Western blotting全新革命-整套创新的蛋白质印迹工作流程解决方案-CN

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westernblotting蛋白质印迹实验的流程

实用标准文案细胞总蛋白的提取（1）离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少量上清液中，转移至1.5ml 离心管内，用1×PBS溶液洗涤2次，每次加入1mL PBS溶液，1000r/min，4℃离心5min，弃上层液体。

洗涤两次后，将上清液完全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬（若不分散，则无法与裂解液充分混匀）。

（2）每管加入细胞团等体积的含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA细胞裂解液；如需检测磷酸化蛋白，则需另加入磷酸酶抑制剂。

使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min。

如暂不提取蛋白，也可在洗涤细胞2次后加入含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂的1×PBS约100μL，1000r/min，4℃离心5min后，完全弃上层液体，置于-80℃冰箱保存备用。

（3）冰上超声处理细胞，每次超声2s，间隔3s，约10-20次。

（4）13000r/min，4℃离心15min，收集上清溶液至另一干净并预冷的1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存备用。

2. BCA法测定蛋白质浓度（1）配制工作液根据标准品及待测样品的个数，按BCA试剂A和试剂B体积比为50:1配制足量BCA工作液，充分混匀，置于常温备用。

（2）配制标准品取原标准品BSA（2mg/mL）约100μL，取出50μL，用ddH2O按对数法稀释成如下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL；设置96孔板第一横排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入20μL 1×PBS，从第三横排起，精彩文档．实用标准文案按浓度梯度由低到高依次取20μL标准品至96孔板中，每一浓度做2个平行孔。

（3）稀释待测样品取5μl待测蛋白样品，用ddH2O稀释到50μL，分别取20μL至96孔板中，每一浓度做2个平行孔；（4）分别加入200μL BCA工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气泡，置于温箱37℃孵育30min。

western-blotting(蛋白免疫印迹)PPT课件

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膜的选择
1. PVDF膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
2. PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。大于20KD的蛋白选用0.45um的膜，小于20KD的蛋白选用0.2um的膜。
1.含HRP的抗体； 2.发光试剂； 3.反应的杂质;
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洗脱抗体
一抗洗脱二抗洗脱一抗种属来源不同时，strip二抗即可
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三、显色
暗室曝光 Tanon 5200 全自动化学发光图像分析系统
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Tanon 5200---性能特点
适用于高分辨率和高灵敏度的图像拍摄；
可设定连续采样的次数、起始及终止曝光时间，进行动态连续拍摄，拍摄得高质量的图片；
在裂解液中加入合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准
确性！ .
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蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。
对
电转仪长期使用导致海绵变薄，
策
“三明治”结构不紧凑导致。
确保膜和胶块之间没有气泡
缓冲液中离子浓度太低，电流或电
压太高。转膜过程注意降温
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四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 膜没有均匀浸湿 2. 膜或者缓冲液污染 3. 封闭不充分 4. 抗体与封闭剂出现交叉

western blotting(蛋白免疫印迹)

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蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分
子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。 ③ 蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其形状及所带电荷的性质无关。
电泳缓冲液：pH8.3 Tris- 甘氨酸系统
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PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，简称PAG): 单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED) 催化剂过硫酸铵三维网状结构的凝胶，该凝胶化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度，是良好的电泳介质，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称 PAGE)。
对策
5. 抗体浓度过高
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Thanks！
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压太高。转膜过程注意降温
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四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 2. 3. 4. 膜没有均匀浸湿膜或者缓冲液污染封闭不充分抗体与封闭剂出现交叉反应
1. 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 2. 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 3. 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应 4. 杂交前检测一抗、二抗的工作浓度
蛋白质免疫印迹技术详解
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主要内容
一、Western Blot 简介二、Western Blot 一般流程

WesternBlot最全攻略：从protocol到问题解决

WesternBlot最全攻略：从protocol到问题解决蛋白免疫印迹（western blotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测3个部分组成，是根据抗原抗体特异性结合检测样本中某种蛋白的方法，与ELISA不同的地方在于WB是一种半定量的检测方法。

操作流程如下：下面详细介绍一下每个操作步骤：一、样本的制备（1）样本一般是组织和细胞，根据样本类型的不同，选择合适的裂解液：样本类型裂解液全细胞NP-40、RIPA细胞质（可溶性）Tris-HCl细胞质（细胞骨架）Tris-Triton膜结合部分NP-40、RIPA细胞核RIPA、核裂解液线粒体RIPA（2）抑制剂，根据研究的目的蛋白进行选择，假如要检测磷酸化的蛋白含量，就要对磷酸酶进行抑制，现在很多公司都有多种抑制剂的混合物抑制剂靶点浓度2μg/ml抑肽酶胰蛋白酶、血纤维蛋白溶酶亮抑酶肽溶酶体1-10μg/ml胃蛋白酶抑制剂A Asp蛋白酶1μg/mlPMSF Asp蛋白酶1mMEDTA 镁和锰金属蛋白酶1-5mMEGTA 钙金属蛋白酶1mM氟化钠丝氨酸和苏氨酸磷酸酶5-10mM原钒酸盐酪氨酸磷酸酶1mM焦磷酸盐丝氨酸和苏氨酸磷酸酶1-2mMβ-甘油磷酸盐丝氨酸和苏氨酸磷酸酶1-2mM（3）要加入loading buffer（BME、DTT，目的是减少蛋白高级结构的形成）主要成分主要功能SDS 使蛋白变性并带上负电荷BME或DTT 减少二硫键的形成溴酚蓝离子型染料，可观察蛋白迁移甘油增加样品密度，起沉降作用（4）煮沸变性：一般是99°C，10min，水浴锅煮沸时，防止EP 管盖弹开，使水浴锅内的水进入。

二、凝胶电泳（1）配胶。

这里说的都是SDS变性胶，先配分离胶，再配浓缩胶。

根据目标蛋白分子量的大小，选择合适的分离胶浓度，分子量越高，分离胶的浓度越低。

浓缩胶一般用的都是5%。

配胶时需注意以下几点：①玻璃板清洗后，为了使表面的水快速晾干，可以在烘箱中放置几分钟，拿出来的时候一定要晾到室温再灌胶，不然很容易产生气泡；②配胶用的试剂一般都是在4度冰箱保存，当我们按比例配好混合液的时候，要等混合液恢复室温时，再灌胶，不然也很容易产生气泡；③加水液封时，速度要慢，可用1ml枪沿着胶板上沿反复移动，不然很容易将分离胶冲变型。

Western blot(蛋白印迹法)详细步骤

Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。

②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。

③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。

④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。

注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。

2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。

3.每种样品都最好留有副管，备用。

二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。

②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。

注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。

三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。

③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。

④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。

⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。

Western Blot 操作原理步骤

Western Blot 操作原理步骤Western Bl...基本原理【动画】基本原理（点击播放）免疫印迹法（immunoblotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southen早先建立的检测核酸的印迹方法Southen blot相类似，亦被称为Western blot。

免疫印迹（western blotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。

它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。

典型的印迹实验包括三个步骤：①蛋白质的电泳分离②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域③免疫学检测。

免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。

免疫印迹法原理示意图第一阶段为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。

抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰酰凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。

此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。

第二阶段为电转移。

将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成。

此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。

第三阶段为酶免疫定位。

将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。

常用的HRP底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。

阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。

本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。

western blotting实验操作步骤讲解

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot, WB）WB是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。

WB 是进行微量蛋白质分析比较成熟的技术之一。

以下是总结Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。

A第一部分：蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：1.尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）；2.保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、表面活性剂、还原剂等的选择）；3.提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）；4.尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）；5.样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。

方法的选择◆自行配制抽提试剂，根据文献方法或经验提取；◆购买商品化试剂盒，按其说明书的方法提取。

Example 1：实验中提取肾脏总蛋白，具体实验过程如下：1.提前一天4℃解冻RIPA，一定要完全融化；配PBS（用于细胞试验则需高压）；2.配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM（根据样本数配制所需的量，临用临配）；3.裂解组织：每个样品称取100mg，加1ml裂解液，匀浆后4℃静置2h使其充分裂解，14000g，4℃离心10min，取上清。

4.蛋白定量：取少量上清稀释30倍蛋白定量，然后计算出各样本原液蛋白浓度。

注意由于裂解液里含有较高浓度的洗涤剂，蛋白定量不能选用Bradford法，可以选用改良的Lowry’s法或者BCA法。

5.样品蛋白浓度均一化：根据蛋白定量计算的结果将各样品蛋白浓度调整一致。

具体方法为加入PBS稀释至样品浓度一致，本次蛋白浓度为3mg/ml。

完整版WesternBlot免疫印迹法实验方法步骤

Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：n 样品制备n 电泳分离n 蛋白的膜转移n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6n 脱脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20）TBS/T封闭缓冲液（n1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn 一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。

抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。

n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。

Westernblotting蛋白免疫印迹实验

裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入150μL裂解液，若细胞密度非常高可以适当加大裂解液用量至200μL或250μL。
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3.1.2 蛋白含量测定
a).配制BCA工作液：根据标准品和样品数量，按50体积试剂 A,1体积试剂B配制适量BCA工作液，充分混匀。
b).将标准品、待测样品和工作液按下表加入到96孔板中，混
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1.2 蛋白免疫印迹的应用
• 检测样品中特异性蛋白质是否存在
例转：移李桂波 . 利用免疫印迹法钓取 P C 3 M 细胞中与人前列腺癌高相关特异性短肽结合蛋白的研究[D].吉林:吉林大学,2007.
• 对特异性蛋白质进行半定量分析
例：
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1.3 WB的原理
积。注意事项: • 过滤后4℃保存。 • 这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节pH值，而不用 Tris-HCL。 ④转移缓冲液：
2 . 9 g 甘氨酸、 5 . 8 g Tr i s 碱、 0 . 3 7 g S D S ，并加入 2 0 0 m L 甲醇，加水至总量 1 L 。
匀。
管号试剂(μL)
空白
标准管
管 1×3 2×3 3x3 4×3 5×3
6×3
测定管 ×2
蛋白质标准液 (1mg/mL)
0
1
2
4
6
8
10
—
蒸馏水(μL) 10 9
8
6
4
2
0
—
待测样(μL) — — —
—
—
—
—
10
BCA工作液 (μL)
200
200

Western Blotting 全攻略

由于生物素是一个小分子蛋白，一个抗体上可以结合多个生物素，也就可以结合多个酶连接
的凝集素，可以大大增强显色反应的信号。
除了使用抗体或蛋白作为检测特定蛋白的探针以外，有时也使用其它探针如放射性标记
的 DNA，可以检测印迹中的 DNA 结合蛋白。
[主要试剂]
1、SDS-PAGE 试剂： 2、匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2ml； ddH2O 2.8ml。 3、转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇 200ml；加 ddH2O 定容至 1000ml。 4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加 ddH2O 至 1000ml。 5、膜染色液：考马斯亮兰 0.2g；甲醇 80ml；乙酸 2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉 1.0g 溶于 20ml 的 0.01M PBS 中。 6、显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺 0.1ml；H202 1.0μl。 7、兔抗猪 R 蛋白抗体、HRP 标记羊抗兔 IgG（二抗）。
酶可以以 H2O2 为底物，将 3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将 4-氯萘酚氧化成蓝色产
物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在 H2O2 存在
下，氧化化学发光物质鲁米诺（luminol，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下
光强度可以增大 1000 倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存
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CH2
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最详细的Western_Blot过程步骤详解

Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答） Western免疫印迹(Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测.对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。

本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术：一、原理二、分类i.放射自显影ii。

底物化学发光ECLECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题5。

Marker的相关疑问6。

染色的选择7.参照的疑问8。

缓冲液配方的常见问题9。

条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色"用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分.该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。

只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺,应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺）的去离子水配制含有29％（w/v)丙稀酰胺和1%(w/v）N，N'—亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N,N—亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。

蛋白印迹——western-blot-实验流程及注意事项

蛋白印迹——Western blot实验流程及注意事项各种凝胶电泳方法可以直接了解蛋白的某些性质如迁移率、电荷、大小、丰度以至蛋白的亲疏水性等。

此外，特异染色方法可用于识别不同种类的蛋白质。

Western blot技术大大扩展了凝胶电泳后识别和鉴定蛋白的可能性。

这一技术首先将电泳分离后的蛋白质条带或斑点从凝胶介质转移到固相支持膜上，然后用特异性配体进行检测。

特异性抗体和凝集素等已被广泛应用检测印迹膜上的蛋白。

印迹技术还常常作为电泳分离后用化学方法（如蛋白氨基端序列分析等）鉴定蛋白的一个重要步骤。

一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE或SDS-PAGE）聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。

聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。

催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。

化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。

在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。

不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。

浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCL。

分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCL。

WesternBlot蛋白免疫印迹原理实验步骤流程WBFAQ@德泰生物

WesternBlot蛋白免疫印迹原理实验步骤流程WBFAQ@德泰生物Western Blot原理Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

SDS-PAGE可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。

固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

转移后的NC膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脱脂奶粉溶液）处理，封闭NC膜上的疏水结合位点。

用目标蛋白的抗体（一抗）处理NC膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。

用一抗处理过的NC膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。

处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。

Western Blot实验试剂及仪器1.试剂准备（1）甲醇（2）转移缓冲液（Tris5.8g 甘氨酸2.9g SDS 0.37g 甲醇200ml V=1L）（3）一抗，二抗（4）PBST，PBS，Tween-20（5）显影液（5X）：自来水（加热至50℃） 375ml （以下药品加到温水中）米吐尔1.55g，亚硫酸钠（无水）22.5g，碳酸钠（无水）33.75g，溴化钾 20.95g，补水至 500ml（6）定影液：自来水（50～60℃）700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）硫代硫酸钠240g，亚硫酸钠（无水）15g，冰乙酸12.6ml，硼酸7.5g，钾明矾15g（水温冷至30℃以下时再加入），加水定容至 1000ml，室温保存2. 材料准备转膜用的夹子，两块海绵垫，一支滴管，两张滤纸，一张PVDF 膜，转膜槽，转移电泳仪，摇床，计时器，磁力搅拌器，转子，Western blot 盒，一块SDS-PAGE胶，脱脂奶粉实验步骤(一) 配胶1.将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。

westernblotting法

westernblotting法Western blotting法，也被称为蛋白质免疫印迹法，是一种常用的分析蛋白质的实验方法。

它通过将样本中的蛋白质经过电泳分离、转移到膜上、与抗体结合并通过化学发光的方式来检测目标蛋白质的存在与表达水平。

本文将一步一步回答关于Western blotting法的主题。

第一步：制备样品和蛋白质电泳分离Western blotting法的第一步是制备样品和将样品中的蛋白质进行电泳分离。

首先，需要从感兴趣的细胞或组织中提取蛋白质。

常见的提取方法包括细胞裂解、超声破碎、冻融破碎等。

然后，将提取的蛋白质样品加入电泳缓冲液中，通过电荷差异使蛋白质在凝胶中进行分离。

一般常用的凝胶包括聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）和琼脂糖凝胶（Agarose gel）。

电泳的结果将会得到不同大小和电荷的蛋白质带。

第二步：蛋白质转印蛋白质电泳分离结束后，需要将分离出来的蛋白质转移到膜上。

常用的膜包括聚偏氟乙烯膜（Polyvinylidene difluoride membrane，PVDF）和硝酸纤维素膜（Nitrocellulose membrane，NC）。

这一步使用电泳盒装置将凝胶与膜的间隙设置好，然后将电流施加，使蛋白质从凝胶中转移到膜上。

通过此步骤，蛋白质在膜上形成与电泳凝胶相似的蛋白质“印迹”。

第三步：蛋白质与抗体结合转印到膜上的蛋白质需要与特异性的抗体结合，以便检测目标蛋白质的存在。

这一步通常被称为免疫染色。

首先，将膜上的非特异性结合位点阻塞，通常使用的是蛋白质溶液，如牛奶粉或鸡蛋清。

然后，将特异性抗体加入到膜上，与目标蛋白质结合。

这些抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，由于抗体的特异性，只有特定的蛋白质才能与其结合。

第四步：蛋白质检测Western blotting法最后一步是检测蛋白质和目标蛋白质的表达水平。

这通常通过使用化学发光的方法来实现。

常见的检测方法包括辣根过氧化物酶检测和碱性磷酸酶检测等。

蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项

蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项实验方法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。

5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸 2 ml；ddH2O118 ml。

western印迹法原理和流程

western印迹法原理和流程英文回答：Western blotting: Principle and procedure.Western blotting is a technique used to detect specific proteins in a sample of tissue or cells. It is based on the principle of antigen-antibody recognition.The first step in Western blotting is to separate the proteins in the sample by electrophoresis. This is done by running the sample through a gel, which separates the proteins based on their size and charge.The proteins are then transferred from the gel to a nitrocellulose membrane. This is done by placing the geland the membrane in a buffer solution and then applying an electrical current. The proteins will migrate from the gelto the membrane, where they will bind to the nitrocellulose.The next step is to incubate the membrane with a primary antibody. The primary antibody is specific to the protein that you are interested in detecting. The antibody will bind to the protein on the membrane.The membrane is then washed to remove any unbound antibody.The next step is to incubate the membrane with a secondary antibody. The secondary antibody is specific to the primary antibody. The secondary antibody will bind to the primary antibody, and it will also be labeled with an enzyme.The membrane is then washed again to remove any unbound secondary antibody.The final step is to add a substrate to the membrane. The substrate will react with the enzyme on the secondary antibody, and this will produce a colored product. The colored product can be visualized using a scanner or a chemiluminescence detection system.中文回答：Western 印迹法，原理和流程。

蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤

蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。

平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。

重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。

将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。

4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。

（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。

（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。

二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。

蛋白质免疫印迹（WesternBlot）实验步骤和原理及注意事项

蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot）实验步骤和原理及注意事项蛋⽩质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋⽩样品(Protein sample preparation)可以使⽤适当的裂解液。

收集完蛋⽩样品后，为确保每个蛋⽩样品的上样量⼀致，需要测定每个蛋⽩样品的蛋⽩浓度。

根据所使⽤的裂解液的不同，需要采⽤适当的蛋⽩浓度测定⽅法。

因为不同的蛋⽩浓度测定⽅法对于⼀些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很⼤。

BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋⽩样品中加⼊适量浓缩的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液。

使⽤5X的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液可以减⼩上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋⽩样品。

100℃或沸⽔浴加热3-5分钟，以充分变性蛋⽩（根据蛋⽩分⼦的⼤⼩，煮沸时间可适当变化，⼀般不低于5min。

煮沸只是变性蛋⽩，⽽不是分解，⼀般加了抑制酶不会分解。

煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋⽩质的⽴体⼆级结构,伸展为⼀维线性结构,所以⼀般来讲⼆聚体都会解体,才能完全按照分⼦量跑电泳,加的蛋⽩Marker才有指⽰分⼦量的意义。

蛋⽩样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋⽩呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离⼼5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另⼀管,4度可以放⼀周备再次电泳）。

(3)电泳i.清洗玻璃板：⼀只⼿扣紧玻璃板，另⼀只⼿蘸点洗⾐粉轻轻擦洗。

两⾯都擦洗过后⽤⾃来⽔冲，再⽤蒸馏⽔冲洗⼲净后⽴在筐⾥晾⼲。

ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放⼊夹中卡紧。

然后垂直卡在架⼦上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）（2）配10%分离胶，加⼊TEMED后⽴即摇匀即可灌胶。