流式细胞分析分选原理

光路
流路
流式细胞分析分选原理
流路
• 单细胞悬液 • 大多数仪器是在50-300 µm 大小的孔径中,
将细胞悬液注射进入鞘液中 • 这一过程,成为流体动力学聚焦
流式细胞分析分选原理
FLOW CELL
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
• 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检 测)这些光学信号
流式细胞分析分选原理
荧光染料的特性 •激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
流式细胞分析分选原理
Fluorescence emitted by each fluorochrome is usually detected in a unique fluorescence channel.
• SS用于检测细胞内部结构 如:胞浆内颗粒多流少式细胞, 分核析分质选原理比
侧向散射光
流式细胞分析分选原理
流式细胞分析分选原理
流式细胞分析分选原理
Light Scatter Gating
Side Scatter Projection
ForwardScater rPjoection
ForwardScater
水冷
Innova300系列
Innova70系列
固态
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检测信号
流式细胞分析分选原理
散射光信号—前向散射光(FS)
• FS----Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光 检测器
• FS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形 状及 optical homogeneity 有关
免疫荧光 橙红
PeCy5 488
675
免疫荧光 红
PI
488
620
DNA染色 橙红
PECy7 488
755
免疫荧光 深红
PerCP 488
670
APC
633
670
流式细胞分析分选原理
光路 - 滤片特性
• 当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过 一定波长的光,同时也可以阻断并折射该 波长以下的光
• 这种方式的滤片称为二向色性滤片 ( dichroic filter)
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标准带通滤片 band pass
630/30 nm BP
光源
通过的光谱
615-645 nm light
流式细胞分析分选原理
Байду номын сангаас
Source light
Absorbance filter
Certain colors absorbed
流式细胞仪与显微镜
光源 激光
自然光、灯光、氙(汞)灯
对象 细胞、生物粒子 承载工具 鞘液及流动室
细胞、生物粒子 载(盖)玻片
检测信号 光学信号 放大方式 PMT，放大电路
形态及染色 目镜X物镜
统计 结果
计算机，>5000 多参数，综合分析
人工，200 简单，单参数
流式细胞分析分选原理
流路
基本原理
流式细胞仪工作原理
流式细胞分析分选原理
流式细胞术的原理
• 流式细胞术（FCM）是一 种能对单个细胞、分子和 生物颗粒（微生物）进行 多参数快速检测的新型分 析和分选技术。近几年随 着多种单克隆抗体的成功 制备和多种荧光素的应用。 FCM逐步运用于对疾病诊 断和治疗监测的临床检验 常规工作。
流式细胞分析分选原理
流式细胞分析分选原理
Passed light
流式细胞分析分选原理
Range over which a fluorescence
Range of emitted wavelengths for
compound may be excited 流式细胞分析分选原a理particular compound
5 Color Single Laser (488nm)
FITC/PE/ECD/PC5/PC7
流式细胞分析分选原理
软件
电路/ 电子
光路
流路
流式细胞分析分选原理
光路
光源
检测信号 散射光信号 FS: 前向角散射光 SS: 侧向角散射光(90度散射光)
荧光信号 荧光染料 光学滤片 颜色补偿
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光路
• 光源 与通过的细胞聚焦在同一点上
• 激光
空冷
488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green,
• FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性
如:大小
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前向散射光
流式细胞分析分选原理
流式细胞分析分选原理
散射光信号 – 侧向散射光
• SS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称为90度散射光检测器
• SS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状 及 optical homogeneity 有关
流式细胞分析分选原理
4 Color Single Laser (488nm) FITC/PE/ECD/PC5
流式细胞分析分选原理
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途
颜色
FITC
488
525
免疫荧光 绿色
PE(RD1) 488
575
免疫荧光 橙色
ECD
488
620
Scale
1000 200 100 50 40 30 20 15 8
200
400
600
800
1000
0
Neutrophils
Monocytes
Lymphocytes
0 200
400
600
800
1000
90 Degree Scatter
流式细胞分析分选原理
光路-荧光信号
• 每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激 发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即 是它特定的发射波长.
The specificity of detection is controlled by the wavelength selectivity of optical filters and mirrors.
流式细胞分析分选原理
Absorption spectrum:
Emission spectrum:
• 流动室 • 鞘液SHEATH • 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml
光路
• 光源 • 检测信号 • 光电倍增管PMT HV
电路
• 放大电路HV及GAIN 增益 • A/D转换
• 统计：计算流机式细胞分析分选原理
流式细胞仪
光路
流路
电子
流式细胞分析分选原理
软件
软件
电路/ 电子