泛素-蛋白酶体通路与癌症关系的研究进展

泛素-蛋白酶体通路与癌症关系的研究进展
张海满
（山东农业大学生命科学学院山东泰安201018）
摘要：泛素化过程是真核细胞内重要的蛋白质质控系统，参与细胞的多种生理活动过程，对维持细胞正常的生理功能具有十分重要的意义。

泛素-蛋白酶体途径（UPP）的异常改变不仅与癌症的病因学有着直接关素，并且与癌症的发展和预后有着密切的关系。

本文综述了泛素的构成、泛素链的形成过程、UPP的生理和病理功能及UPP与癌症的关系的研究进展。

关键词：泛素-蛋白酶体通路；UPP；癌症；研究
细胞内蛋白质的产生和降解必须保持着动态平衡，才能维持细胞的稳态和正常功能。

泛素-蛋白酶体途径( ubiquitin-pro-teasome pathway, UPP)是细胞内蛋白质选择性降解的重要途径，泛素分子主要通过泛素活化酶、泛素结合酶和泛素-蛋白连接酶与靶蛋白结合形成一条多泛素链，将底物蛋白泛素化，使靶蛋白被26S蛋白酶体所识别和降解。

UPP可高效并高选择性地降解细胞内蛋白质，尤其是一些短寿命的细胞周期调节蛋白、癌基因和抑癌基因产物以及变性变构蛋白等。

1.泛素-蛋白酶体途径（UPP）的构成
UPP成分十分复杂，主要包括泛素( ubiquitin, Ub)、泛素活化酶( ubiquitin-activatingenzyme, E1)、泛素连接酶( ubiquitin-conjugatingenzyme, E2)、泛素蛋白连接酶( ubiquitin-protein ligating enzyme, E3)、26S蛋白酶体及去泛素化酶( deubiquitinating enzyme, DUBs)等。

UPP存在于所有真核生物的细胞内，是蛋白质选择性降解的主要方式。

1.1泛素( ubiquitin, Ub)
泛素是一种广泛分布在真核细胞中的高度保守的小分子球状蛋白质。

1975年由Goldstein首次提出，此后不断出现有关报道[1]。

单个泛素分子由76个氨基酸残基组成，相对分子质量约8.5×103，有一个明显的疏水核心和大量的氢键，表现出特殊的稳定性，能够防止其自身在结合和靶向性降解循环中变性失活，从而保证泛素循环的进行。

依赖于ATP的酶促反应，E1通过在Ub的羧基末端和E1自身激活位点半胱氨酸之间形成一个硫酯键而激活Ub，激活的Ub被转到E2结合酶上，然后E2在E3作用下共价结合到需要降解的胞质或胞核的蛋白上，使底物蛋白发生泛素化，形成Ub单体，多个Ub单体通过异肽键连接形成多聚Ub链，每个多聚Ub链至少含有4个Ub单体。

1.2泛素活化酶( ubiquitin-activating enzymes, E1)
泛素活化酶是单基因编码的相对分子质量分别为110×103和117×103的2个亚基，存在于细胞核
和细胞质中，可以催化所有的泛素化反应。

泛素活化酶是泛素与底物蛋白结合所需要的第一个酶，对靶蛋白的特异性没有影响。

在结构上含有位置固定的保守的半胱氨酸残基，通过半胱氨酸残基与泛素的C端形成高能硫酯键而激活泛素。

1.3泛素结合酶( ubiquitin-conjugating enzymes, E2)
泛素结合酶是由许多相对分子质量为14～35的蛋白质所组成的一个超家族。

所有的泛素结合酶都含有一个保守的约150个氨基酸残基的核心结构域，结构域的中央是决定其酶活性的半胱氨酸残基。

E1和E3通过相同的基序与E2连接，所以E2在反应循环过程中必须在E2和E3之间穿梭往返运行。

1.4泛素-蛋白连接酶( ubiquitin-protein ligases, E3)
高等生物的泛素-蛋白连接酶总数为数百到一千以上，其结构域主要包括HECT( homologous to E6-associated protein car-boxy1 terminus)结构域、指环状( RING finger)结构域和U-box结构域。

正是由于这些复杂多变的E3家族成员可以对不同底物进行特异性识别，才呈现出蛋白降解的高度选择性。

泛素-蛋白连接酶在泛素化途径中起到关键的作用，它连接泛素结合酶和特异性底物，将活化的泛素链转移到特异性底物的赖氨酸残基上，通过识别多聚泛素链而有目的地降解蛋白质。

1.5蛋白酶体
26S蛋白酶体是降解泛素化底物的ATP依赖型蛋白水解复合体，由20S核心颗粒、19S调节颗粒和11S调节因子构成。

1.5.1 20S核心颗粒( core protease, CP)
CP是由4个七聚体蛋白环层叠在一起形成的空心圆柱体样结构，是26S蛋白酶体的水解核心。

活性位点位于20S圆柱体空心结构中心的2个β环上，有胰蛋白酶、糜蛋白酶和谷氨酰样肽水解活性，可以将大多数肽键断裂。

2个α亚基的N端封住蛋白水解腔隙的入口，对蛋白酶体CP的活性具有自身抑制作用，这样只有进入蛋白酶体圆柱体内部的蛋白才能够被水解。

1.5.2 11S调控因子( regulator, REG)
11S调控因子有3个亚单位，相对分子质量为28×103，其亚单位的氨基酸序列大部分具有同源性，但17～34残基为易变区，赋予亚单位一定的特异性。

REG结合在20S CP末端，本身不具催化和降解大分子蛋白的功能，但可以激活蛋白酶体的蛋白酶活性。

1.5.3 19S调节颗粒( regulatory particle, RP)
19S调节颗粒由基底(base)和盖子(lid)2个亚单位组成，分别与CP两端的α环结合。

基底含有ATP 酶亚基，可以水解ATP释放能量，在α环上形成一个通道(gate)，以便底物能够进入催化中心被催化。

盖子能够识别泛素化的蛋白质和蛋白酶体的其他底物。

1.6.泛素解离酶(DUBs)
虽然泛素与细胞内快速降解的蛋白连接在一起，但是其本身却是长寿命蛋白，这是由于泛素蛋白偶连物在水解之前DUBs将泛素从底物上解离下来。

DUBs能够识别最接近的泛素基序，特异性地在泛素和与其C末端最后一个残基(Gly76)相连的分子之间断开。

半胱氨酸蛋白酶型DUBs根据泛素-蛋白酶结构域又可分为4个亚类：泛素特异性蛋白酶(USP)、碳末端水解酶(UCH)、卵巢肿瘤蛋白酶(OTU)和MJD蛋白酶。

金属蛋白酶型DUBs的泛素-蛋白酶结构域称为JAMM ( JAB1/MPN/Mov34metalloenzyme)。

半胱氨酸蛋白酶的活性信赖于活性位点中的一个半胱氨酸的硫醇基团。

这个半胱氨酸在邻近组蛋白的辅助下去质子化，在一个天门冬氨酸残基的作用下产生极性，这三个氨基酸残基构成催化三联体。

在催化过程中，半胱氨酸表现出亲质子作用，攻击靶蛋白与泛素之间易断裂肽键的羰基端，结果将靶蛋白释放出来，泛素与UDBs形成一个共价连接的中间体。

中间体与水分子反应释放出游离的酶和泛素。

2.与靶蛋白多聚泛素链的形成
靶蛋白的泛素链最少需要四个泛素分子的长度才能够被蛋白酶体有效降解。

关于靶蛋白的泛素链是如何形成的还不清楚，推测可能存在以下4种模型[2]：
2.1有序增加模型(sequential addition model)
也称为标准模型，即E3通过不同的结构域与E2和底物结合，形成E2-E3-底物复合体，E3促使与E2连接的泛素分子直接转移到底物的赖氨酸残基，然后E2-E3-底物复合体中的E2再接受来自E1分子传递的新的泛素分子，在E3的作用下将泛素分子直接转移到与底物相连的第一个泛素分子，接下来循环此过程，完成靶蛋白泛素链的组装。

2.2指数模型( indexationmodel)
是指在形成E2-E3-底物复合体后，E2上的第一个泛素分子首先与E3s的HECT结构域的半胱氨酸活化位点结合，然后依次在此位置形成一条泛素链，最后泛素链从E3上转移到底物的赖氨酸残基。

2.3秋千模型(seesawmodel)
是指E3与2个E2和底物形成复合体后，泛素链的组装发生在2个E2的活化位点上，即一个E2上的泛素分子转移到另一个E2上后，新转移过来的泛素位于最底层直接与E2连接的位置，而原来与E2直接连接的泛素则与新转移过来的泛素相连，依此从后向前的方式形成一条泛素链，最后泛素链直接从E2转移到底物上。

2.4杂和模型(hybrid model)
是指E2-E3-底物复合体形成后，E2上的泛素分子首先转移到E3上，在E3上形成一条泛素链，然后泛素链按照E3→E1→E2→底物的传递顺序连接到靶蛋白上。

不同的E3s可能通过不同的机制组装靶蛋白的多泛素链。

3. UPP的生理及病理功能
近年来，随着对UPP研究不断深入，发现其在人类的许多生理活动中起着非常重要的作用。

细胞周期的调控。

细胞生长周期受各种周期蛋白(cycline)和细胞周期依赖性激酶(cycline-dependentkinase, CDK)及CDK抑制剂的调节，分别促进和抑制细胞周期的运行。

UPP可调节CDK和CDK抑制剂活性，CDK抑制剂p27及细胞周期素D和E均是UPP作用的重要底物[3]。

3.1转录的调控。

一些转录调节因子如核因子ΚB(NF-κB)、细胞周期重要调节因子(E2F)、原癌基因产物c-Fos和c-jun等都可以作为底物接受UPP调节，使其基因表达活化或失活。

NF-κB是多亚基调节因子，多以失活方式存在于细胞质。

在对乳腺癌的研究中发现，NF-κB需经过两条蛋白酶体依赖性蛋白裂解反应才能激活，而细胞对一些细胞毒因子的刺激出现抗凋亡的原因就在于NK-κB的激活，活化的NF-κB进入核内与相应的DNA位点结合，调节多基因的转录。

3.2凋亡的调控。

UPP在细胞凋亡的调控中可能起着重要的作用，一些与凋亡有关的调节分子如Bcl-2和srp60等都是通过UPP降解的。

有研究显示，不同类型的脑肿瘤组织中有不同程度的srp60的表达，同时Ub的出现频率上升，支持上述观点。

3.3抗原提呈。

UPP是主要组织相容性复合物限制性I类抗原(MHC-I)提呈所必需的环节。

抗原提呈细胞内的内源性蛋白被26S蛋白酶体降解成多肽，并在内质网中与MHC-I类分子结合转运至细胞膜表面，被细胞毒T细胞识别。

3.4细胞周期的调控
细胞周期因子首先被泛素化，然后由26S蛋白酶体降解，导致周期因子依赖的激酶失活，从而使细胞有丝分裂期中止。

细胞周期因子—周期因子依赖的激酶复合体可由它们特定的抑制因子使其失活。

这些抑制因子也是由UPP途径降解[4]。

3.5肿瘤发生的调控
在肿瘤细胞中，p53失活一方面是由基因突变造成的，另一方面与UPP对其异常的降解有关。

在高危型人乳头瘤状病毒(HPV)引起的宫颈癌中，p53蛋白的表达水平明显降低，这是由于16或18型HPV编码的癌蛋白E6促进含有HECT结构域的泛素蛋白连接酶E6-AP与p53结合，促进p53通过UPP 被降解。

4. UPP在癌症关系的研究进展
贾永侠[5]等指出病毒侵染宿主细胞后，细胞的泛素蛋白酶体途径与一些重要的病毒蛋白相互作用，参与调节病毒的生命周期。

同时，病毒的某些蛋白也会影响泛素蛋白酶体途径，以逃避宿主的防御机制。

郭卉[6]等指出泛素-蛋白酶体途径在各种不同的癌蛋白或者转录调节因子的降解方面发挥重要作用，比如C-M yc，C-Fos，C-Jun，研究的最多的是核转录因子NF-κB。

最近新的蛋白酶抑制剂的开发进展和对细胞周期的更好的理解可以帮助我们更好的掌握UPP的功能，对治疗由泛素系统紊乱而引起的各种疾病，尤其是恶性肿瘤具有重要意义。

倪晓光[7]等指出UPP可以精细的调节细胞周期的进程、抑制或促进细胞凋亡以及激活转录因子的表达等。

当泛素-蛋白酶体系统的酶或识别特异性底物的基序发生功能性突变时，其对靶蛋白的调控能力丧失可以引起癌蛋白聚集、抑癌蛋白异常降解、突变细胞凋亡受阻和增值加速，从而导致肿瘤的发生。

在理论上，针对UPP最有效的治疗点是阻断E3s对底物的特异性识别。

然而这项工作是非常困难的，因为开发小分子药物和阻断蛋白-蛋白相互作用极其复杂，至今仍停留在实验室水平。

MDM2由于和p53联系在一起可以作为治疗的靶标而受到广泛的关注。

王帅[8]等指出UPP在细胞内普遍存在，其功能的改变可直接导致或诱发人类的许多主要的疾病，特别是癌症相关疾病。

通过对UPP的干预以防止特定蛋白的降解，或通过激发此通路以实现靶蛋白活性的调节，无疑将成为肿瘤治疗的新方向。

免疫组化显示，在肝癌细胞核和胞质中，泛素呈阳性，泛素化蛋白的标记指数显著高于其他慢性肝病，并与肝癌细胞分化不良相关。

吴怡[9]指出泛素化与去泛素化的改变和多种肿瘤的发生密切相关，恶性肿瘤多伴随癌基因和抑癌基因产物的表达异常。

肿瘤可以起因于癌基因蛋白/生长促进因子的稳定或由于肿瘤抑癌基因的不稳定。

某些常规通过蛋白酶体降解的癌基因蛋白，如果不能及时地从细胞中清除，就会诱导细胞恶变。

一些抑癌基因的不稳定如P27也已经证实与泛素化降解密切相关。

细胞周期依赖激酶抑制因子P27是CDK2/Cyclin E和CDK2/CyclinA复合物活性的负调节因子，可阻止细胞从G1期进入S期。

P27也是由泛素介导降解的。

实验表明，在肠癌、前列腺癌及乳腺癌中P27水平降低。

P27的低水平与肿瘤的侵袭性、肿瘤的恶性度、临床分期及不佳预后密切相关。

动物实验证明肿瘤中SKp2 (一种F-box蛋白)水平明显升高，而后者可促进P27泛素化。

去泛素化作用可以稳定抑癌基因，从而抑制了肿瘤的发生。

p53的稳定性对于其发挥抑制肿瘤发生的作用是至关重要的。

目前的研究已证实疱疹病毒相关性泛素特异性蛋白酶(HAUSP)是一种新的p53相互作用蛋白。

即使在Mdm2大量存在的情况下，HAUSP仍能够发挥其强烈的稳定作用，并且还能诱导p53依赖细胞生长受抑制以及凋亡。

有意义的是，HAUSP 有内源性的酶活性，无论是在体内还是体外，都能够将p53去泛素化。

相反，在细胞内HAUSP的点突变基因的表达增加了p53泛素化的水平及其不稳定性。

这些结果表明能够通过直接的去泛素化使p53稳定，同时也表明通过使p53稳定，HAUSP在体内作为肿瘤抑制因子发挥功能。

吕会增[10]指出VHL(the von Hippel-Lindau)肿瘤抑制蛋白(pVHL)是泛素连接酶E3的底物识别亚基!常氧条件下作用于促血管生成素转录因子(HIF)的α亚基，通过快速的泛素-蛋白酶体降解途径对HIF-1α蛋白水平进行调节。

用HIF的α亚基氧解结构域的肽对pVHL的底物识别位点进行竞争性抑制!细胞致瘤表现与有VHL缺陷的肿瘤细胞表型相一致!这证明pVHL的底物识别对VHL发挥肿瘤抑制作用是必要的"常氧下单纯HIF-1α的非泛素化不是VHL缺陷细胞致瘤的决定性因素HIF-1α亚基的非泛素化在VHL缺陷的肾透明细胞癌中导致HIF-1α的高表达与肿瘤血管内皮因子VEGF mRNA上调和蛋白及微血管密度增加显著相关，说明HIF-1α的非泛素化可能与VHL缺陷肿瘤的侵袭和转移有关。

在乏氧条件下，HIF-1α对VHL产生的泛素-蛋白酶体依赖性降解抵抗，稳定表达HIF-1α蛋白。

在VHL功能缺失的肾癌细胞系中，分子伴侣.Hsp90拮抗剂格尔德霉素促进.HIF-1α通过一个新的非氧依赖E3泛素连接酶降解。

综上所述，泛素-蛋白酶体途径不仅在癌症的发生、发展中起重要作用，而且有可能作为一种新的治疗靶点。

目前研究已逐渐从动物实验水平向临床应用研究过渡，随着相关基因、细胞因子和药物通过泛素蛋白酶体途径对肿瘤作用机制的深入研究，泛素-蛋白酶体途径抑制剂可能成为一种新型的临床分子靶点抗癌药物。

参考文献
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