固定）
酶的浓度和孵育时间应视标本种类、固定
剂种类、切片厚度等而确定
(2)去污剂处理 Triton X-100最常用 注意：去污剂处理不当，会引起靶核苷酸的丢 失，影响标本的形态结构 (3)酸酐处理和稀酸洗涤 防止探针与标本内的碱性蛋白发生静电效应， 减少杂交反应的背景色
3. 预杂交
杂交之前使用不含核苷酸探针的杂交液在
探针浓度：0.5－5.0μg/ml;
杂交液的量要适当，以10～20μl/每张切片为宜
2. 探针和靶核酸变性 当靶核酸或探针为DNA时，杂交前需要变性为单链 理论热变性温度：90℃－95 ℃
甲酰胺法：常规的加入30～50%甲酰胺于杂交液中
每增加1%，Tm值降低0.72℃，降至37-40 ℃为宜
注意：在每次变性后，都需要将样品用冰迅速冷
1. 标记物 (1)放射性标记物
3H、32P、35S、125I等。
特点：敏感性高 半衰期，放射性污染，成本高，耗时长
Vermot J. 2000. Endocrinology.
35
Xie HR et al. 2007. PANS
35
S
S
(2)非放射性标记物
生物素、荧光素、地高辛素、辣根过氧化酶、
碱性磷酸酶等。
11、含探针杂交液中37℃(42-55℃)孵育18h
12、1×SSC在室温下速洗， 1×SSC在55 ℃水 浴摇洗，2×15min，0.5 ×SSC在55 ℃水浴摇洗 2×15min， 0.5 ×SSC在室温下洗10min 13、放射自显影或酶显
四. 对照实验的设置
目的：保障实验结果的准确性和特异性