18种天然氨基酸分析

18种天然氨基酸分析
迪马科技摘要
氨基酸组成测定是蛋白质组学、食品质量检测以及药品质量检测中的重要分析项目。

本文分别以异硫氰酸苯酯、2,4-二硝基氟苯作为衍生剂对蛋白质水解液和游离氨基酸注射液进行衍生，使用Diamonsil AAA柱250×4.6 mm，5 μm，梯度洗脱进行分离，能够满足19种天然氨基酸的分析，各组分分离度较高、定量结果准确而稳定。

Abstract
The amino acid determination is an important analysis project in proteomics, food and drug quality testing.The method determination of 19 nature amino acid in protein hydrolyzed solution and free amino acid injection, the derived reagent is phenyl isothiocyanate (PITC) and 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene. The column is Diamonsil AAA (250 × 4.6 mm, 5 μm), gradient elution, the results are accurate and stable.
引言
从化学角度讲，同时含有一个或多个氨基和羧基的脂肪酸均可称为氨基酸。

自然界存在300多种氨基酸，但构成天然蛋白质的氨基酸只有20种，这20种氨基酸又称为天然氨基酸。

天然氨基酸分析是食品、饲料和药品分析的重要项目。

目前氨基酸分析常常采用这样两种方式：离子交换色谱分离-柱后衍生和柱前衍生-反相色谱法分离。

后者以操作灵活、费用低廉而被广泛应用。

在柱前衍生-反相色谱法分离中，异硫氰酸苯酯(PITC)和2,4-二硝基氟苯(DNFB)均可与一级胺、二级胺反应，是理想的柱前衍生剂。

尽管天然氨基酸多达20种，但由于蛋白质水解过程中天冬酰胺和谷氨酰胺分别转化为天冬氨酸和谷氨酸，半胱氨酸则以胱氨酸形式存在，因而对于含蛋白食品、饲料等样品的氨基酸分析时，只需分析Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Ser(丝氨酸)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Arg(精氨酸)、Thr(苏氨酸)、Ala(丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(缬氨酸)、Met(甲硫氨酸)、Cys-Cys(胱氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Trp(色氨酸)、Lys(赖氨酸)等18种氨基酸，PITC和DNFB均能与这些氨基酸生成稳定的衍生物。

此外，DNFB还能对半胱氨酸进行衍生，对PITC衍生法是一个重要的补充，能够满足氨基酸注射液中涉及的19种氨基酸分析。

1 分析原理
对于含蛋白样品(饲料、动物组织等)，先对样品进行酸水解或碱水解处理，得到游离氨基酸
溶液，然后用合适的衍生剂进行柱前衍生，赋予氨基酸以疏水结构和吸收基团，然后使用反相液相色谱-紫外检测器分离并检测。

对于游离氨基酸分析，比如氨基酸注射液、生物样品中的游离氨基酸，不必进行水解，样品提取或稀释后直接进行衍生操作。

异硫氰酸苯酯(PITC)衍生法：PITC 与氨基酸在弱碱性条件(pH≈9.0)下反应生成噻唑啉酮苯胺衍生物，衍生物在反相柱上具有较强保留并在254 nm 下具有明显吸收。

N
C
S +
H 2N
C R 1
COOH
R 2
N
NH
C
O
S
R 1
R 2
pH=9.0
2,4-二硝基氟苯(DNFB)衍生法：在弱碱性、避光、60 °C 条件下，氨基酸上的α-氨基与DNFB 发生Sanger 反应，生成2,4-二硝基苯氨基酸。

2,4-二硝基氨基酸在反相柱上具有较强保留并在360 nm 下具有较强吸收。

O 2N
NO 2
F H 2N
R 2
R 1
2N
NO 2
H N
COOH R 1
R 2
+pH=9.0-10.0
+HF
Diamonsil AAA 氨基酸分析柱具有优越的选择性，能既能够分离氨基酸-异硫氰酸苯酯衍生物又能够分离2,4-二硝基氟氨基酸衍生物，当分析者采用PITC 柱前衍生法或DNFB 柱前衍生法分析氨基酸时，Diamonsil AAA 氨基酸分析柱将是最佳的分离工具。

2 材料与方法 2.1 仪器与器皿
2.1.1岛津10A 二元高压液相色谱仪，配紫外检测器或DAD 检测器 2.1.2 Diamonsil AAA 氨基酸分析柱 2.1.3 20 mL 顶空瓶或20 mL 安瓿瓶 2.1.4 2 mL 塑料离心管 2.1.5 20 mL 玻璃具塞刻度试管 2.1.6 5 mL 玻璃具塞刻度试管 2.2 试剂
2.2.1 0.1%苯酚+6 mol/L HCl 水溶液：称取0.1 g 苯酚置于100 mL 容量瓶，加入50 mL 浓盐酸(36%-38%，摩尔浓度约为12 mol/L)，然后加水定容至100 mL
2.2.2 0.1 mol/L HCl 水溶液：量取8.3 mL 浓盐酸，然后用纯水定容至1000 mL
2.2.3 氨基酸储备液：称取一定量氨基酸标准品，用0.1 mol/L HCl水溶液溶解，胱氨酸为0.01 mol/L，酪氨酸为0.02 mol/L，其他氨基酸为0.05 mol/L
2.2.4 氨基酸使用液：将储备液用0.1 mol/L HCl水溶液稀释，得到浓度为0.002 mol/L的氨基酸单标和混标(胱氨酸浓度为0.001 mol/L)用于PITC衍生法；将储备液用0.1 mol/L HCl 水溶液稀释，得到浓度为0.0005 mol/L的氨基酸单标和混标(胱氨酸浓度为0.00025 mol/L)用于DNFB衍生法
2.2.5 正亮氨酸内标液：以正亮氨酸作为内标物。

称取一定量正亮氨酸，溶于0.1 mol/L HCl 水溶液，得到0.02 mol/L的正亮氨酸内标液
2.2.6 异硫氰酸苯酯溶液：将250 μL异硫氰酸苯酯用乙腈定容至10 mL，得到0.2 mol/L异硫氰酸苯酯溶液
2.2.7 三乙胺溶液：将1.4 mL三乙胺用乙腈定容至10 mL，得到1.0 mol/L三乙胺溶液
2.2.8 1%DNFB乙腈溶液：0.5 mL 2,4-二硝基氟苯(DNFB)溶于50 mL乙腈，体积分数为1%，约等于0.08 mol/L；
2.2.9 0.1 mol/L Na2B4O7水溶液：称取1.91 g Na2B4O7·10 H2O，用50 mL纯水溶解，溶液pH约为9.50
3 方法
3.1 样品处理
蛋白质水解(酸水解法)：蛋白质样品(饲料、奶粉、动物组织等)：对于动物样品，干燥后粉碎成细小颗粒；对于饲料，粉碎成细小颗粒；奶粉不需预处理。

将一定量样品*置于20 mL 旋盖(内衬PTFE隔垫)细口瓶，加入10 mL0.1%苯酚+6 mol/L HCl水溶液，旋紧盖子，振荡混匀，110 °C下反应24 h。

反应完毕，将反应液全部转移到100 mL蒸馏瓶中，75 °C下减压蒸馏至近干，以除去反应液中残余的HCl，然后用12 mL 0.1 mol/L HCl水溶液分三次溶解残渣，并转移到20 mL玻璃具塞刻度试管，再用纯水定容至20 mL，待衍生。

*当采用PITC衍生法时，样品中蛋白质量最好处于0.0100 g～0.0400 g之间；当采用DNFB 衍生法时，样品中蛋白质量最好处于0.0050 g-0.0200 g之间。

注射液处理：当采用PITC衍生法时，用0.1 mol/L HCl水溶液将样品稀释至4 g/L；当采用DNFB衍生时，用0.1 mol/L HCl水溶液将样品稀释到2 g/L。

3.2 异硫氰酸苯酯衍生方法
3.2.1 样品溶液衍生
量取200 μL样品溶液(蛋白质水解液或游离氨基酸溶液)，置于1.5 mL塑料离心管中，加入20 μL正亮氨酸内标溶液[1]，混匀，再加入100 µL 1 mol/L三乙胺乙腈溶液和100 µL 0.2 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，室温反应1小时，然后加入400µL正己烷，旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s，静置分层，取200 µL下层溶液与800 µL水混合[2]，0.22 µm针式过滤器过滤，待分析。

3.2.2 标准溶液衍生化
量取200 µL氨基酸混合使用液(胱氨酸浓度为1.0 mmol/L，其他氨基酸浓度为2.0 mmol/L)，置于1.5 mL塑料离心管中，准确加入20 μL正亮氨酸内标溶液[1]、100 µL 1 mol/L三乙胺乙腈溶液和100 µL 0.2 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，室温反应1小时，然后加入正己烷400 µL，旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s，静置分层，取200 µL下层溶液与800 µL水混合[2]，0.22 µm针式过滤器过滤，待分析。

注：
[1] 只有采用内标法分析时，才需要加入正亮氨酸作为内标物；
[2] 衍生得到的样品溶液中含有50%的乙腈，这与流动相溶剂体系存在较大差距，因而需要加水稀释，否则会引起峰前沿或分叉。

3.3 2,4-二硝基氟苯衍生方法
3.3.1 样品溶液衍生
将0.5 mL样品溶液(蛋白质水解液或游离氨基酸溶液)加入5 mL玻璃具塞刻度试管中，然后加入0.5 mL 0.1 mol/L Na2B4O7水溶液和1%DNFB乙腈溶液，具塞摇匀，然后于60 °C下避光反应1 h。

反应完毕将试管置于冷水中冷却，然后用0.02 mol/L Na2HPO4 + 0.02 mol/L NaH2PO4水溶液定容至5 mL，混匀后待检测。

3.3.2 标准溶液衍生
将0.5 mL氨基酸混合使用液(胱氨酸浓度为0.25 mmol/L，其他氨基酸浓度为0.5 mmol/L)加入5 mL玻璃具塞刻度试管中，然后加入0.5 mL 0.1 mol/L Na2B4O7水溶液和1%DNFB 乙腈溶液，具塞摇匀，然后于60 °C下避光反应1 h。

反应完毕将试管置于冷水中冷却，然后用0.02 mol/L Na2HPO4 + 0.02 mol/L NaH2PO4水溶液定容至5 mL，混匀后待检测。

3.4 分析条件
3.4.1 氨基酸-PITC衍生物的分析条件
色谱柱: Diamonsil AAA氨基酸分析柱，250×4.6 mm，5 μm(CAT#: 99751) 保护柱：EasyGuard C18，10 × 4.0 mm，5 μm(CAT#: 6201)
流动相A: 0.05 mol/L乙酸钠水溶液(冰乙酸调节pH值为6.50 ± 0.05)
流动相B: 甲醇: 乙腈: 水=20 : 60 : 20(V : V : V)
流速: 1.0 mL/min
柱温: 35 ℃
进样体积: 10 μL
梯度程序
3.4.2 氨基酸-DNFB衍生物的分析条件
色谱柱: Diamonsil AAA氨基酸分析柱，250×4.6 mm，5 μm(CAT#: 99751)流动相A: 0.02 mol/L Na2HPO4 + 0.02 mol/L NaH2PO4水溶液
流动相B: 甲醇: 乙腈=10 : 90 (V : V)
流速: 1.2 mL/min
柱温: 35 ℃
进样体积: 10 μL
梯度程序
4 结果
4.1 异硫氰酸苯酯衍生法
4.1.1 标准溶液
图1为18种氨基酸-PITC 以及氨-PITC 的分离情况，各目标化合物间的分离度超过2.0，分离情况较好，定量更加准确。

即使色谱柱柱效稍有下降，分离情况也不会受到影响。

能够采用PITC 柱前衍生-Diamonsil AAA 氨基酸柱分析的氨基酸包括Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Ser(丝氨酸)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Arg(精氨酸)、Thr(苏氨酸)、Ala(丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(缬氨酸)、Met(甲硫氨酸)、Cys-Cys(胱氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Trp(色氨酸)、Lys(赖氨酸)等18种氨基酸。

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图1 18种天然氨基酸-PITC 以及氨-PITC 的液相色谱图(Nle 为内标物)
4.1.2 奶粉
图2为奶粉水解液经PITC 衍生、Diamonsil AAA 氨基酸柱分离后的液相色谱图，由图可知除色氨酸(Trp)外，其余17种氨基酸全部检出，并达到较好分离。

表1中数据为定量结果，氨基酸总含量为17.49%，接近厂家标示的蛋白质含量(约18%)。

除胱氨酸外，平行样品的氨基酸含量以及总含量的RSD 均小于3.0%，表明该方法具有较高的重现性。

胱氨酸含量较低，因而数值偏差较大一些；色氨酸无法检出是因为酸水解过程中，色氨酸被破坏，色氨酸分析时建议采用碱水解法。

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图2 PITC 柱前衍生法分析奶粉水解液中氨基酸的液相色谱图
表1 某品牌奶粉中氨基酸含量(PITC 柱前衍生法)
4.1.3 饲料
图3为饲料水解液经PITC 衍生、Diamonsil AAA 氨基酸柱分离后的液相色谱图，由图可知除色氨酸(Trp)外，其余17种氨基酸全部检出，并达到较好分离。

由表2中数据可知氨基酸总含量为43.48%，与厂家标示的蛋白质含量43%相当。

平行样品的氨基酸含量以及蛋白质含量的RSD 均小于3.5%，表明该方法具有较高的重现性。

色氨酸无法检出是因为酸水解过程中，色氨酸被破坏，色氨酸分析时建议采用碱水解法。

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图3 PITC 柱前衍生法分析饲料水解液中氨基酸的液相色谱图(图中的Nle 为内标物) 表2 某品牌鱼饲料中氨基酸含量(PITC 柱前衍生法)
4.1.4 氨基酸注射液
图4和表3是某品牌氨基酸注射液的分析结果。

由数据可知，全部18种氨基酸均达到较好分离；从检出值来看，除胱氨酸外，其他17种氨基酸的检出值与配方值偏差不超过±3.5%。

胱氨酸含量较低，因而分析偏差更大一些。

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图4 PITC 柱前衍生法分析氨基酸注射液的液相色谱图
表3 某品牌氨基酸注射液的检出浓度(PITC 衍生法)
*厂家生产注射液时，这3个化合物是以水合形式或HCl盐形式添加的，表中是经过换算得到的它们真实的配方浓度。

4.2 2,4-二硝基氟苯衍生法
4.2.1 标准溶液
图5是19种氨基酸-DNFB衍生物以及氨-DNFB衍生物的液相色谱图。

通过DNFB衍生、Diamnsil AAA氨基酸分析柱分析，包括Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Ser(丝氨酸)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Arg(精氨酸)、Thr(苏氨酸)、Ala(丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(缬氨酸)、Met(甲硫氨酸)、Cys-Cys(胱氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Trp(色氨酸)、Lys(赖氨酸)以及Cys(半胱氨酸)等19种氨基酸能够被准确定量。

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2-氨基丁酸
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图5 19种天然氨基酸-DNFB 以及氨-DNFB 的液相色谱图(2-氨基丁酸为内标物) 4.2.2 奶粉
图2为奶粉水解液经DNFB 衍生、Diamonsil AAA 氨基酸柱分离后的液相色谱图，由图可知除色氨酸(Trp)外，其余17种氨基酸全部检出，并达到较好分离。

对所有检出氨基酸定量，可知蛋白质总含量为17.89%，与厂家标示的蛋白质含量(约18%)基本一致，并且与PITC 衍生法测定的数值极为接近。

平行样品的氨基酸含量以及蛋白质含量的RSD 均小于2%，表明该方法具有较高的重现性。

色氨酸无法检出是因为酸水解过程中，色氨酸被破坏，色氨酸分析时建议采用碱水解法。

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图6 DNFB 柱前衍生法分析奶粉中氨基酸的液相色谱图(2-氨基丁酸为内标物) 表4 某品牌奶粉中氨基酸含量(DNFB 衍生法)
4.2.3 饲料
饲料水解液经DNFB衍生后Diamonsil AAA分离，由图7可知，除色氨酸外，其余17种氨基酸均被检出；对比表2和表5可以发现，在两种衍生法下，无论是单种氨基酸的含量还是氨基酸总量，数值非常接近，这也间接证明了两种方法的可靠性。

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图7 DNFB 柱前衍生法分析饲料中氨基酸的液相色谱图(2-氨基丁酸为内标物) 表5 某品牌鱼饲料中氨基酸含量(DNFB 衍生法)
4.2.4 氨基酸注射液
图7和表6是某品牌氨基酸注射液的分析结果。

由数据可知，全部18种氨基酸以及衍生副产物均达到较好分离；从检出值来看，除胱氨酸和酪氨酸外，其他16种氨基酸的检出值与配方值偏差不超过±4.0%。

胱氨酸和酪氨酸偏差较大与其浓度较低有关。

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图7 DNFB 柱前衍生法分析氨基酸注射液的液相色谱图(2-氨基丁酸为内标物) 表6 某品牌氨基酸注射液的检出浓度(DNFB 衍生法)
*厂家生产注射液时，这3个化合物是以水合形式或HCl盐形式添加的，表中是经过换算得到的它们真实的配方浓度。

5 结论
迪马科技开发的氨基酸分析方法+Diamonsil AAA氨基酸分析柱应用于食品、饲料以及药品中氨基酸组成的分析具有分离效果好、分析结果可靠、重现性好等特点。