实验七 感受态细胞的制备和重组质粒的转化

实验七感受态细胞的制备和重组质粒的转化

【实验目的】

1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。

2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。

【实验原理】

质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象，一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生了遗传性状的改变，这种现象叫做转化，获得了外源DNA的细胞称为转化子。

在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因,使我们能够进行进一步的DNA操作，如亚克隆等；或者获得其表达产物。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞（competent cell）。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态,如本实验所用的大肠杆菌。用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。这种转化方法称为“化学法”。目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1 x 108转化子/μg DNA，甚至1 x 109转化子/μg DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。

微生物转化是基因工程的常用技术，大肠杆菌是基因工程中最常用的受体菌，本实验即是用前面实验获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。

【试剂与器材】

〈一〉试剂

1．LB液体培养基: 参见附录

每组配200mL, 其中100mL分装于500mL三角瓶中，另各取3mL装于2只大试管中，其余装于装于500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。

2．LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（1）:

配1L LB液体培养基，加入20g琼脂粉和1支搅拌棒，同上高压灭菌，趁热取出置搅拌器上冷却，待冷至55℃左右, 加氨苄青霉素(Ampicillin)至终浓度100μg/ml (Amp储存液一般为100mg/mL), 倒平板，每皿倒约15 mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净。使用前半小时在培养基表面加20μL 50mg/mL X-gal 和100μL 0.1mol/L IPTG，涂匀，待这两种化合物渗入琼脂后，即可用于转化菌的涂布。

每组制备LB平板2个，LB/Amp 平板5个，LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6个。

3．IPTG储存液(0.1mol/L)：1.2g IPTG加水至50ml，过滤除菌，4℃储存。

4．X-gal储存液：50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶剂中，过滤除菌，4℃储存。

5．1 mol/L CaCl2储存液，使用浓度为0.1mol/L，CaCl2应使用分析纯，配100mL，高压灭菌，全班用。6．甘油(灭菌)，全班50mL，同上高压灭菌。

7．酸洗无菌玻璃珠，涂布平板用，用50mL三角瓶分装，同上高压灭菌，烘干备用。

〈二〉器材

1. 37℃温箱、水浴锅、恒温振荡器等

2. 高速冷冻离心机

3. 微量移液器等

〈三〉菌株大肠杆菌DH5α，基因型为

【操作方法】

1、感受态细胞的制备（无菌操作）:

1）从新鲜培养的LB平板上挑单个DH5α大菌落接种到3 mL LB培养液中（2），37℃剧烈振荡（210-240r/min）培养过夜（3）。

2）取1mL过夜培养物, 接种到含100mL LB培养液的500 mL锥瓶中，37℃剧烈振荡，直至培养液中细菌浓度达到OD600为0.375-0.4 （4）

3）培养物转入2只50mL离心管中，冰上放置10分钟，4,000r/min, 4℃离心15分钟，弃上清（5）。4）将菌体悬浮于10～20mL预冷的0.1mol/L CaCl2 溶液中, 冰上放置20分钟(6)。

5）4,000rpm, 4℃,离心10分钟，弃上清，然后将细菌轻轻悬浮在2ml 0.1mol/L CaCl2 溶液中（7）。若不立即进行转化实验，则进行第6步操作，反之，则进入转化操作。

6）缓慢滴入甘油(灭菌)至终浓度为15％, 轻柔混匀，将细菌分装成0.5ml/每管，立即液氮冷冻，转入-70℃冰箱储存，可在2个月内使用（8）。

2、感受态细胞的转化

1）设计好实验项目，如正、负对照（参考如下表格，按表格内容操作）；

2）从-80℃冰箱中取出分装成0.5mL/每管的感受态细胞, 置冰上5分钟或缓慢流水淋至刚好解冻（10），立即分装到预冷的1.5mL离心管中，每管体积参见上表，插入冰上待用；

3）对转化管，加入连接产物DNA溶液，轻轻混匀；为保险起见，也可先加入一半的连接产物DNA 溶液，轻轻混匀，剩下的一半置-20℃冰箱保存；

4）冰上放置30分钟（11）；

5）放入42℃水浴中，热激40秒（12）；

6）迅速插入冰上，放置5分钟；

7）对第1、2项，加入500μL LB培养基，其余加入250μL LB培养基, 37℃震荡培养1小时（13）；8）对第1项，各取200μL直接用玻璃珠涂布于2个LB/ Amp/IPTG/X-Gal平板上；对第2项，分别取3、30 和100μL细菌培养液，各加无菌水至150μL（不超过200μL）涂LB/ Amp/IPTG/X-Gal平板（此步骤的目的是计算转化率）；对其余各项，分别各取一半涂布于LB/ Amp平板上，余下的转化液置4℃冰箱保存（14）。倒置平板，37℃培养12-14小时。一般来说，含有活性半乳糖苷酶的细菌比无活性酶的细菌生长慢，故过夜培养后可见到毫米大小的阳性白色菌落而阴性的兰色菌落只有针尖大小（15）。9）挑取白色菌落进行鉴定（见下一个实验）。

【注意事项与提示】

（1）倒平板时应避免培养基温度过高，若温度过高，则加入的氨苄青霉素会失效，且培养基凝固后表面及皿盖会形成大量冷凝水，易于造成污染及影响单菌落的形成。若用手掌感受培养基觉得很烫但尚可忍受时，培养基温度即为55℃左右。制备好的LB/Amp平板可于4℃冰箱储存2个月，时间过长