关于肠道病毒检测技术的研究

关于肠道病毒检测技术的研究

肠道病毒(EV)可引发多种感染，并且发病又多以综合征出现，病情轻重悬殊，婴幼儿患者可暴发严重心肌炎或重症肺炎，尤其新生儿期的暴发流行可致死亡。一种综合征可由不同病毒引起，同一种(型)病毒可以导致不同综合征是肠道病毒属病毒感染的普遍现象。患者感染肠道病毒后多数为亚临床表现，不易被发现，因此，有效而及时地作出病原学诊断难度较大。目前除脊髓灰质炎外，尚无疫苗可供预防，是当前严重影响人类健康的重要病原之一。现将近年来国内外有关肠道病毒检测技术研究进展综述如下。

1 病毒分离培养

利用组织培养技术从感染部位或传染源分离出病毒并鉴定其特异性血清型是病毒性疾病诊断的金标准。病人粪便标本是最常采集的标本，其他如咽拭子、脑膜炎患者的脑脊液、心包炎患者的心包积液、手足病患者的疱内渗出液、结膜炎患者的眼部分泌物等都是常用分离病原的标本。分离时所选用的细胞系都系人源或猴源的细胞，它们都具有肠道病毒受体，对所要分离的病毒敏感。常用的有Hep-2、Hela、巨核细胞(MK)和一些猴源的传代细胞如Vero等，肠道病毒能在敏感细胞中增殖并致细胞产生病变。病毒培养对缩短抗生素治疗和住院期有积极作用，其定型诊断对流行病分析有重要意义，但是，病毒的分离鉴定繁琐、费力、耗时，一般需要1周才能观察到细胞病理反应，且费用高、敏感性低，并需要较高的专业知识及实验室设备，更重要的是许多肠道病毒不能进行细胞培养，或者可以培养但不出现细胞病理效应，如柯萨奇A组病毒，往往贻误特异性治疗，同时对诊断某些肠道病毒血清型和脑膜炎的敏感性也欠佳，给临床诊断和快速检测工作带来困难和挑战[1]。

2 血清学鉴定

分离病毒和利用组合血清中和试验是对病毒定型的重要方法。肠道病毒的血清学鉴定中，一般单份血清抗体效价无意义，因为健康人血清中都有一定效价；而取双份血清检测，恢复期抗体效价呈4倍以上升高，有诊断意义，因此，多选用组合血清。此方法在检测中不适用于早期诊断，可作为回顾性诊断；且由于肠道病毒血清型别众多，临床使用检测价值有限，而多为流行病学采用[1]。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)捕捉法或间接法检测早期病人血清中的IgM和IgG抗体，是较常用的检测指标，尤其以柯萨奇B组病毒的感染诊断较多，病毒抗原可从心、脑、脾、胰、肝和胸腺等多器官检出。

3 PCR技术

由于各型肠道病毒具有共同基因组序列，因而PCR技术问世后即被用于检测肠道病毒。PCR 可检出几乎所有血清型。PCR检测材料用量少、快速、灵敏度高且具特异性，并可通过设计不同的引物进行病毒分型，用于检测相当宽的肠道病毒血清型。EV-PCR一般可在收到标本后5～24h内提供诊断结果，是目前较理想的诊断技术[2]。EV-PCR比传统细胞培养法的检出率高。原因是不论病毒活性在标本处理过程中是否失活，或病毒增殖过程中形成的缺陷性病毒能否感染细胞而影响培养结果，其核酸相对稳定仍能被检出。Sawyter等、Rotbart等、Hamiltion等和Muir等分别报道PCR从脑脊液、血、尿、粪、咽拭标本中检出肠道病毒，其灵敏度达88%～100%，特异性为83%～97%。与细胞培养法比较，PCR检出率明显提高，估计敏感性增强10～1000倍。在临床检测方面，Manzara等用免疫学和分子生物学综合方法，从临床标本中检测肠道病毒，并予以定型。Kellogg等人建立的RT-PCR-DNA酶免疫法(RT-PCR-DEIA)，可进一步缩短检测时间，其特点是用一种对热稳定的rTh聚合酶代替转录酶和Taq聚合酶，用地高辛-dUTP标记终产物，然后用微孔杂交法验证，所需时间不到4h。Jean等发展了基于核酸序列扩增的酶联免疫吸附法(NASBA-ELISA)， Nijhuis等利用肠道病毒属基因组5′端的高度保守序列设计引物，能够检测出肠道病毒属的所有血清型，并且与RNA科其他属(肝炎病毒属、副埃可病毒属)病毒无交叉反应，对来自临床的样本如血清、血浆、鼻咽拭物、脑积液等检测结果显示，其灵敏度与病毒的组织培养相当，甚至更好。使用TaqMan PCR具有自动化、易标准化的特点，使其可能成为病毒检测中组织培养的替代方法。

虽然肠道病毒感染后通常无症状而被忽略，但其普遍分布于世界各地，感染广泛存在，并且常引起暴发，导致数量比平常更多的病人发展成为临床病例，甚至死亡。因此，对肠道病毒的监测、检测应该给以足够重视。PCR等检测技术的发展使得从血清、心肌细胞、粪便、脑脊液、环境水中均能检测出肠道病毒基因组，为其诊断提供证据；同时，也为研究肠道病毒与疾病的关系提供大量科学数据。

参考文献

[1] Stefania M,Michele M,Giuseppina L R,et al.Molecular identification and typing of enteroviruses isolated from clinical specimens［J］.J Clin Microbiol,2002,40(12):4554-4560.

[2] Sawyer MH,Holland D,Aintablian N,et al.Diagnosis of enteroviral central nervous system infection by polymerase chain reaction during a large community outbreak［J］.Pediatr Infect Dis J,1994,13:177-182.