TEM制样-磷钨酸负染
脂质体及其在化妆品体系中的表征
脂质体的水合粒径表征，应根据具体的样品体系选择合适的表示方法
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41
包封率
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42
方法
原理
特点与适用范围
缺点
HPLC法
参照磷脂含量测定
适用范围广，
/
可同时用于磷脂含量和包封率测定
透析法
利用半透膜分子大小差别，通过及时更换 简单，稳定性好，可处理大量样品，
外相达到分离的目的
适合小粒径，稳定性好的脂质体
Eric Betzig
Stefan W. Hell 2014诺贝尔化学奖
W. E. Moerner
STORM 技术的开创者庄小威
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35
低分辨荧光显微镜和超高分辨荧光显微镜图片的对比
优点：突破光学极限的分辨率： 1nm 左右， 具有专属性，可作为通用的方法
局限性：外部资源少
北大工学院席鹏课题组 上海交大李小卫课题组
耗时较长，所耗介质较多
微柱离心法
凝胶柱层析 法
利用游离药物与含药脂质体的重力差异进 行分离，计算包封率
利用脂质体与游离药物分子质量和粒径大 小的差异进行分离
常规SEM
1. 将含有脂质体的样品滴在干净的硅片上面 2. 晾干或者烘干 3. 对其进行喷金处理（增强样品的导电性）
缺点局限性 1.脂质体干燥过程中会发生结构变化。 2. 对小颗粒分辨率不高。100nm左右。
1.只能看表面结构，不能区分脂质体和其它纳米颗粒 2.脂质体不导电，需要喷金处理。
AFM
1.把样品稀释为浓度1Wt%左右 2. 样品滴在云母片上 3. 放置待溶剂挥发干后进行测试
二、对于一些特例。比如低倍的Cyro-TEM或者切片法观测不到脂质体,不确 定是否稳定存在于体系中，可以尝试使用荧光法。该方法对样品纯度没有 要求。如果在共聚焦显微镜不能看到完整的脂质体形状，说明脂质体极大 可能已经被破坏，那么这样的脂质体在体系中发挥不了增溶的作用，已经 没有太大的实用价值。
电镜样品的基本制备技术之负染色技术
（二）直接取样法
对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、 水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱 疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支 持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。 此法主要用于临床快速诊断．
对于生长在固体培养基上的微生物， 可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释 成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。 对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采 用直接取样法。
负染色又称阴性反差染色，它是利用 高密度的、且在透射电镜下又显示结构的 重金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生 物标本包围起来、在黑暗的背景上显示出 呈现阴性反差样品的微细结构。所以负染 色所显示的电镜图像，正好与超薄切片正 染色相反，其样品结构为透明浅色，而背 底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色 的机制，目前还不够清楚。
负染色技术首先，由Ha11（1955）、 Hux1ey（1957）等人所采用，在后来的生 物学研究中得到了越来越广泛的应用。负 染色样品不需经过固定、脱水、包埋和超 薄切片等复杂操作，而是直接对沉降的样 品匀浆悬浮液进行染色。与超薄切片技术 相比，该技术具有操作简便、用药量极少、 省时快速及分辨力高等优点，现广泛用于 细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及 分离的细胞器等研究工作。
2．低渗释放法 从培养瓶中刮下所 培养的腺病毒或疱疹病毒，低速离心，弁 上清液，于沉淀物中加入培养液与蒸馏水 的混合液（比例为1：4），使细胞因低渗 破裂而释放出病毒，然后快速冻融数次， 再将冻融后的悬液低速离心，取其上清液 滴膜染色。
3．抗体 病毒凝集沉淀法 某些病毒 如鼻病毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒 及甲、乙型肝炎抗原等，可于相应的抗体 形成病ห้องสมุดไป่ตู้一抗体复合物，经离心沉淀而浓 缩，而后取浓缩的沉淀物滴膜染色，可找 到较多的病毒。目前这一技术已广泛用于 病毒疾病的快速诊断。
exosome翻译
外泌体，一类小的细胞外囊泡，通过作为转运和递送细胞之间的膜和细胞质分子的载体起到在各种生理和病理过程中的重要作用。
由于外来体广泛存在于各种体液中，并且携带其来源细胞的分子信息，因此它们被认为是潜在的非侵入性生物标志物。
尽管如此，方便和定量的外泌体分析方法的发展在技术上仍然具有挑战性。
在这里，我们提出了一种基于铜介导的信号放大策略的直接捕获和外来体快速检测的低成本检测方法。
该分析涉及三个步骤。
首先，通过胆固醇部分和脂质膜之间的疏水相互作用，通过胆固醇修饰的磁珠（MB）磁性捕获大量纳米囊泡。
其次，用适体修饰的氧化铜纳米颗粒（CuO NP）锚定具有特异性膜蛋白的外泌体的珠粒结合纳米囊泡以形成夹心复合物（MB-exosome-CuO NP）。
第三，通过酸解将得到的夹心复合物溶解以使CuO NP变成铜（II）离子（Cu 2+），其可以在聚（胸腺嘧啶）（聚T）存在下通过抗坏血酸钠还原为荧光铜纳米颗粒（CuNP）。
CuNPs的荧光发射随着Cu2 +浓度的增加而增加，这与外泌体浓度成正比。
我们的方法可以定量分析7.5×104至1.5×107个颗粒/μL范围内的外来体，生物样品中检测限为4.8×104个/μL。
总工作时间约2小时。
该检测方法可能成为生物样本中常规外泌体分析的简单且经济有效的方法。
胞外囊泡（EV）是包含来自封闭在脂质双层中的分泌细胞的胞质溶胶的膜囊泡。
它们可以在各种体液中检测到，包括血液，尿液，唾液，母乳，羊水等。
在20世纪80年代，约翰斯通将内源性小EV（30-150 nm）定义为外来体，由于它们携带着丰富的分子信息，包括RNAs （信使RNAs和microRNAs），DNA片段，蛋白质等，因此外泌体吸引了人们的注意。
和他们的亲本细胞的脂质。
因此，外泌体提供了一种方便的方法来监测和分析亲代肿瘤细胞的状态而不需要活检。
此外，越来越多的证据表明外泌体的脱落与肿瘤抗原和抗肿瘤免疫反应相关，信号在免疫系统中，因此对于癌症诊断具有潜在的应用价值.6-8 Melo et al。
电镜样品的基本制备技术之负染色技术
（三）样品的纯度和浓度
样品的纯度和浓度对负染均有明显影响，如 果负染样品含杂质太多（如大量的细胞碎片、培 养基残渣及盐类结晶等），会对负染色效果产生 干扰，因此，样品在负染前要适当纯化。此外， 悬液中的样品浓度要适当，浓度太稀时，会造成 电镜下找不到样品或寻找困难；样品太浓时，会 造成样品堆积而影响观察。因此，要求滴样时应 做各种稀释度的对比观察。
（二）直接取样法
对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、 水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱 疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支 持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。 此法主要用于临床快速诊断．
对于生长在固体培养基上的微生物， 可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释 成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。 对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采 用直接取样法。
负染色又称阴性反差染色，它是利用 高密度的、且在透射电镜下又显示结构的 重金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生 物标本包围起来、在黑暗的背景上显示出 呈现阴性反差样品的微细结构。所以负染 色所显示的电镜图像，正好与超薄切片正 染色相反，其样品结构为透明浅色，而背 底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色 的机制，目前还不够清楚。
１N的氢氧化钠或氢氧化钾将pH值调到 6.4－7.0。醋酸铀则用0.2～0.5％水液．pH 为4.5～5.5，染液在用前新鲜配制，盐溶解 需20～30分钟。钼酸铵配制成2～3％溶液， 使用时用醋酸铵将pH调至7.0～7.4之间。
作为负染色剂的条件： （l）具有较高的电子密度和较强的电子 散射能力； （2）耐受电子束的轰击、在电子束照射 下不升华； （3）在电镜下不呈现染色剂本身的结构； （4）化学稳定性好，不析出沉淀，与样 品不发生化学反应，易在不规则样品表面 渗透。
水解法制备纳米二氧化硅和表征_庞久寅
一般来讲， 制备纳米二氧化硅主要有气相法 和水解法两种办法。气相法的主要特点是产品表 面整洁、纯度高、成本高， 而水解法无须特殊仪器 设备， 容易操作［１￣３］。
用氨作为原硅酸四乙酯（ ＴＥＯＳ） 的水解催化 剂可制备小粒径的 ＳｉＯ２ 粒子， 但反应条件较高、 难以控制， 有很大的局限性。我们在乙醇的氨水 溶液中 不 断 滴 加 ＴＥＯＳ， 通 过 调 整 介 质 ｐＨ、加 料 和搅拌速度等制备了不同粒径的二氧化硅。用 ＴＥＭ、动态光散射、红外和电子能谱分析， 对制得 的纳 米 二 氧 化 硅 颗 粒 组 成 、粒 径 大 小 、规 整 度 及 分布均匀性等进行表征 。 ［４￣６］
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ Ｔｈｅ ｐａｐｅｒ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ａｌｋａｌｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ＴＥＯＳ， ｔｈｅ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｎｏ－ｓｉｌｉｃａ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｐＨ、ｄｒｉｐｐｉｎｇ ｒａｔｅ、ａｇｉｔａｔｉｎｇ ｒａｔｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ＴＥＯＳ ａｎｄ ｅｔｈａｎｏｌ， ｗｅ ｃａｎ ａｃｑｕｉｒｅ ｔｈｅ ｎａｎｏ－ｓｉｌｉｃａ ｗｈｏｓｅ ｓｉｚｅ ｉｓ ｂｅｌｏｗ １００ｎｍ． Ａｎｄ ｄｉｓｃｕｓｓ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｎａｎｏ－ｓｉｌｉｃａ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ， ａｎｄ ａｃｑｕｉｒｅ ｔｈｅ ４０ｎｍ ｎａｎｏ－ｍａｔｅｒｉａｌ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ． Ｗｅ ｃａｎ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｌｉｃａ ｂｙ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｄ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｃｏｓｍｉｃ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｌｉｃａ， ａｔ ｌａｓｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ａｐｐｏｓｉｔｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｌｉｃａ． Ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉ ａｎｄ ｏｘｙｇｅｎ ｉｓ １：２ ｂｙ ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｅｎｅｒｇｙ ｍｅａ－ ｓｕｒｅｍｅｎｔ．
tem负染操作流程
tem负染操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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水解法制备纳米二氧化硅和表征_庞久寅
摘 要 通过 ＴＥＯＳ 在碱性条件下水解生成纳米二氧化硅。通过控制 ｐＨ、滴加速度、搅拌速度以及 ＴＥＯＳ 与乙 醇的配比， 得到小于 １００ｎｍ 的二氧化硅， 通过控制以上条件得到了粒径 ４０ｎｍ 的纳米材料。用红外光谱分析所 得二氧化硅的官能团结构、ＴＥＭ 观察到二氧化硅的微观形态， 通过电子能谱测定了硅和氧的比例为 １∶２。 关键词 纳米二氧化硅； 制备； 表征； ＴＥＭ； 水解
在 带 电 磁 搅 拌 的 锥 型 瓶 中 加 入 ５０ｇ 无 水 乙 醇、１～５ｇ 氨水， 然后用不同配比的乙醇 ＴＥＯＳ 溶 液从恒流泵中滴加到锥型瓶中， 控制滴加速度 ０．０２５～０．１５ｍｌ／ｍｉｎ 和搅拌转速 ５０～４００ｒ／ｍｉｎ， 使 ＴＥＯＳ 水解生成纳米二氧化硅。用动态光散射法、 ＴＥＭ 测定其粒径大小。然后将含有纳米二氧化硅 的醇溶液在真空烘箱内干燥， 分离最后得到固态 纳米二氧化硅。实验的基本条件为 ｐＨ 值 ８．２、搅 拌速度为 ５０ｒ／ｍｉｎ、滴加速度为 ０．０２５ｍｌ／ｍｉｎ、滴加 时间为 ４００ｍｉｎ。 １．３ 纳米二氧化硅的表征
２ 结果与讨论
２．１ 反应条件对纳米二氧化硅制备的影响
ｐＨ 值
图 １ ｐＨ 值对粒子大小的影响 对纳米粒子大小生成具有决定性作用的是
ｐＨ 值、搅拌速度和滴加速率等因素， 实验结果如 图 １、图 ２、图 ３ 所示。图 １ 为 ｐＨ 值对粒径变化的 影响， 实验结果表明， 随着 ｐＨ 值的持续升高， 粒 径呈现单调增长的趋势。
图 ６ｂ。 ２．４ 元素分析
通过图 ７ 可以看出， 通过对二氧化硅粉末的 ＸＰＳ 测定可以看出图中只有硅和氧的吸收峰， 且 两 者 的 面 积 比 为 １ ∶２， 因 而 断 定 其 分 子 式 为 ＳｉＯ２。
负染色技术
负染色技术负染色又称阴性染色，是相对于普通染色(称正染色)而言的。
负染色首先由Hall在1955年提出。
Hall在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的"空洞"被清楚地显示出来。
在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。
而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。
而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)"包埋"低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像"透明"地光亮。
两者之间的反差正好相反，故称为负染色。
对于负染色的机制目前还不十分了解。
对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术与超薄切片方法相比具有分辨率高(可达15Å)，简单快速等优点。
因此，在生物学研究中得到越来越广泛的应用。
它可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、大小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中，负染色技术成为不可取代的实验技术。
[编辑]负染色液的制备用作负染色的负染色剂应具有：较强的电子散射能力以产生足够的图像反差；熔点高，在电子束的轰击下不会升华；溶解度大，不易析出沉淀；在电镜下不呈现出可观察到的结构；分子小，容易渗入不规则表面的凹陷处；与样品不起化学反应等。
目前最常用的负染液是磷钨酸、磷钨酸钾和磷钨酸钠(分别简称为PTA、KPT、NaPT)。
此外醋酸铀、甲酸铀、硅钨酸、钼酸铵等也常作负染色剂用。
它们的配制方法如下：磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液配制成1％～3％的溶液，使用时应用1 mol／L氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至6.4～7.0或实验所需的值。
醋酸铀：通常使用双蒸水配制成0.2％～0.5％水溶液(pH4.5)。
醋酸铀染色液应是新鲜的，最好使用前配制。
醋酸铀溶解需15～30分钟，在黑暗中能稳定几小时，使用前用1mol／L的氢氧化钠溶液将pH值调至4.5。
tem测试染色原理
TEM测试染色原理
透射电子显微镜（TEM）是一种高分辨率、高放大倍数的显微镜，能够观察样品的超微结构。
在TEM测试中，为了提高图像的衬度和清晰度，常常需要对样品进行染色。
染色原理主要基于电子散射能力和透射电子的成像信号。
首先，当电子束投射到样品上时，会与样品中的原子发生碰撞，产生立体角散射。
由于不同成分对电子的透过率不同，因此透射电子的强度和方向会发生变化，形成明暗不同的影像。
为了提高特定成分的散射能力，以便在图像中更好地显现，我们会使用重金属离子对样品进行染色。
这些重金属离子会与样品中的功能基团结合，增强其对电子的散射能力，从而提高该组分在图像中的衬度。
在实际操作中，常用的染色方法有负染、正染、金属染色等。
负染是指用重金属盐对样品进行染色，使其对电子的散射能力增强，从而在图像中呈暗色。
正染则是用重金属盐对样品进行染色，使其对电子的散射能力减弱，从而在图像中呈亮色。
金属染色则是利用金属元素对样品进行染色，以达到提高衬度的目的。
通过染色，我们可以更好地观察样品的内部结构和化学成分分布，从而对样品进行更深入的分析和研究。
但需要注意的是，染色会对样品造成一定的破坏，因此在进行TEM测试时需要谨慎选择染色方案，以避免对样品的结构造成过大的影响。
总的来说，TEM测试染色原理是基于电子散射能力和透射电子的成像信号，通过染色提高图像的衬度和清晰度，以便更好地观察样品的超微结构和化学成分分布。
透射电镜样品制备-生物技术
半薄切片定位：
目的：定位、筛选、比较研究 （0.5～2.0μm）
半薄切片染色程序： 1．捞片 2．展片干燥 3．染色（甲苯胺蓝） 4．水洗、(透明、封固)
（2）超薄切片：
超薄切片机
厚度的辨认：
体视学显微镜下观察干涉色
暗灰色：＜400Å
灰 色：400～500Å
银 色：500～700Å
金 色：700～900Å
（2）锇酸（又称四氧化锇。OSO4, ）
1） 1%锇酸固定液的配制：（见书） 2）固定原理及优缺点
a、经典的固定剂。对蛋白质和脂质亲和力强。 b、有强烈的电子染色作用。 c、渗透较慢，0.25～0.5mm/h左右。常用作后固定。 d、对糖类和核酸保存很差，不保存酶活性。 e、固定时间不宜超过2小时。 f、提前配置，应低温、密封、避光保存。
② 包埋与固化： 组织块用牙签挑入包埋管中，注满包埋液，置温箱
中 固 化 。 37℃ 、 12 小 时 后 ， 移 入 45℃ ， 24 小 时 ， 60℃，24小时。
（4）包埋操作中的注意事项：
调整a液、b液的比例。
a. 器材和试剂均应注意防潮。（干燥器、烤箱） b. 配制包埋液时，防止气泡产生。
【2】常用固定剂的特点
（1）戊二醛（Glutraldehyde） 1）2.5%戊二醛固定液的配制（见书） 2）固定原理及优缺点
a、戊二醛对于蛋白质、多糖、核酸以及细胞内微管、滑面内质 网、纺缍丝、胞饮小泡和细胞基质固定良好。 b、穿透力强，可达4mm/h，常用作前固定。 c、固定后可在4℃冰箱长时间保存（数周～数月）。 d、对酶的活性保存较好，适用于电镜细胞化学研究。 e、对脂肪不起固定作用。 f、无“电子染色”作用。 g、不稳定、易氧化。
猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化及鉴定
猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化及鉴定WANG Xi;LI Guopan;CHEN Qingqing;XU Baojuan;RONG Jun【摘要】为获得较高纯度的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2) Cap蛋白的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)并对其进行结构和功能研究,本试验以大肠杆菌表达系统表达了PCV2重组Cap (PCV2 rCap)蛋白,通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析、Capto Q离子交换层析、CsCl密度梯度离心等方法对其进行了纯化.通过Western blotting对纯化所得蛋白进行免疫反应性鉴定,透射电镜(TEM)观察纯化蛋白的粒径及形态,高效液相尺寸排阻色谱(HPSEC)检测其组分分布.结果显示,纯化后PCV2 rCap蛋白经SDS-PAGE检测,可见28 ku的目的蛋白带,灰度扫描法检测其纯度为97.53％.Western blotting结果显示,该处的特异性蛋白条带有明显的免疫反应性;TEM检测其为粒径17.35～19.24 nm的规则球形颗粒,表明所获得的PCV2 rCap蛋白在表达时能在菌体内自我装配成VLPs,且在纯化过程中没有被破坏而解聚,仍保持天然状态;HPSEC检测纯化样品中VILPs含量为92.67％.本试验结果为进一步研究PCV2 VLPs的空间结构及其免疫保护机制提供了参考依据.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2019(046)006【总页数】9页(P1792-1800)【关键词】猪圆环病毒2型(PCV2);病毒样颗粒(VLPs);纯化;鉴定;凝胶过滤层析;离子交换层析【作者】WANG Xi;LI Guopan;CHEN Qingqing;XU Baojuan;RONG Jun【作者单位】;;;;【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪圆环病毒2型(PCV2)属于单股负链环状DNA病毒，无囊膜[1]，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原体，对不同阶段的猪均可造成感染[2]，给全球养猪业造成了极大的经济损失[3]。
负染色技术
负染色技术负染色又称阴性染色，是相对于普通染色(称正染色)而言的。
负染色首先由Hall在1955年提出。
Hall在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的"空洞"被清楚地显示出来。
在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。
而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。
而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)"包埋"低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像"透明"地光亮。
两者之间的反差正好相反，故称为负染色。
对于负染色的机制目前还不十分了解。
对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术与超薄切片方法相比具有分辨率高(可达15Å)，简单快速等优点。
因此，在生物学研究中得到越来越广泛的应用。
它可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、大小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中，负染色技术成为不可取代的实验技术。
[编辑]负染色液的制备用作负染色的负染色剂应具有：较强的电子散射能力以产生足够的图像反差；熔点高，在电子束的轰击下不会升华；溶解度大，不易析出沉淀；在电镜下不呈现出可观察到的结构；分子小，容易渗入不规则表面的凹陷处；与样品不起化学反应等。
目前最常用的负染液是磷钨酸、磷钨酸钾和磷钨酸钠(分别简称为PTA、KPT、NaPT)。
此外醋酸铀、甲酸铀、硅钨酸、钼酸铵等也常作负染色剂用。
它们的配制方法如下：磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液配制成1％～3％的溶液，使用时应用1 mol／L氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至6.4～7.0或实验所需的值。
醋酸铀：通常使用双蒸水配制成0.2％～0.5％水溶液(pH4.5)。
醋酸铀染色液应是新鲜的，最好使用前配制。
醋酸铀溶解需15～30分钟，在黑暗中能稳定几小时，使用前用1mol／L的氢氧化钠溶液将pH值调至4.5。
磷钨酸染色剂配制方法
磷钨酸染色剂配制方法
磷钨酸染色剂是常用的原生质染色剂，用于显微镜下观察细胞核和细胞器。
以下是一种简单的磷钨酸染色剂配制方法：
材料：
- 磷钨酸(一水合物)：2克
- 酒精：100毫升
- 蒸馏水：100毫升
步骤：
1. 取2克磷钨酸加入50毫升蒸馏水中，搅拌溶解。
2. 加入50毫升酒精，继续搅拌混合。
3. 加入另外50毫升蒸馏水，搅拌均匀。
4. 过滤液体，储存于密封瓶中。
使用方法：
1. 取少量细胞悬液放入载玻片上。
2. 吸去多余液体，滴加适量磷钨酸染色剂。
3. 在温暖的干燥室中等待10-15分钟。
4. 游离染色剂用蒸馏水冲洗，待载玻片干燥后在显微镜下观察。
注意事项：
- 磷钨酸染色剂易挥发，使用后应及时封闭瓶口。
- 储存时可以放置在冰箱中，能够延长其使用寿命。
- 染色时间和浓度可根据需要进行调整。
- 1 -。
TEM测试流程
TEM测试流程
1.配制磷钨酸的浓度为2%，此时Ph大约为1~2
2.配制NaOH的浓度为2%
3.将两者中和得到的磷钨酸Ph大约为6~7（十毫升磷钨酸大约需要十五滴左右
的NaOH），此即为染色液
4.将PUD稀释到固含大约为0.05~0.08%之间并使稀释液混合均匀（40%固含
就稀释大约500~800倍）
5.取3~5滴配制好的磷钨酸与稀释后的PUD进行等体积混合均匀，震荡大约
一分钟后即可进行染色
6.在紫外灯光下先滴一滴混合液到铜网上，放置一段时间后其会慢慢变干
（5~10分钟），然后在铜网另外一面也滴一滴混合液并让之干燥（在这个过程中千万要防止混合液顺着缝隙吸附到镊子上面去了），染色即告完成
7.在进行电镜观察的时候先在小倍数的情况下看个整体的染色状况，寻找合适
的孔进行观察拍照。
8.先进行宏观拍照此时标准是200nm（放大倍数一般在4800~9300之间），然
后进行微观拍照此时标准是0.5µm（放大倍数一般在13000~22000之间），这个过程中不论是宏观还是微观最好在确定了放大倍数后就不要改变以进行对比，因此最好从粒径小的开始。
TEM制样-磷钨酸负染
磷钨酸用水或磷酸缓冲液配制成1％左右的溶液，用滴管一滴染色液在制好样品的铜网上，1～2分钟后，用剪成尖角的滤纸吸去染色液。
再滴一滴纯水在铜网上，用滤纸吸去，反复两三次，这样是为了洗去多余的磷钨酸，然后静置干燥。
然后就可以用电镜观察了。
磷钨酸中的重原子相对于有机分子中的碳氢氧氮等轻原子来说，更能阻挡（散射）电子。
所以，有磷钨酸吸附（或沉积）的地方在TEM 照片中看起来更黑，而有机物占据的地方看起来更亮。
之所以叫“负染色”，就是因为被染“黑”的是背景和外轮廓，真正感兴趣的样品部分是“白”的。
也就是说，典型的经过负染色的样品是表现为黑背景中的白区。
一般有机物并不与磷钨酸发生反应，磷钨酸只是沉积在有机物周围形成“背景”或“轮廓”。
但是不是所有的磷钨酸染色都是负染色。
有一些羟基和酰胺类会与磷钨酸作用，出现正染色的效果，即有些含有这些基团的有机物在TEM下看起来被染“黑”，最典型的是尼龙。
另外，有时候不成功的负染色，看到的结果也是“白底黑点”，其实虽然是做了染色的操作，但可能由于方法不对，或者样品本身的性质不适用负染色，结果跟没染是一样的。
如果有机颗粒足够大，不染色时就能看到“白底黑点”。
另一方面，如果染色很弱，一般只是给有机颗粒镶上一个轮廓，如果染色剂量很大，则会出现很黑的“背景”。
因此，对于很小的有机颗粒，如果染色很弱，只是一个轮廓圈，电镜放大倍数不够的时候，看起来就是一个小黑点了。
就好像一个纸上画一个空心圈，站远了看也可能
成一个小黑点。
如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！。
透射电镜负染色技术常见影响因素与对策
透射电镜负染色技术常见影响因素与对策刘湘花;张彩丽;张俊霞;卢小康;李瑞琴【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2016(032)010【总页数】2页(P1185-1186)【关键词】透射电镜;负染色;影响因素;对策【作者】刘湘花;张彩丽;张俊霞;卢小康;李瑞琴【作者单位】河南中医学院病理实验中心,郑州450046;河南中医学院病理实验中心,郑州450046;河南中医学院病理实验中心,郑州450046;河南中医学院病理实验中心,郑州450046;河南中医学院病理实验中心,郑州450046【正文语种】中文【中图分类】R-331负染色技术又称阴性反差染色，简称负染。
它是由HaLL和Huxley首先采用的一种应用于生物大分子研究的染色技术。
与传统染色不同的是，样品进行负染色时，由于其与染液之间不发生反应，故样品本身并不着色。
利用样品与染色剂密度的悬殊对比，在电子致密的黑色背景中能反衬出低电子密度的白色样品，形成负反差，故称负染色[1]。
负染色技术的样品无需经固定、脱水、包埋和超薄切片等复杂操作，而是将样品制备成具有一定密度的悬浮液，然后将其分散在具有支持膜的铜网上，最后用负染色液染色来增加反差，即可进行电镜观察；该技术具有操作简单、快速方便，可较好的保存样品结构，使被染样品反差适中、分辨率高，且样品和染液需用量少等优点，因此被广泛用于细菌、病毒、大分子、亚细胞碎片、分离的细胞器及蛋白质晶体等样品[2-6]的分析，是一项十分重要的实验技术。
影响样品负染色的因素很多，如样品浓度、染液浓度和pH值、染色时间和温度、支持膜性质、染色时机、样品观察时机等因素均可以对负染色的效果产生影响。
本文主要探讨影响负染色的因素与对策，现报道如下。
负染色技术要求观察的样品必须制备成具有一定浓度的悬浮液。
有些样品悬浮液的浓度过高，且样品本身凝聚性较强，如蛋白质等，可以使用分散剂(牛血清白蛋白、杆菌肽粉末、甘油甘二醇等)防止样品凝聚。
TEM样品前处理设备——亲水化处理仪辉光放电仪原理及应用
ApplicationTEM样品前处理设备——亲水化处理仪（辉光放电仪）原理及应用辉光放电一般是指低气压放电现象,工作压力一般都低于10 mbar,其基本构造是在封闭的容器内放置两个平行的电极板,利用产生的电子将中性原子或分子激发,而被激发的粒子由激发态降回基态时会以光的形式释放出能量。
在激发状态下构成分子的原子获得足够大的的动能，开始彼此分离，原子的外层电子摆脱原子核的束缚成为自由电子，失去电子的原子变成正离子。
这一过程叫电离，形成的等离子体是一种电离气体，是离子、电子和高能原子等的集合体;正离子和电子总是成对的出现，总数大致相等，整体呈准电中性，它是一种由带电粒子组成的电离状态，称为物质的第四态-等离子态。
等离子表面处理是一种新的技术，可以实现很多功能，例如超洁净清洗、表面能改善、表面活化、刻蚀、涂覆等。
TEM样品前处理设备亲水化处理仪或者称为辉光放电仪就是利用这一技术实现对TEM碳膜进行表面改性，以获取更佳的制样效果。
但是不同厂家不同机型可实现的模式和功能并不完全一致，但总的来说有如下几类：1、表面超洁净清洁原理：就反应机理来看，等离子体清洗通常包括以下过程：无机气体被激发为等离子态；气相物质被吸附在固体表面；被吸附基团与固体表面分子反应生成产物分子；产物分子解析形成气相；反应残余物脱离表面。
在使用空气作为工作气体的情况下，氧气被激发到离子态，有很强的氧化性，可将样品表面常见的有机分子、油脂分子的污染物清洗干净。
效果：经过处理的样品表面会表现出材料本身应有的、均一的亲疏水性能。
而且通常情况下有机分子、油脂等污染物都是强疏水材料，所以超净清洁后样品表面一般会变的更为亲水。
2、短期亲水处理原理：这一过程事实上是和超净清洗同时进行的。
在用的是空气进行等离子处理时，辉光放电将氧气变成等离子态，中性的氧气的变成带电粒子（有正电荷，也有负电荷），这些高能粒子轰击物体表面，会暂时使得样品表面富集负电荷从而提高样品表面能，这就改变物体表面的性质。
原儿茶酸对人血清白蛋白淀粉样纤维化的抑制作用
收稿日期:2019-05-07 修回日期:2019-06-13基金项目:国家自然科学基金(N o .31460422);江西省自然科学基金(N o .20171B A B 204029);食品科学与技术国家重点实验室课题(N o .S K L F -Z Z B -201914,S K L F -Z Z A -201912) *通讯作者:张国文,男,博士,教授,博士研究生导师,主要研究方向:食品化学与分析㊂E -m a i l :g w z h a n g@n c u .e d u .c n 第36卷第2期V o l .36 N o .2分析科学学报J O U R N A LO FA N A L Y T I C A LS C I E N C E 2020年4月A pr .2020D O I :10.13526/j .i s s n .1006-6144.2020.02.002原儿茶酸对人血清白蛋白淀粉样纤维化的抑制作用王 瑞,朱文清,郑 洁,张国文*(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌330047)摘 要:以人血清白蛋白为模型,研究了原儿茶酸对蛋白质淀粉样纤维化的抑制作用及抑制机制㊂采用硫黄素T 测定蛋白纤维化过程,结果表明原儿茶酸对蛋白质纤维化的抑制呈现浓度依赖性,当原儿茶酸浓度为250μm o l ㊃L -1和500μm o l ㊃L -1时,其抑制率分别达到了42.5%和59.5%㊂透射电镜直观地显示出原儿茶酸对蛋白质纤维化的抑制作用㊂8-苯氨基-1-萘磺酸荧光光谱和圆二色谱分析结果显示,原儿茶酸能够显著地减少纤维化蛋白表面疏水性氨基酸残基的暴露,稳定蛋白质的α螺旋结构㊂分子模拟结果表明,氢键和疏水作用力驱动原儿茶酸与人血清白蛋白的相互作用,并与赖氨酸残基特异性结合以维持蛋白质构象的稳定,从而达到抑制蛋白纤维化的效果㊂关键词:原儿茶酸;人血清白蛋白;纤维化;抑制作用;分子模拟中图分类号:O 657.3 文献标识码:A 文章编号:1006-6144(2020)02-166-05许多蛋白质或多肽在一些内部(氨基酸序列变异㊁氧化应激),或者外部(极端p H ㊁高温)因素的共同作用下,会发生错误折叠和聚集,从而形成不溶性淀粉样纤维㊂这些蛋白纤维会在体内不断沉积,产生细胞毒性,对机体器官造成破坏和损伤,从而诱导帕金森氏症㊁阿尔茨海默病以及Ⅱ型糖尿病等疾病的发生[1]㊂原儿茶酸(P r o t o c a t e c h u i cA c i d ,P A )作为一种酚酸类化合物,广泛存在于蔬菜和水果中,也是很多天然中草药的有效成分,具有抗氧化㊁抗肿瘤㊁抗血糖㊁消炎㊁保护神经等多种药理学作用[2]㊂研究发现,酚酸类化合物咖啡酸[3]㊁迷迭香酸[4],以及黄酮化合物根皮素[5]㊁黄芩素[6]等均能显著抑制蛋白淀粉样纤维的形成㊂紫衫木素通过与蛋白质的氨基酸如赖氨酸(L y s )残基发生结合[7],阻碍A β42蛋白的聚集,抑制了蛋白纤维化的生成㊂然而,关于原儿茶酸对蛋白质淀粉样纤维化的抑制及可能的抑制机制目前仍不清楚㊂本文以人血清白蛋白(H S A )为蛋白模型,采用荧光光谱㊁圆二色谱(C D ),结合透射电子显微镜(T E M )和分子模拟技术,研究了原儿茶酸对蛋白质淀粉样纤维化的抑制作用及抑制机制,以期为天然酚酸化合物在食品工业中的应用和药物开发提供理论基础㊂1 实验部分1.1 主要仪器与试剂F -7000型荧光光度计(日本,日立公司);MO S -450型圆二色谱仪(法国,B i o -L o g i c 公司);J E M -2100型透射电子显微镜(日本,电子光学公司);B S A 224S 型电子天平(德国,赛多利斯公司)㊂H S A (纯度ȡ96%,北京索莱宝科技有限公司);分别称取一定量原儿茶酸(P A ,纯度ȡ97%,上海阿拉丁有限公司)㊁硫黄素T (T h T ,纯度75%,上海源叶生物科技公司)和8-苯氨基-1-萘磺酸(A N S ,纯度96%,上海阿拉丁有限公司)用无水乙醇溶解,配制成浓度为2.0ˑ10-2㊁2.0ˑ10-2和1.0ˑ10-4m o l ㊃L -1的储备溶液,于4ħ冰箱中避光保存;其它试剂均为分析纯㊂实验用水为M i l l i p o r eS i m p l i c i t y 水纯化系统661第2期分析科学学报第36卷(法国密理博公司)制备的超纯水㊂1.2 实验方法1.2.1 H S A 淀粉样纤维化的制备 称取适量的H S A 溶解于p H=7.4的T r i s -H C l 缓冲溶液(0.05m o l ㊃L -1)中,配制成浓度为50μm o l ㊃L -1的蛋白溶液,放置在4ħ的冰箱中过夜以充分溶解㊂取不同体积的原儿茶酸储备液加入到H S A 蛋白溶液中,原儿茶酸的终浓度分别为250μm o l ㊃L -1和500μm o l ㊃L -1㊂将上述溶液充分混匀后,置于65ħ的恒温水浴锅中孵育,分别在1㊁2㊁4㊁8㊁12㊁24㊁36㊁48㊁60㊁72㊁84㊁96㊁108㊁120h 时取样,待测㊂1.2.2 T h T 荧光光谱测定 向2m L 不同时间段取出的H S A 样品溶液中加入5μLT h T 储备溶液,充分振荡摇匀后,置于暗处反应30m i n ,将反应后的试液倒入荧光池中,在440n m 的激发波长下,测定450~650n m 范围内的荧光光谱,激发和发射的狭缝宽度均为2.5n m ㊂1.2.3 A N S 荧光光谱测定 将孵育后的H S A 样品用缓冲溶液稀释至5.0μm o l ㊃L -1后,加入一定体积的A N S 储备溶液,保证A N S 与蛋白的浓度比为10ʒ1,避光反应30m i n 后,测定A N S 荧光光谱㊂激发波长设定为380n m ,扫描范围为400~600n m ,激发和发射的狭缝宽度均为2.5n m ㊂1.2.4 C D 测定 采用C D 仪测定H S A 溶液孵育前后二级结构的变化㊂在室温条件下,将稀释的蛋白溶液(5.0μm o l ㊃L -1)加入到石英比色皿中进行测定,波长扫描范围为190~250n m ,每组样品测量3次,通过扣除缓冲溶液的背景光谱来校正所测得的C D 光谱㊂1.2.5 T E M 测定 将孵化前后的H S A 溶液用缓冲液稀释到5.0μm o l ㊃L -1,轻微振荡后使其分散均匀,取20μL 稀释后的H S A 溶液滴于带有碳支撑膜的铜网上,静置蒸发干燥后,滴加1%磷钨酸负染5m i n,用滤纸吸去多余的磷钨酸,于37ħ干燥箱中过夜㊂采用T E M 观察蛋白纤维化程度㊂1.2.6 分子模拟 使用A u t o D o c k4.2和MG L T o o l s 1.5.6软件模拟原儿茶酸与H S A 的结合模式㊂配体分子原儿茶酸的3D 结构通过C h e m 3D U l t r a 8.0软件构建,并进行能量最小优化㊂H S A 的晶体结构从P r o t e i nD a t aB a n k 网站下载(1h 9z ),除去H S A 的水分子,并将极性氢原子加入到H S A 中㊂将处理好的原儿茶酸与H S A 进行分子对接,并应用L a m a r c k i a n 遗传算法完成对接计算,对接次数为100次,运行结束后,形成一系列的能量簇,根据能量最优原则选择最合适的对接模型进行结果分析㊂图1 (A )不同浓度原儿茶酸存在下H S A 淀粉样蛋白聚集的T h T 荧光动力学;(B )65ħ孵育120h 后H S A 纤维化的T h T 荧光光谱F i g .1 (A )T h Tf l u o r e s c e n c e k i n e t i c s o fH S Ai n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f d i f f e r e n c e c o n c e n t r a t i o n s o fP A ;(B )T h T f l u o r e s c e n c e s pe c t r a o fH S Af i b r i l l a t i o na f t e r i n c u b a t i o na t 65ħo v e r 120h i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o fP A 2 结果与讨论2.1 原儿茶酸对H S A 淀粉样纤维聚集的抑制T h T 作为一种阴离子荧光染料,能够与淀粉样纤维的β片层结构特异性结合,在440n m 波长激发条件下产生荧光,T h T 荧光值的大小常被用作评估蛋白淀粉样纤维程度的指标[8]㊂如图1(A )所示,不同于大多数蛋白质纤维化过程呈现出的核依赖聚集模型,H S A 的纤维化过程不包括成核期[9],直接形成原纤维并结合捆绑形成成熟的淀粉样纤维(生长期,0~84h ),当体系中所有的蛋白质单体均转化为成熟淀粉样纤维后,T h T 的荧光强度趋于稳定(稳定期,84~120h ),孵化120h 后的T h T 荧光强度为304.8(图1(B )曲线1)㊂加入不同浓度的原儿茶酸与H S A 孵化后可明显降低蛋白淀粉样纤维的生成量,当原儿茶酸的浓度为250μm o l ㊃L -1和500μm o l ㊃L -1时,T h T 荧光强度分别降低至174和122.7(图1(B )曲线2㊁3),761第2期王瑞等:原儿茶酸对人血清白蛋白淀粉样纤维化的抑制作用第36卷对H S A淀粉样纤维形成的抑制率分别达到了42.5%和59.5%㊂该结果初步证明了原儿茶酸对蛋白质淀粉样纤维的形成有良好的抑制作用,且呈现出浓度依赖性㊂2.2原儿茶酸对H S A淀粉样纤维表面疏水性的影响研究表明,蛋白质在不断聚集形成纤维化的过程中,常伴随着蛋白质结构的部分解折叠,诱导蛋白质内部疏水性氨基酸的暴露[10]㊂A N S作为一种典型的疏水性探针,本身荧光强度较弱,当其作用于蛋白质的疏水性氨基酸,其荧光强度会显著增强[11]㊂如图2所示,25ħ下H S A-A N S体系荧光强度较低(119.3,曲线1),说明常温下H S A内部疏水性氨基酸不会暴露出来,而在65ħ孵化120h后的H S A-A N S体系荧光强度明显升高(651.9,曲线2),并伴随着显著的蓝移(486n mң479n m),表明孵化后的H S A表面暴露出较多的疏水性氨基酸残基㊂当在整个蛋白质孵化体系(65ħ,120h)中加入浓度为250和500μm o l㊃L-1的原儿茶酸后,反应体系的荧光强度为374.4(曲线3)和264(曲线4),分别降低了42.6%和59.5%㊂该结果表明原儿茶酸诱导了H S A多肽链的收缩,从而即便在较高温度下(65ħ)也能维持蛋白质正常的结构稳定性㊂有文献报道,小分子与蛋白质的非共价结合能够稳定淀粉样纤维蛋白的核心结构[12],因此,我们推测原儿茶酸可能与H S A的氨基酸残基发生非共价结合而抑制了H S A纤维的形成㊂2.3原儿茶酸对H S A二级结构的影响研究表明,在正常蛋白向成熟的淀粉样纤维变化过程中,伴随着蛋白质二级结构中α-螺旋向β-折叠的转变[13]㊂图3显示未经孵化的H S A在208n m和222n m处有两个明显的特征吸收峰,表明在H S A 结构中α-螺旋占主导地位㊂当H S A在65ħ下孵化120h后,H S A在222n m处的吸收峰消失,强度减弱,表明H S A的二级结构由α-螺旋向β-折叠转变[14]㊂当向上述孵化的H S A溶液中加入原儿茶酸后, H S A的C D光谱椭圆度逐渐恢复,且呈现浓度依赖关系,表明原儿茶酸的加入能够阻止蛋白质二级结构由α-螺旋向β-折叠转变,原儿茶酸通过稳定蛋白质的α-螺旋结构而发挥其抑制淀粉样纤维作用[14]㊂图2不同浓度原儿茶酸在65ħ下孵化120h后对H S A表面疏水性的影响F i g.2E f f e c to fd i f f e r e n c ec o n c e n t r a t i o n so fP Ao n t h e s u r f a c eh y d r o p h o b i c i t y o fH S Aa f t e r i n c u b a t i o na t 65ħf o r120hc u r v e s1-4:1.H S Aa t25ħ(5.0μm o l㊃L-1);2.H S Aa t65ħ(5.0μm o l㊃L-1)f o r120h;3.H S A+P A(250μm o l㊃L-1)a t 65ħf o r120h;4.H S A+P A(500μm o l㊃L-1)a t65ħf o r120h .图3不同浓度原儿茶酸在65ħ下孵化120h后对H S A二级结构的影响F i g.3E f f e c t s o f d i f f e r e n c e c o n c e n t r a t i o n s o fP Ao n t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e o fH S Aa f t e r i n c u b a t i o na t65ħf o r 120h采用在线的D i c h r o w e b软件分析[15]得到H S A的二级结构含量(表1)㊂由表可以看出,孵化后的H S A中α-螺旋含量明显降低(46.9%ң37.9%),β-折叠含量显著增大(2.1%ң11.6%),而加入原儿茶酸(500μm o l㊃L-1)与H S A共同孵化后,α-螺旋含量从37.9%恢复到43.3%,β-折叠含量也从11.6%降低到5.3%,进一步证实了原儿茶酸具有稳定蛋白质α-螺旋结构的能力,这也可能是其能够抑制蛋白淀粉样纤维化的原因之一㊂表1H S A和原儿茶酸-H S A体系的二级结构含量T a b l e1T h e c o n t e n t s o f s e c o n d a r y s t r u c t u r e s o f f r e eH S Aa n dP A-H S Ac o m p l e xα-H e l i x(%)β-S h e e t(%)β-T u r n(%)R a n d o mc o i l(%)H S Aa t25ħ46.92.120.929.1H S Aa t65ħ37.911.617.932.6H S AʒP A(1ʒ5)41.26.120.732.0H S AʒP A(1ʒ10)43.35.320.630.8 861第2期分析科学学报第36卷2.4原儿茶酸对H S A淀粉样纤维形态的影响为了更直观的观察H S A淀粉样纤维化的形成以及评估原儿茶酸对蛋白淀粉样纤维化的抑制效果,采用T E M观察H S A溶液中蛋白的形态变化[16]㊂如图4A所示,常温下的H S A溶液中未观察到纤维的形成,经过65ħ孵化120h的蛋白溶液则形成了直的成熟淀粉样纤维,并产生聚集形成浓密的网状结构(图4B)㊂在加入原儿茶酸孵化后该蛋白溶液的纤维化程度明显减弱,当加入的原儿茶酸浓度达到500μm o l㊃L-1时,几乎观测不到明显的纤维状蛋白,原儿茶酸与蛋白结合形成了颗粒状的聚集体(图4C和4D)㊂T E M结果与T h T荧光测量结果相符,证实原儿茶酸具有良好的抑制蛋白淀粉样纤维形成的能力㊂图4H S A淀粉样纤维的T E M图像(200n m).(A)25ħ的H S A;(B)65ħ孵化120h的H S A;(C)H S A+P A(250μm o l㊃L-1)65ħ孵化120h;(D)H S A+P A(500μm o l㊃L-1)65ħ孵化120hF i g.4T E Mi m a g e s o fH S Aa m y l o i d f i b r i l s(200n m).(A)H S Aa t25ħ;(B)H S Ai n c u b a t e da t65ħf o r120h;(C)H S A+P A(250μm o l㊃L-1)i n c u b a t e da t65ħf o r120h;(D)H S A+P A(500μm o l㊃L-1)i n c u b a t e da t65ħf o r120h2.5原儿茶酸与H S A分子对接原儿茶酸与H S A分子对接显示,原儿茶酸进入了H S A子域ⅢB和子域ⅠB之间的疏水空腔(图5 (A)),被G l u184,A r g186,A s p187,L y s190,A r g428,L y s432,S e r435,L y s436,L y s519,G l n522,I l e523,G l n526和T h r527等氨基酸残基包围,且分别与L y s432和L y s519形成两个氢键,键长分别为2.202Å和2.234Å(图5(B)),表明原儿茶酸通过氢键和疏水作用力与H S A发生结合,这种结合有助于维持蛋白质结构的稳定,阻碍蛋白质的聚集,从而抑制蛋白质淀粉样纤维化的形成㊂S a t o等[7]报道,儿茶酚型黄酮类化合物紫杉叶素通过结合Aβ42的赖氨酸残基(L y s)而抑制Aβ42多肽的聚集㊂由此推测原儿茶酸可能与紫杉叶素类似,通过与赖氨酸残基特异性结合而抑制蛋白质聚集和淀粉样纤维化的形成㊂图5(A)原儿茶酸与H S A最可能结合位点;(B)H S A疏水性空腔中与原儿茶酸作用的氨基酸残基F i g.5(A)T h em o s t p o s s i b l e b i n d i n g s i t e o f P A i nH S A;(B)I n t e r a c t i o n o f P Aw i t h t h e a m i n o a c i d r e s i d u e s i n t h e h y-d r o p h o b i c p o c ke t o fH S A3结论原儿茶酸对H S A淀粉样纤维化的抑制呈现浓度依赖性,当浓度为500μm o l㊃L-1时,其抑制率达到了59.5%㊂原儿茶酸主要通过氢键和疏水作用力与H S A发生结合,减少蛋白质表面疏水性氨基酸的暴露,使得蛋白质在较高温环境(65ħ)下也能够维持正常的构象㊂原儿茶酸可能通过与H S A中的赖氨酸残基的特异性结合而稳定蛋白质结构,从而抑制蛋白质聚集,减少淀粉样纤维化的形成㊂该研究结果可为原儿茶酸作为新型抗淀粉样蛋白抑制剂的研发提供一定的理论基础㊂961第2期王瑞等:原儿茶酸对人血清白蛋白淀粉样纤维化的抑制作用第36卷参考文献:[1] Z HA N G YJ,C A O N,Z E N GC M.C h e m i c a l J o u r n a l o fC h i n e s eU 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n g h u m a n s e r u ma l b u m i n(H S A)a sm o d e l.T h i o f l a v i nTw a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e p r o c e s s o f p r o t e i na m y l o i d f i b e r s.I tw a s f o u n d t h a t p r o c a t e c h u i c a c i d i n h i b i t e d p r o t e i na m y l o i d f i b e r s i nad o s e-d e p e n d e n tm a n n e r,w h e nt h ec o n c e n t r a t i o n so f p r o c a t e c h u i ca c i d w e r e250a n d500μm o l㊃L-1,t h e i n h i b i t o r y r a t e sw e r e42.5%a n d59.5%,r e s p e c t i v e l y.T r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p y v i s u a l l y s h o w e d t h e i n h i b i t o r y e f f e c to f p r o t o c a t e c h u i ca c i do n p r o t e i na m y l o i df i b e r s.8-B e n z e n ea m i n o-1-n a p h t h a l e n e s u l f o n i c a c i d f l u o r e s c e n c ea n dc i r c u l a rd i c h r o i s ms p e c t r ar e s u l t ss u g g e s t e dt h a t p r o c a t e c h u i ca c i dc o u l d s i g n i f i c a n t d e c r e a s e t h ee x p o s u r eo fh y d r o p h o b i ca m i n oa c i dr e s i d u e so nt h es u r f a c eo f f i b r o s i s p r o t e i na n d s t ab i l i z e t h eα-h e l i xs t r uc t u r eo f p r o t e i n.M o l e c u l a rd o c k i n g re s u l t se x h i b i t e dt h a t t h e i n t e r a c t i o nb e t w e e n p r oc a t e c h u i ca c i da n dh u m a ns e r u m a l b u m i n m a i n l yd r i ve nb y h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n sa n d h y d r o g e nb o n d i n g,a n dt h es p e c if i c a lb i n d i ng o f p r o c a t e ch ui ca c i dt ol y s i n er e s i d u e s m a i n t a i n e dt h e c o n f o r m a t i o n a l s t a b i l i t y o f t h e p r o t e i n,t h u s i n h i b i t i n g H S Aa m y l o i d f i b e r s.K e y w o r d s:P r o t o c a t e c h u i c a c i d;H u m a n s e r u ma l b u m i n;F i b e r s;I n h i b i t i o n;M o l e c u l a r d o c k i n g071。
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磷钨酸用水或磷酸缓冲液配制成1％左右的溶液，用滴管一滴染色液在制好样品的铜网上，1～2分钟后，用剪成尖角的滤纸吸去染色液。
再滴一滴纯水在铜网上，用滤纸吸去，反复两三次，这样是为了洗去多余的磷钨酸，然后静置干燥。
然后就可以用电镜观察了。
磷钨酸中的重原子相对于有机分子中的碳氢氧氮等轻原子来说，更能阻挡（散射）电子。
所以，有磷钨酸吸附（或沉积）的地方在TEM 照片中看起来更黑，而有机物占据的地方看起来更亮。
之所以叫“负染色”，就是因为被染“黑”的是背景和外轮廓，真正感兴趣的样品部分是“白”的。
也就是说，典型的经过负染色的样品是表现为黑背景中的白区。
一般有机物并不与磷钨酸发生反应，磷钨酸只是沉积在有机物周围形成“背景”或“轮廓”。
但是不是所有的磷钨酸染色都是负染色。
有一些羟基和酰胺类会与磷钨酸作用，出现正染色的效果，即有些含有这些基团的有机物在TEM下看起来被染“黑”，最典型的是尼龙。
另外，有时候不成功的负染色，看到的结果也是“白底黑点”，其实虽然是做了染色的操作，但可能由于方法不对，或者样品本身的性质不适用负染色，结果跟没染是一样的。
如果有机颗粒足够大，不染色时就能看到“白底黑点”。
另一方面，如果染色很弱，一般只是给有机颗粒镶上一个轮廓，如果染色剂量很大，则会出现很黑的“背景”。
因此，对于很小的有机颗粒，如果染色很弱，只是一个轮廓圈，电镜放大倍数不够的时候，看起来就是一个小黑点了。
就好像一个纸上画一个空心圈，站远了看也可能
成一个小黑点。