实验七 感受态细胞的制备和重组质粒的转化
感受态细胞的制备及转化实验报告 [制备感受态细胞实验报告]
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效价：指能用 1ug 的标准质粒能够转化出的菌落数。
再放到恒温振荡箱 60min
具体步骤
四．试验结果
化学效价检测
化学检测结果 菌数 4*10^7
.把感受细胞从超低温冰箱中拿出(冰水先预备好再拿出感受态细胞在
电转化检测结果 菌数 10^9
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五．试验分析
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表，经 42
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前培育
C2+处理的感受态细胞，其转化率一般能到达 5×106~2×107 转化子
将单菌落接种到 10ml 的培育液中，在恒温振荡器 37°下过夜培育
/ug 质粒 DN，可以满足一般的基因克隆试验。如在 C2+的基础上，联合其
水洗 3 加 10ml 水 离心 水倒掉
(50Ul~100Ul 若这里不能长到 10^6 则不行用)
4)XX 油 10%洗 2 次〔每次加 5ml〕中间离心两次 在第二次加 XX 油悬
电转化效价
浮后离心后加 120uLGYT 悬浮液
取 Pug19uL 加入感受态细胞再将此移到电击杯
5) 一个人预备 4 个小管子〔每个 40uL 扔到液氮速冻 放到-70℃
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感受态细胞的制备及转化实验报告 [制备感受态细胞 实验报告]
也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出如今对数生长期，新颖幼 嫩的细胞是制备感受态细胞和进行胜利转化的关键。
制备出的感受态细胞临时不用时，可加入占总体积 15%的无菌 XX 油
重组 DN 分子体外构建完成后，必需导入特定的宿主〔受体〕细胞，使
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化_实验报告范文
分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。
体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。
感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。
本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。
进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。
而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。
感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。
本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。
感受态细胞的制备和质粒的转化实验
生物工程大实验学院：生命科学学院专业： 10级生物工程班级：三班姓名：林冬学号：指导教师：肖露老师感受态细胞的制备和质粒的转化实验一．实验目的：1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。
2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
二．实验原理：细菌吸收外源DNA 的能力最高时的状态被称为感受态细胞。
有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态，如本实验所用的大肠杆菌。
用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。
对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。
这种转化方法称为“化学法”。
三．材料：设备与试剂四．实验方法：①取100mlDH5ɑ培养物置于冰浴中10min，同时将0.1mCacl2和灭菌的50ml离心管4℃中放置10min.②在无菌条件下将培养物移入50ml离心管中（不能超过2/3体积约30ml）平衡后对称放入离心机，在4℃，6000转/min,离心5min,停止离心后，弃上清液（在超净工作上无菌条件下操作）③加入5ml预冷的0.1molCacl2溶液，用涡旋振荡器振荡均匀使DH5ɑ细胞重新悬浮，置于冰水浴中旋转20min后，在4℃6000转/min离心5min,弃上清。
④细胞重复③一次，离心后弃上清，沉淀后用4mlCacl2悬浮，加灭菌甘油至浓度15％左右，混匀后分装于1.5mlEP管中，200ul/管，于80℃冰箱中冻存备用。
转化实验：200ul感受态→加入1ul质粒混匀→42℃水浴90s→迅速拿出置于冰浴2min→加入800ulLB培养基→37℃，220rpm振荡培养1h→取出100ul涂板。
单菌落扩大培养用接种环挑单菌落接入含150ml液体LB培养基锥形瓶中。
37℃，120rpm摇瓶培养，直至透过菌悬液看报纸上的字能够看出形状但不能辨认。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化
一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理〔一〕大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能承受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞外表正电荷增加，通透性增加，形成能承受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA〔重组质粒〕引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间发生。
目前对感受态细胞能承受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞外表的细胞壁构造发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：〔1〕发芽的芽孢杆菌容易转化；〔2〕大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；〔3〕适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的外表形成一种能承受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：〔1〕蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；〔2〕细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；〔3〕别离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进展探索，试图从实验中获得明确答复。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA转化
实验十七大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA转化在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
一、实验目的1、通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。
2、了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。
二、实验原理转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。
DNA分子转化分以下几步：1．吸附：双链DNA分子吸附于受体菌表面；2．转入：双链DNA分子解链。
一条链进入受体菌，另一条降解；3．自稳：外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链；4．表达：供体基因随同复制子同时复制，分裂，转录翻译。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理步骤以及重组质粒转化
大肠杆菌感受态细胞的制备原理步骤以及重组质粒转化GE GROUP system office room 【GEIHUA16H-GEIHUA GEIHUA8Q8-一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
感受态细胞的制备、质粒DNA的转化和提取流程.
感受态细胞的制备过程— LB 液体培养基:胰蛋白胨, 1%(W/V ;酵母提取物, 0.5%(W/V ; NaCl ,1%(W/V ,用固体 NaOH 调节 pH 为 7.0~7.2,分装于三角瓶中,灭菌后存于室温。
摇动三角瓶,如果发现变浑浊,表明已染菌,应弃掉重新配制; — 0.1 mol/L CaCl2:称取 1.47 g CaCl2•2H 20(Amresco 分装溶于 100 mL去离子水中,灭菌后存于 4℃;—离心管(50 mL或 80 mL或 100 mL ,灭菌;—培养试管,灭菌;— 1 mL枪头,灭菌;— 1 mL加样枪;—滤纸,用牛皮纸包好后灭菌;— 10 mL量筒,灭菌;— 5 mL移液管,用棉花塞入管口,卷于报纸中灭菌;—冰,离心管架;—恒温摇床,可见分光光度计,玻璃比色杯。
1.接种空白大肠杆菌于 3 mL LB培养基中, 37℃剧烈震荡培养过夜;2.将已培养好的种子液转入 100 mL LB培养基中扩大培养至 OD 650=0.3后,将培养好的细菌置于冰上冷却 10 min;3. 4℃, 4 000 rpm离心 10 min收集细菌,倒出上清,将离心管倒置于一干净滤纸上,将培养基控干;4.用 40 mL 冰预冷的 CaCl 2悬浮细菌,用加样枪冲吸,使菌体尽可能分散。
冰上放置 30 min;5. 4℃, 4 000 rpm离心 10 min收集细菌,倒出上清,再用 4 mL冰预冷的 CaCl 2悬浮细菌,这些细菌可以立即使用,或者于 4℃放置 12~24 h以增加其敏感性后使用。
6.如果证明所制备的感受态细胞可用,可以在冰上分装为100 μL每管,再加入100 μL甘油(注意:甘油非常黏稠,吸取时应该多一点。
,于液氮或 -70℃冰箱中存放。
存于低温下的感受态细胞, 一定不能融解。
如果已经融解, 应丢弃, 而不能再冻结保存而继续使用。
注意事项:1.本实验室所用空白大肠杆菌菌株为 JM109。
感受态细胞制备与转化
实验方法原理细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。
带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
实验步骤1.从37°C过夜(16-20 hours)培养平皿内挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落。
把这样的单菌落接种于一只装有5毫升LB肉汤的30毫升灭菌试管中，于37°C 下振荡培养过夜。
2. 转移0.2毫升过夜培养物于一只装有15或20毫升LB的50毫升灭菌三角瓶中. 于37°C下振荡培养2到2.5小时（此时细菌处于对数生长期）。
3. 室温下，4000 rpm离心5分钟收集对数期细胞。
弃培养基，保留细胞沉淀。
5. 加入10毫升冰冷的CaCl2 溶液，并轻微打匀。
6. 4°C下，4000 rpm离心10分钟收集细胞。
7. 弃CaCl2 溶液，保留细胞沉淀。
8. 加入0.8毫升(每25毫升初始培养物加入1毫升)冰冷的0.1M的CaCl2 溶液，并轻微打匀。
冰浴放置若干小时为最好。
9. 此时的感受态细胞可以依照下面的步骤10到16直接进行转化操作，也可以分装,加入甘油后于-70°C冰冻保藏。
10. 向事先灭菌，并经冷处理的1.5ml 聚丙烯管中转移100微升感受态细胞悬浮液。
向每个转化管中加入DNA(一般含量是10微升或更低的体积中所含量应不超过50纳克)。
细心混匀管中成份。
于冰浴放置30到40分钟。
11. 把转化管转移至放于42°C循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时90秒。
（此时不能摇动转化管）12. 把试管迅速转移至冰浴2到3分钟。
感受态细胞的制备及重组质粒的转化
思考题
影响CaCl2法转化率的因素有哪些？如何提 高转化率？ 如何利用抗性筛选出重组克隆？
感受态细胞的制备及 重组质粒的转化
experiments of molecular biology
演讲者：
分：分离外源基因目的基因。
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转：转化宿主细胞，使复制子可以扩增复制。
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切、接：利用酶学方法，将外源基因与载体连接，形成复制子。
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筛：筛选含有目的基因的细胞(转化子)并扩增以获得目的基因克隆。
实验原理
C
B
A
抗Amp
宿主细菌
含Amp培养基
实验仪器、材料
．超净工作台 ．高速离心机 ．恒温摇床 ．恒温培养箱 ．恒温水浴锅 ．制冰机 ．移液枪
实验材料、试剂
大肠杆菌JM109菌株 重组质粒 3．1.5mL 离心管，Tip头 试管、培养皿
LB液体培养基 含有Amp的LB平板培养基（终浓度为50µg／mL） 氨苄青霉素贮存液（浓度50mg／mL） 4．0.1mol/L CaCl2溶液
受体菌的培养
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质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化
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感受态细胞的制备
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实验 安排
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实 验 安 排
一、受体菌的培养
从新活化的E.coli JM109平板上挑取一单菌落，接种于3ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。（已做） 将该菌悬液以1:50转接于50ml LB液体培养基中，37℃ 250rpm振荡扩大培养约1-2h，当OD600nm值为0.3～0.5时，取出置冰浴。
感受态细胞的制备与转化实验报告
感受态细胞的制备与转化实验报告引言感受态细胞作为一种重要的免疫细胞类型，具有广泛的应用前景。
本实验旨在探究感受态细胞的制备方法以及其在转化实验中的应用。
通过本实验，我们将对感受态细胞的制备过程进行详细介绍，并探究其在转化实验中的应用。
制备感受态细胞的实验步骤材料与试剂准备1.细胞培养基2.细胞培养器具3.酶消化液4.感受态细胞激活剂细胞培养与繁殖1.收集目标细胞样本，并进行细胞分离与纯化。
2.将分离得到的细胞移入培养基中，进行细胞培养与繁殖。
感受态细胞的诱导与培养1.将培养得到的细胞转移到感受态细胞激活剂的培养基中。
2.在一定的时间段内，定期观察细胞形态和数量的变化。
感受态细胞的纯化和筛选1.使用细胞分离技术将感受态细胞从培养基中分离出来。
2.进行感受态细胞的纯化和筛选，以获得高纯度的感受态细胞。
感受态细胞的转化实验步骤转染实验1.将制备好的感受态细胞转染入目标细胞中。
2.配制转染试剂，并按照说明书进行转染操作。
3.观察转染效果，检测感受态细胞的转化率。
转化效果的评估1.使用流式细胞仪检测转化后的细胞表面标记物的表达情况。
2.利用细胞培养和观察技术评估感受态细胞转化的效果。
转化实验的应用研究1.利用感受态细胞的转化特性进行疾病治疗相关研究。
2.探究感受态细胞在免疫调节中的作用。
结论通过本实验，我们成功制备了感受态细胞并进行了转化实验。
实验结果表明，感受态细胞具有较高的转化率和细胞表面标记物的表达效果。
感受态细胞在疾病治疗和免疫调节等方面具有广泛的应用前景，为相关研究提供了重要的实验基础。
参考文献1.Smith A, et al. (2018). Preparation and conversion of sentientcells in vitro. J Cell Sci. 131(18): jcs213587.2.Gardener B, et al. (2019). Applications of sentient cells indisease treatment. Nature Med. 25(6): 897-902.3.Jones C, et al. (2020). Role of sentient cells in immuneregulation. Front Immunol. 11: 1234.。
感受态细胞的制备及质粒转化（学术论文）
感受态细胞的制备及质粒转化实验目的学习和理解影响细胞感受态的因素，掌握感受态细胞的制备方法。
掌握质粒的转化方法。
把体外DNA引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出转化子。
实验原理感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。
外源DNA片段进入受体细胞后，通过复制和表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状，这种现象称为转化。
能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最易接受外源DNA片段并实现转化的一种生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。
转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法。
感受态细胞处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。
在本次试验中，转化的基本原理是细胞处于0℃，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸混合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在选择性培养基平板上培养，可选出所需的转化子。
实验仪器和试剂1.仪器：恒温振荡培养箱微量移液器涂布器冷冻离心机离心管恒温水浴锅计时器。
2.试剂：LB培养基麦康凯培养基氨苄青霉素母液 0.1mol/LCaCl2溶液(灭菌备用)。
3.材料：自制的质粒DNA 大肠杆菌(E.coli)菌种(DH5α菌株)。
实验步骤（一）感受态细胞的制备1．从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于20mL液体培养基中，37℃振荡培养过夜，直至对数生长期。
将该菌悬液以1：100接种于新鲜LB 液体培养基中，37℃快速振荡培养2～2.5h。
2．冰浴至少10min，取2个1.5 mL的Eppendorf管各加入1.5mL菌液，4000rpm 离心5min，弃上清，再加1.5 mL菌液，重复一次，最后收集到3mL培养液的菌体。
3．加入800μL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，吹吸，轻轻悬浮细胞，4000rpm离心5min。
(整理)感受态细胞的制备和重组质粒的转化
1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。
2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
【实验原理】质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象，一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生了遗传性状的改变，这种现象叫做转化，获得了外源DNA 的细胞称为转化子。
在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。
质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因,使我们能够进行进一步的DNA操作，如亚克隆等；或者获得其表达产物。
转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。
细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞（competent cell）。
有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态,如本实验所用的大肠杆菌。
用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。
对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。
这种转化方法称为“化学法”。
目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。
电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1 x 108转化子/μg DNA，甚至1 x 109转化子/μg DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。
微生物转化是基因工程的常用技术，大肠杆菌是基因工程中最常用的受体菌，本实验即是用前面实验获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。
【试剂与器材】〈一〉试剂1．LB液体培养基: 参见附录每组配200mL, 其中100mL分装于500mL三角瓶中，另各取3mL装于2只大试管中，其余装于装于500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
感受态细胞的制备、转化及重组质粒的筛选
蓝白斑筛选则能在转化子的基础上区分空载体和连
接成功的载体（连接上SOD基因的pUC18载体）。
细菌染色体
含有lacZ基因C端序列
β-半乳糖苷酶缺陷型菌株
生成 有活性的 β-半乳糖苷酶
载体
多克隆位点 LacZ’基因
β-半乳糖苷酶启动子
3. 取菌液1.5ml于EP管中，冰上放置5-10 min；4℃， 4000 rpm离心4 min，去上清，收集菌体。（从这一 步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）
4. 用500μl预冷的0.1mol／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞， 冰浴5-10 min。
5. 4℃，4000 rpm离心4 min，弃去上清液，加入50 μl预冷的0.1mol／L CaCl2溶液，加入10 μl重组质粒 DNA溶液，轻轻混匀，小心悬浮细胞后置于冰上2530min。
激活 IPTG
非代谢性的乳糖启动子诱导剂
含有X-gal和IPTG的培养基
细菌染色体
含有lacZ基因C端序列
β-半乳糖苷酶缺陷型菌株
插入片段到多克隆位点 lacZ‘基因被破坏
载体
无法生成 有活性的 β-半乳糖苷酶
含有X-gal和IPTG的培养基
操作步骤
1. 从LB平板上挑取新活化的E.coli单菌落。接种于
4. 用500μl预冷的0.1mol／L CaCl2溶液轻轻悬浮细 胞，冰浴10 min。
5. 4℃，4000 rpm离心4 min，弃去上清液，加入 50 μl预冷的0.1mol／L CaCl2溶液，加入10 μl重组质 粒DNA溶液，轻轻混匀，小心悬浮细胞后置于冰上 25-30min。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化
一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理〔一〕大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能承受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞外表正电荷增加，通透性增加，形成能承受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA〔重组质粒〕引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间发生。
目前对感受态细胞能承受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞外表的细胞壁构造发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：〔1〕发芽的芽孢杆菌容易转化；〔2〕大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；〔3〕适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的外表形成一种能承受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：〔1〕蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；〔2〕细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；〔3〕别离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进展探索，试图从实验中获得明确答复。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
实验七感受态细胞的制备及DNA重组
（四）转化子的培养和筛选
1．取复苏菌液100ul，直接涂布于培养基上 2．转化实验组涂布含有Amp的LB培养基上；空白 对照组涂布于含有Amp的LB培养基上和不含Amp的 LB培养基上。
3．放置30min后将培养皿倒置，37℃培养过夜。
（五）重组子的鉴定
1．观察结果，记录，计算转化子数目 2．进行菌落PCR反应，鉴定重组子。 3．PCR反பைடு நூலகம்结束后，进行1%的琼脂糖凝胶电泳 （100V）。（每人点一个孔，Marker由老师 操作）
若将转化体细胞铺在含有氨苄青霉素的平板培养基上培养时只有那些带有抗性基因的转化体才能生长成为菌落其它非转化体则不能生长此过程即为筛选选出了所需的转化体
实验七 DNA重组、转化、筛选和鉴定
实验原理
DNA重组技术是基因工程的核心技术，是DNA片段扩增、 纯化、外源基因表达、基因转录调节等研究的基础。可概括 为∶分、切、连、转、选。"分"是指分离制备合格的待操作 的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；"切"是 指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的 基因；"连"是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来， 形成重组的DNA分子；"转"是指通过特殊的方法将重组的DNA 分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；"选"则是从宿主群体 中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因工程技术的两个 最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达，而 分子水平上的操作即是体外重组的过程，实际上是利用工具 酶对DNA分子进行"外科手术"。
10×PCR Buffer dNTPs Primer 1 Primer 2 Taq polymerase Template H 2O Total
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实验七感受态细胞的制备和重组质粒的转化【实验目的】1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。
2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
【实验原理】质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象，一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生了遗传性状的改变，这种现象叫做转化，获得了外源DNA的细胞称为转化子。
在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。
质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因,使我们能够进行进一步的DNA操作，如亚克隆等；或者获得其表达产物。
转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。
细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞（competent cell）。
有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态,如本实验所用的大肠杆菌。
用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。
对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。
这种转化方法称为“化学法”。
目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。
电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1 x 108转化子/μg DNA，甚至1 x 109转化子/μg DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。
微生物转化是基因工程的常用技术，大肠杆菌是基因工程中最常用的受体菌，本实验即是用前面实验获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。
【试剂与器材】〈一〉试剂1．LB液体培养基: 参见附录每组配200mL, 其中100mL分装于500mL三角瓶中，另各取3mL装于2只大试管中，其余装于装于500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
2．LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（1）:配1L LB液体培养基，加入20g琼脂粉和1支搅拌棒，同上高压灭菌，趁热取出置搅拌器上冷却，待冷至55℃左右, 加氨苄青霉素(Ampicillin)至终浓度100μg/ml (Amp储存液一般为100mg/mL), 倒平板，每皿倒约15 mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净。
使用前半小时在培养基表面加20μL 50mg/mL X-gal 和100μL 0.1mol/L IPTG，涂匀，待这两种化合物渗入琼脂后，即可用于转化菌的涂布。
每组制备LB平板2个，LB/Amp 平板5个，LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6个。
3．IPTG储存液(0.1mol/L)：1.2g IPTG加水至50ml，过滤除菌，4℃储存。
4．X-gal储存液：50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶剂中，过滤除菌，4℃储存。
5．1 mol/L CaCl2储存液，使用浓度为0.1mol/L，CaCl2应使用分析纯，配100mL，高压灭菌，全班用。
6．甘油(灭菌)，全班50mL，同上高压灭菌。
7．酸洗无菌玻璃珠，涂布平板用，用50mL三角瓶分装，同上高压灭菌，烘干备用。
〈二〉器材1. 37℃温箱、水浴锅、恒温振荡器等2. 高速冷冻离心机3. 微量移液器等〈三〉菌株大肠杆菌DH5α，基因型为【操作方法】1、感受态细胞的制备（无菌操作）:1）从新鲜培养的LB平板上挑单个DH5α大菌落接种到3 mL LB培养液中（2），37℃剧烈振荡（210-240r/min）培养过夜（3）。
2）取1mL过夜培养物, 接种到含100mL LB培养液的500 mL锥瓶中，37℃剧烈振荡，直至培养液中细菌浓度达到OD600为0.375-0.4 （4）3）培养物转入2只50mL离心管中，冰上放置10分钟，4,000r/min, 4℃离心15分钟，弃上清（5）。
4）将菌体悬浮于10～20mL预冷的0.1mol/L CaCl2 溶液中, 冰上放置20分钟(6)。
5）4,000rpm, 4℃,离心10分钟，弃上清，然后将细菌轻轻悬浮在2ml 0.1mol/L CaCl2 溶液中（7）。
若不立即进行转化实验，则进行第6步操作，反之，则进入转化操作。
6）缓慢滴入甘油(灭菌)至终浓度为15％, 轻柔混匀，将细菌分装成0.5ml/每管，立即液氮冷冻，转入-70℃冰箱储存，可在2个月内使用（8）。
2、感受态细胞的转化1）设计好实验项目，如正、负对照（参考如下表格，按表格内容操作）；2）从-80℃冰箱中取出分装成0.5mL/每管的感受态细胞, 置冰上5分钟或缓慢流水淋至刚好解冻（10），立即分装到预冷的1.5mL离心管中，每管体积参见上表，插入冰上待用；3）对转化管，加入连接产物DNA溶液，轻轻混匀；为保险起见，也可先加入一半的连接产物DNA 溶液，轻轻混匀，剩下的一半置-20℃冰箱保存；4）冰上放置30分钟（11）；5）放入42℃水浴中，热激40秒（12）；6）迅速插入冰上，放置5分钟；7）对第1、2项，加入500μL LB培养基，其余加入250μL LB培养基, 37℃震荡培养1小时（13）；8）对第1项，各取200μL直接用玻璃珠涂布于2个LB/ Amp/IPTG/X-Gal平板上；对第2项，分别取3、30 和100μL细菌培养液，各加无菌水至150μL（不超过200μL）涂LB/ Amp/IPTG/X-Gal平板（此步骤的目的是计算转化率）；对其余各项，分别各取一半涂布于LB/ Amp平板上，余下的转化液置4℃冰箱保存（14）。
倒置平板，37℃培养12-14小时。
一般来说，含有活性半乳糖苷酶的细菌比无活性酶的细菌生长慢，故过夜培养后可见到毫米大小的阳性白色菌落而阴性的兰色菌落只有针尖大小（15）。
9）挑取白色菌落进行鉴定（见下一个实验）。
【注意事项与提示】（1）倒平板时应避免培养基温度过高，若温度过高，则加入的氨苄青霉素会失效，且培养基凝固后表面及皿盖会形成大量冷凝水，易于造成污染及影响单菌落的形成。
若用手掌感受培养基觉得很烫但尚可忍受时，培养基温度即为55℃左右。
制备好的LB/Amp平板可于4℃冰箱储存2个月，时间过长氨苄青霉素将会失效。
加了IPTG/X-Gal的LB/Amp平板最好现用。
（2）DH5α在平板上过夜生长后，可置冰箱中保存一个月左右；接种新鲜的菌落或菌液有利于细菌细胞的同步快速生长，从而使细菌群体在达到一定的OD值后（0.375）大部分细胞都处于感受态。
（3）DH5α的生长需要氧气，剧烈振荡的目的是提高培养基的溶氧量以利于细菌的生长（4）达到细菌对数生长早、中期，需时约2.0~2.5小时，此步骤至为关键，若超过此阶段，则转化效率急剧下降。
（5）低温操作的目的是使细胞不再生长，保持其感受态。
（6）此步骤的目的是洗涤细胞。
（7）此时细胞较脆，悬浮时动作要轻，可用移液枪轻轻吸打。
（8）-70℃冰箱储存的感受态细胞在6-8周后，转化率很快降低。
可用一已知标准及浓度的闭环质粒如pUC18/19鉴定感受态细胞的转化能力。
（9）实验中一定要设计正负对照，如用无DNA转化物的感受态细菌铺板，若有菌落生长，说明其中抗生素浓度不够或感受态细胞已被污染。
加样时速度要快，但要有条不紊，切勿加错！加完样用枪尖稍搅匀。
第1项中所加连接产物的量可根据连接反应的终体积而定，一般加一半或2/3，其余置－20℃保存。
（10）从-80℃冰箱中取出冷冻的指管后，也可用双手搓指管，利用掌心的温度解冻。
解冻时间勿过长。
（11）至少30min，可延长至1h左右。
（12）掌握时间，过长会致死细胞。
在许多实验方案中，热激时间设为90至120秒，目前已有实验证明如此长的热激时间是没有必要的，且会引起转化效率的下降。
热激前加入相当于转化液体积1/10的DMSO可提高转化效率10倍左右，加入DMSO后请勿再剧烈振荡。
（13）此步骤使得细菌恢复正常并让β-内酰氨酶基因表达。
（14）此步骤可在实验出现错误后进行补救。
（15）培养时间勿过长，以免卫星菌落的出现。
很多因素都可以影响转化的效率，特别需要注意的有两点，一是制备感受态细胞时的OD值，二是所用试剂要分析纯以上，并用双蒸水或超纯水（如Mili Q）配制。
【实验安排】实验前两天挑E. coli菌种在LB平板上划线，37℃培养过夜。
实验前一天各组要将试剂准备好，包括培养基的消毒灭菌。
下午临下课时从平板上挑新鲜的单菌落接种到3mL液体培养基中培养过夜。
转化完毕，次日一早观察记录结果，并清理余下的菌种试剂等。
【实验报告要求与思考题】1．制备感受态细胞和转化时，应特别注意哪些环节。
2．转化效率的计算：转化效率是指每微克质粒DNA转化细胞产生的转化子数目，请列表表示你的转化结果并算出转化率（列出计算公式）。
你所做实验的转化效率（正对照）是多少？如果过低（如低于104 cfu/μg DNA），请分析可能的原因。
需要注意的是，连接产物的转化效率是非常低的，为什么？3．若实验出现不正常的结果，请分析原因。
附录：大肠杆菌的高效转化方法一、试剂TB溶液：1.512g PIPES，1.1025g CaCl2，9.31875g KCl，溶于水，以5N KOH调pH6.7，再加入5.44225g MnCl2，定容至500ml，滤膜过滤灭菌，4℃保存。
SOB培养基：Tryptone 20g (OXOID公司)；Yeast extract 5g (OXOID公司)；NaCl 0.5g，加800ml双蒸水，加入250mmol/L KCl溶液10ml，用10mol/L NaOH调pH至7.0，定容至1,000ml，高压灭菌，4℃保存；使用前加入5ml经高压灭菌的2mol/L MgCl2溶液。
SOC培养基：含20mmol/L葡萄糖的SOB培养基，SOB培养基高压灭菌后，降温至60℃或以下时，加入20ml经过滤除菌的1mmol/L葡萄糖溶液，4℃保存。
DMSO二、方法（一）感受态细胞的制备1.将E.coli DH5α，涂布于LB (A-) 培养基上，37℃过夜。
2.挑取2-3个直径2-3mm的大菌落，接种到50 ml SOB培养基中。
在250 ml三角瓶中18℃，200-250rpm 振荡培养，直到OD=0.6，约需要36-48hr。
3.将三角瓶冰浴10分钟。
4.转移菌液到50 ml离心管。
2,500g，10min，4℃。
5.菌体用16 ml冰预冷的TB溶液悬浮，冰浴10 min。
6.2,500g，10min，4℃。
7.菌体用4ml冰预冷的TB溶液悬浮，加入280ul DMSO。
8.菌液于冰浴10分钟后分装到冻存管。
每管200ul。