23基因工程载体-人工染色体载体XXXX09

3、PAC载体
二、植物载体
Plant cloning vectors
• Ti质粒:侵染广泛的双子叶植物 • T-DNA或T-区(T-region)：约20kb，包含专化冠瘿碱生
化合成和冠瘿瘤生长的基因，随机地整合到植物染色体上。 • 结构特点：两端具有25个碱基对的顺向重复序列，但重复
不是完全的。25个碱基对的序列称为T-DNA的边界序列 (T-DNA border sequence)。去除右边界序列，将使TDNA失去转移和整合的功能；左边界的缺失，对致瘤性 无明显影响。 • 毒性区域即vir(virulence)区域:引起T-DNA转移的区域。 长度约35kb，和T-DNA处于不同位置
• Intermediate vectors are incapable of replication in A.tumefaciens and also lack conjugation functions.
• Transfer of them was achieved using a triparental mating.
（1）双元载体系统（binary vector） 具有两个质粒——穿梭质粒和Ti质粒。 （2）共整合载体（integrated vector） 共整合载体系统包括在T-DNA上的激素合成 区经过突变后的Ti质粒和中间载体两部分。
Ri质粒
➢发根农杆菌存在另一种质粒，Ri质粒。 ➢Ri质粒也可完成外源基因向植物的转移工作。 发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根， 这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称 之为毛状根，也称为发状根，分别简称为毛根 或发根，Ri质粒为根诱导质粒。 ➢Ri质粒的结构与Ti质粒的结构很相似，可以 分为T区、vir区、ori区和其它区域等几个部 分。
Ri质粒
T区与Ti质粒的T-DNA十分相似： ✓①T区的左右边界序列。左右边界上含有 25bp的重复序列。 ✓②TL-DNA区。该区中含有与毛状根形成有
关的rolA、B、C、D基因群。
✓③TR-DNA区。该区中含有与农杆碱合成有 关的基因（ags）和生长素合成有关的基因
（tms1、 tms2）。ags基因在转化的初期起
着重要的作用，是不定根产生的关键
CaMV克隆载体
• 含1个约8kb的环状双链DNA分子； • 用于十字花科和少数非十字花科的植物基
（3）Con区(regions encoding conjugations)
该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），
调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。
（4）Ori区(origin of replication)
该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始 区。
T-DNA转移的机制
➢Ti质粒分子受到信号分子的激活作用之后， virD基因编码的一种核酸内切酶，先在TDNA的RB序列中的第3和第4碱基之间切开一 个单链缺口，随后在T-DNA同一条链的LB序 列中切出第二个单链缺口。 ➢T-DNA便以单链形式释放出来，并在RB序 列的引导下定向地转移到寄主植物细胞。
（4）克隆位点
位于 SUP4 基因内部。
插入失活选择：
SUP4酶失活的酵 母菌落呈红色； 不失活的菌落是白 色。
14
2、细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）
细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）
➢在有关的植物细胞酶体系的催化作用下，合 成互补链形成双链形式的T-DNA分子。 在一 系列酶的参与下整合进植物基因组。这种整合 是一种非正常重组。
2、Ti质粒载体
• Disarmed Ti vectors（非致瘤载体） • Cointegrate vectors（共整合载体） • Binary vectors（双元载体）
第三节 其他载体
2012.09
其他载体
• 一、人工染色体 • 二、植物基因工程载体 • 三、动物基因工程载体
一、人工染色体
人基因组十分庞大，约含4×109bp ，建立和筛选人的基因组文库，要求有 容量更大的载体，酵母人工染色体（ yeast artificial chromosome,YAC）载体 应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（ telesome）、着丝点(centromere)及复 制起点等功能序列，可插入长度达200500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以 随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成 为人基因组研究计划的重要
Structure of a bacterial artificial chromosome (BAC), used for cloning large fragments of donor DNA. CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance. oriS, repE, parA, and parB are F genes for replication and regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment.
◆ BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的 一些特点构建的。F因子在细菌接合时转移1Mb 的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构 成的BAC载体，可用于克隆100 kb以上的DNA 片段。 ◆带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常 仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子， 在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本 身分子量小，具有氯霉素抗性选择基因及多克 隆位点。
Triparental mating
• An E.coli strain A carrying a helper plasmid able to mobilize the intermediate vector in trans
• The E.coli strain B carrying the recombinant intermediate vector
A.tumefaciens cell, the T-DNA
carried by pBI121 is transferred to the plant chromosomal DNA by proteins coded by genes carried by pAL4404
Ti质粒及其衍生载体
Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子，很难直接 使用，故需对其加以改造，构建出Ti质粒的衍生 载体系统，广泛用作植物基因工程中的载体：
YAC载体
正常酵母人工染色体含有： * 四膜虫端粒（tel) * 酵母自主复制序列（ ARS) * 酵母着丝点 (CEN) * 酵母的选择标记 (TRP1、 URA1)
The functional elements of a yeast chromosome
the capacity to clone large exogenous DNA fragments (up to 2 Mb) has made YACs a vital tool in physical mapping
• A.tumefaciens carrying the disarmed Ti plasmid
3. Binary vector
• T-DNA does not need to be physically attached to the rest of the Ti plasmid
• Use separate plasmids to supply the disarmed T-DNA and the virulence functions
（2）Vir区（virolence region）
Vir区段上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗 传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现出毒性， 故称之为毒性区。Vir区段总长度大约35kb，由7个互
补群组成，分别命名为VirA、VirB、VirC、VirD、 VirE、VirG和VirH。
植物Ti质粒载体
（1）T-DNA区（transferred-DNA regions） T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒 上导入植物细胞的一段DNA。
➢T-DNA两端各有一段25bp的重复序列(LB, RB)。 T-DNA携带的致瘤基因是一些与激素合成有关的基 因，由于激素合成基因使细胞处于不停的分裂状态， 形成冠瘿瘤，不能进行细胞分化。 ➢Ti质粒改造后才能应用于植物的基因工程。 保留 T-DNA两端的末端序列，然后用外源DNA插入或直 接取代野生型T-DNA的部分基因，使转化的植物细 胞不具有成瘤能力。
• T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所 以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed) 后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列 插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB 至LB内的序列转移并整合到植物基因组。
• Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的， 毒性基因可以顺式及反式两种方式控制TDNA转移。
1、酵母人工染色体 （yeast artificial chromosome, YAC)
酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）
◆酵母人工染色体是另一类酵母穿梭载体。 具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌 和酵母菌中选择的标记基因。
◆ YAC可以接受100-1000 kb的外源DNA片段， 这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位 克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人 类人工染色体(human artificial chromosome， HAC)的研究。
1） Disarmed Ti vectors
wenku.baidu.com
• 去除T-DNA中 的肿瘤基因
• 在T-DNA中插 入用于转化植 株筛选的遗传 标记基因
pBR322
AmpR 25 bp 重复区
Opine 合成
25 bp 重复区
pGV3850
Vir
Intermediate vectors
• A small portion of T-DNA was subcloned in a conventional E.coli plasmid vector (i.e. pBR322) for easy manipulation, producing intermediate vectors
（1）双元载体(binary vectors） 如pBin19载体，具有原核生物的卡那霉素抗性基因
(AphⅠ)作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉素 抗性基因(nos-NptⅡ)作为植物的选择标记， pUC19的多克隆位点及α-互补显色标记 （2）共整合载体(integrated vectors)
Ti质粒的衍生载体
YAC的组成结构
（1）着丝粒区（CEN）
酵母染色体着丝粒区的保守序列: 由三个区组成
I
A
A
GTCACGTG
II 78-86bp
III
T TGTTTCTGNTTTCCGAAA
（2）端粒（TEL） 两个端粒序列Tel。 酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列。
（3）复制起点（ORI）
约100bp的自主复制序列（ARS）。 （真核生物中只有酵母菌有ARS）
Pnos Kan
Tnos
PcaMV GUS Tnos
pBI12（1 13kb）
Kanr
pAL4404 170kb
Vir
▪ The small plasmid can be used to inserted foreign gene ▪ When the two plasmids present together in the same