重组蛋白的表达系统
细菌的重组蛋白质表达系统
细菌的重组蛋白质表达系统蛋白质是构成生物体及细胞的重要组成部分,也是细胞功能的核心执行者。
为了研究和应用不同类型的蛋白质,科学家发展出了各种蛋白质表达系统。
其中,细菌的重组蛋白质表达系统是最常用的一种方法之一。
本文将详细介绍细菌重组蛋白质表达系统的原理、优势和应用。
一、原理细菌重组蛋白质表达系统利用细菌作为宿主来表达外源蛋白质。
这个系统主要包括以下几个重要组成部分:表达载体、宿主菌株、诱导系统和纯化方法。
1. 表达载体表达载体是指带有外源蛋白质编码序列的质粒。
这些质粒通常包括启动子、反义密码子和终止子等参与蛋白质表达的元件。
其中,启动子通过结合转录因子来启动蛋白质合成的过程。
反义密码子则能够增强蛋白质的长效稳定性,并促进其在细菌中的高效表达。
2. 宿主菌株宿主菌株在蛋白质表达系统中起到重要的作用,通常选择大肠杆菌作为宿主,主要因为大肠杆菌具有较高的生长速度、易于培养和常用的遗传工具。
此外,大肠杆菌本身产生的内切酶活性较低,有利于保护外源蛋白质的稳定性。
3. 诱导系统诱导系统是细菌重组蛋白质表达系统中的一个重要组成部分。
通常使用化学诱导或者温度诱导来启动表达载体中蛋白质编码序列的转录和翻译。
化学诱导通常通过添加一种诱导剂,如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),来激活载体中的启动子。
温度诱导则是通过改变培养温度来调节蛋白质表达。
4. 纯化方法纯化是细菌重组蛋白质表达系统中最关键的环节之一。
常用的纯化方法包括亲和纯化、碳水化合物基负载层析和凝胶过滤等。
这些方法能够根据蛋白质的特性和亲和性实现高效纯化。
二、优势与其他蛋白质表达系统相比,细菌重组蛋白质表达系统具有以下优势:1. 高效性细菌重组蛋白质表达系统是目前各种表达系统中最高效的一种方法之一。
通过优化表达条件和使用高效的诱导系统,可以实现高产量的蛋白质表达。
此外,细菌本身的生长速度也有助于高效表达。
2. 便捷性相比其他表达系统,细菌重组蛋白质表达系统的操作更为简便。
重组蛋白表达体系
目
CONTENCT
录
• 重组蛋白表达体系概述 • 重组蛋白表达体系的组成与构建 • 重组蛋白的表达方式与策略 • 重组蛋白的表达产物检测与分析 • 重组蛋白表达体系的挑战与解决方
案 • 重组蛋白表达体系的未来展望
01
重组蛋白表达体系概述
定义与重要性
定义
重组蛋白表达体系是指通过基因工程技术,将外源基因在宿主细 胞中表达并产生相应蛋白质的过程。
提高表达产物的产量与纯度
高密度培养技术
01
通过优化培养条件,提高宿主细胞的生长密度,从而提高重组
蛋白的产量。
蛋白质纯化技术
02
利用先进的蛋白质纯化技术,如亲和色谱、离子交换等,提高
重组蛋白的纯度。
蛋白质折叠与修饰
03
研究蛋白质折叠与修饰机制,优化重组蛋白的稳定性与功能。
重组蛋白表达体系在生物医药领域的应用前景
01
02
03
04
药物研发
利用重组蛋白表达体系生产具 有生物活性的药物,如单克隆 抗体、酶抑制剂等。
疫苗研发
通过表达病原体抗原或相关蛋 白,用于疫苗的研制和生产。
疾病治疗
利用重组蛋白表达体系生产具 有治疗作用的蛋白质,如生长 因子、细胞因子等。
生物材料
利用重组蛋白表达体系生产具 有特定功能的生物材料,如蛋 白质支架、纳米颗粒等。
表达产物的纯化问题
总结词
表达产物的纯化是重组蛋白表达体系中的另 一个挑战,它涉及到如何有效地分离和纯化 目标蛋白。
详细描述
表达产物的纯化问题通常与目标蛋白的溶解 性、稳定性以及与其他蛋白质的相互作用有 关。为了解决这一问题,研究人员可以采用 多种纯化方法,如离子交换、凝胶过滤、亲
重组蛋白真核表达系统构建流程
重组蛋白真核表达系统构建流程蛋白质是生物体内具有重要生物学功能的分子,它们由氨基酸组成,对细胞的结构和功能起着重要的调控作用。
在生物科学研究和生物制药工业中,重组蛋白质的生产和表达是一个重要的研究领域。
真核系统是重组蛋白质表达的一个重要平台,它具有许多优点,如能够实现复杂的蛋白修饰和折叠等。
因此,构建真核表达系统是生物科学研究和生物工程应用中的一个重要课题。
一、选取重组蛋白质的编码序列在构建真核表达系统之前,首先需要选取重组蛋白质的编码序列。
这一步骤通常是通过将目标蛋白质的编码基因进行克隆和序列分析来完成的。
在进行基因克隆过程中,需要选择适当的限制性内切酶和载体,构建一个含有目标基因的重组质粒。
同时,对目标基因的序列进行分析可以帮助确定转录和翻译起始位点、信号肽序列、保守结构域等信息,这些信息对于真核细胞的表达和翻译过程具有重要意义。
二、选择适当的真核表达宿主真核表达系统可以选择多种宿主来进行表达,包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母等。
在选择表达宿主时,需要考虑到宿主细胞的生长特性、表达能力、蛋白修饰能力等因素。
不同的宿主对于重组蛋白质的表达和折叠能力有所差异,因此需要根据目标蛋白质的性质和需求来选择合适的宿主。
通常来说,哺乳动物细胞系统是真核表达系统中最常用的宿主之一,它具有较高的蛋白修饰和折叠能力,适合用于表达复杂的蛋白质。
三、构建真核表达载体在选择了合适的宿主后,需要构建一个含有目标基因的真核表达载体。
真核表达载体通常包括启动子、转录终止子、筛选标记基因等功能元件。
通过将目标基因插入到表达载体中,可以实现对目标基因的调控和表达。
同时,表达载体还可以包括一些辅助元件,如信号肽、翻译起始位点、融合标签等,以提高重组蛋白质的表达水平和纯度。
四、转染或转化真核细胞在构建了真核表达载体后,需要将其转染或转化到真核细胞中。
转染是指将外源DNA通过化学方法导入到细胞内,而转化则是通过质粒介导的方式将外源DNA导入到细胞内。
重组蛋白的表达系统(详细版)
终止子:转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的作用分为两类,这两类终止子均在终止点前含有一段7-20bp的回文序列。终止子可以保护mRNA在核外不被降解,显著延长mRNA的寿命,由此提高重组蛋白的表达量。但是对于T7系统来说,由于T7 RNA聚合酶效率极高,宿主中随时都有充足的mRNA以供翻译,因此大部分在T7系统中表达的重组蛋白并不在意质粒上是否有终止子,只有一些自身带有翻译起始信号的外源基因需要终止子。启动子受细胞类型的限制,在不同的细胞系中有很大不同,因此需根据宿主细胞(尤其是真核宿主)的类型选择不同的启动子以便于目的基因的高效表达。
表4:常用原核表达载体质粒
1.3 优化表达条件
重组蛋白的表达流程很少有一次成形的,为了提高蛋白表达量、改善蛋白质量,表达条件和白不表达时:
2
如果重组蛋白不表达(包含体和可溶蛋白都没有),首先检查cDNA和质粒是否正确,蛋白对宿主菌是否有很大毒性,然后尝试更换菌株、质粒载体和融合标签。原核蛋白在大肠杆菌中不能表达的情况很少见,通常是真核蛋白不能表达。不能表达的重组蛋白,即使在更换了宿主、载体后可以表达,表达量也不会很高,如果需要大规模生产,最好尝试酵母和昆虫细胞表达系统。
融合标签:融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽,方便重组蛋白的纯化、固定和检测,表3给出了常用的重组标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化,尽量不要引入融合标签,以免影响蛋白性质;如果重组蛋白本身能够结合某种亲和柱,如某些金属结合蛋白可以结合Ni-NTA,某些糖结合蛋白能够特异识别糖类,也不必引入标签。融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程,并提高蛋白溶解度。商业化表达质粒,如pET、pGEX等提供了各种纯化标签和融合蛋白供选,应根据蛋白具体情况进行选择。His-tag是最常用的纯化标签,它具有很多优点:标签较短(10-20个氨基酸残基),不带电(pH8.0),免疫原性差,通常不影响重组蛋白的结构和功能,Ni2+亲和力高,能够通过一步纯化达到60%-90%的纯度。如果蛋白质溶解度不高,导致折叠困难、表达量低,可以选择较大的融合标签(GST、MBP、Trx等)帮助重组蛋白表达和折叠,提高重组蛋白溶解度,从而提高表达量。较大的融合标签有时也会导致翻译困难甚至提前中止,纯化后发现大部分都是标签蛋白也是常见现象。翻译的提前中止会大大影响重组蛋白产率和后续纯化,所以在短标签能够达到目的的时候,尽量不要选择大的融合标签。标签位置的选择也很重要:N端标签(短的或长的)自身带有启动子和适应宿主偏好的密码子,可以帮助目的蛋白表达,提高表达量,但是提前中止翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来,降低重组蛋白纯度,对蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一级序列中有集中的疏水残基区的蛋白尤其要避免使用N端标签;C端标签则可以保证只有完整蛋白得到纯化。另外,如果蛋白的近N端或近C端有重要功能区,如酶活中心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界面、相互作用界面等,则要避免纯化标签位于该末端,以免影响重组蛋白的结构和功能。如果融合标签对蛋白性质有较大影响,但又是纯化所必须的,就可以考虑在纯化过程中去除标签。主要有三种方法:化学裂解,如溴化氰(CNBr)、羟胺(NH2OH)等,能够简单有效地去除标签,但反应条件苛刻(羟胺需要在pH9.0下反应),特异性较差,而且会引入不必要的修饰,除包含体蛋白的处理外已经很少使用了;酶解,如PPase等,其底物一般是一段比较长的肽链,特异性强,是目前比较常用的方法,缺点是酶切反应需要较长的时间,也增加了蛋白纯化的步骤,使纯化变得繁琐;IMPACT质粒,该质粒在纯化标签和目的蛋白之间插入了一个蛋白质内含子(intein),intein具有可诱导的自切割活性,使用IMPACT质粒表达的重组蛋白,只需要改变缓冲液的pH和温度,即可切掉融合标签。
研究高效蛋白质表达的技术和方法
研究高效蛋白质表达的技术和方法蛋白质是生物体内功能最为重要的分子之一,控制着细胞的生理过程。
研究蛋白质表达的技术和方法,对于深入了解蛋白质功能以及相关疾病治疗具有重要意义。
本文将介绍几种高效蛋白质表达的常用技术和方法。
一、刺激蛋白质表达的条件在进行蛋白质表达之前,首先需要确定适当的表达条件。
刺激蛋白质表达最常用的方法之一是通过诱导表达来增加蛋白质的合成量。
常用的诱导剂包括 IPTG、甘油和丙酮酸等。
此外,还可以根据表达蛋白的特性来选择合适的表达宿主和培养条件。
二、重组蛋白质表达系统重组蛋白质表达系统是一种常见的高效表达蛋白质的方法。
目前广泛应用的系统包括大肠杆菌表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
1. 大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统是最常用的蛋白质表达系统之一。
其优点在于操作简便、蛋白质产量高、成本低等。
大肠杆菌表达系统可以利用原核细胞内丰富的蛋白质合成机器进行表达,常见的载体系统包括pET、pGEX等。
2. 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统利用昆虫细胞进行外源蛋白质的表达。
此系统适合表达复杂、大型蛋白质,且具有较高的蛋白质折叠和翻译后修饰能力。
常用的昆虫细胞包括sf9和S2等。
3. 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是表达重组蛋白质的黄金标准。
相比于其他表达系统,哺乳动物细胞能够正确地翻译和修饰蛋白质。
常见的哺乳动物细胞包括CHO、HEK293等。
三、蛋白质表达的改进方法除了选择适当的表达系统外,还可以通过一些改进方法来提高蛋白质表达的效率和产量。
1. 信号肽优化信号肽是控制蛋白质合成和定位的重要序列。
通过对信号肽序列的优化,可以提高目标蛋白质的合成量和稳定性。
2. 确定适当的宿主菌株不同的大肠杆菌宿主菌株对蛋白质表达效果有差异。
在进行蛋白质表达之前,选择合适的宿主菌株能够提高表达效率。
3. 调节表达体系中其他环境因素除了上述方法外,还可以通过调节表达体系中其他环境因素,如温度、基因拷贝数、培养基组成等来提高蛋白质表达效率和产量。
重组蛋白质的表达与纯化技术
重组蛋白质的表达与纯化技术蛋白质是生命体活动的重要组成部分,对于生命体的生长、繁殖和免疫功能起着至关重要的作用。
而重组蛋白质则是利用基因工程技术,将人工合成的外源基因导入到特定的宿主细胞中,通过细胞表达和纯化技术得到的转录翻译产物。
这种技术不仅可以生产天然蛋白质,还可以生产人工合成的新型蛋白质,对于疾病的治疗和新药的研发有着重要的意义。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是获得大量重组蛋白质的重要方法。
选择适当的宿主细胞和表达载体是获得高水平表达的关键。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
1.大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统具有生长快、表达量高等优点,广泛应用于重组蛋白质的表达和纯化。
其表达载体主要有pET和pBAD两种,pET系统一般用于产生可以形成包涵体的重组蛋白,pBAD系统用于在分泌表达中产生滞留蛋白。
2.昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统包括SF9、Sf21、HighFive等细胞系,常用的表达载体为pIB/V5-His、pFastBac等。
昆虫细胞表达系统通常用于表达大分子蛋白质,如糖蛋白、膜蛋白等。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是目前表达规模最大、表达产物最接近人体蛋白质的一种表达系统。
其表达载体主要有pCDNA3.1、pCI 等,常用于表达与人体有关的蛋白质,如抗体、生长因子等。
二、蛋白质纯化技术蛋白纯化是重组蛋白质生产的重要环节,其目的是得到高质量的、纯度较高的蛋白质样品。
常见的纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、逆流式层析法等。
1.亲和层析法亲和层析法是指因与载体中固定的亲和剂相互结合而纯化目标蛋白质的一种方法。
亲和剂通常是与目标蛋白质有特异性结合作用的化合物,如亲和标签、酶底物、抗体等。
常见的亲和层析方法有亲和柱层析、亲和膜层析等。
2.离子交换层析法离子交换层析法是根据蛋白质带有正或负电荷的差异性进行分离的一种方法。
离子交换层析的柱填充物常为离子交换树脂,其一般分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种。
-重组蛋白疫苗的原理
-重组蛋白疫苗的原理
重组蛋白疫苗是通过将病原体特定的蛋白质基因导入表达系统中,利
用表达系统产生的复制病原体表面抗原蛋白质来诱导机体产生刺激免疫应
答的新型疫苗。
其原理大致如下:
1.确定目标蛋白:针对某一种病原体,需要确定其特定的蛋白质。
2.基因克隆:获得并克隆目标蛋白的基因,进行基因测序等操作。
3.表达系统选择:选择一个合适的表达系统来生产目标蛋白,如细菌
表达系统、酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。
4.表达目标蛋白:将目标蛋白质的基因导入到表达系统中,促使表达
系统将其转录和翻译成蛋白质。
5.纯化目标蛋白:将表达系统中产生的蛋白质纯化出来,去除杂质。
6.制备疫苗:将纯化的目标蛋白质形成疫苗,如植入或注射到机体中,诱导机体产生针对这种蛋白质的免疫应答。
7.提高免疫性:可添加佐剂等物质提高免疫应答。
重组蛋白发展历程
重组蛋白发展历程引言:重组蛋白是指通过基因工程技术将外源基因导入到宿主细胞中,并利用宿主细胞的生物合成系统来合成外源蛋白。
重组蛋白技术的发展为生物医药领域带来了革命性的变化,使得大量蛋白质药物得以生产和应用。
本文将从重组蛋白的起源开始,详细介绍重组蛋白的发展历程。
一、重组蛋白的起源20世纪70年代,科学家们发现,将外源基因导入到细菌中,可以通过细菌自身的生物合成系统合成外源蛋白。
这一发现引发了重组蛋白技术的诞生。
1978年,科学家Herbert Boyer和Stanley Cohen成功地将青霉素酶基因导入到大肠杆菌中,合成了第一种重组蛋白。
二、早期的重组蛋白技术早期的重组蛋白技术主要依赖于质粒载体。
质粒是一种环状DNA 分子,可以在细胞内自主复制。
科学家们将外源基因插入到质粒中,并将质粒导入宿主细胞中,通过宿主细胞的生物合成系统合成外源蛋白。
然而,早期的重组蛋白技术存在许多问题,如质粒稳定性差、表达效率低等。
三、重组蛋白技术的突破随着基因工程技术的不断发展,重组蛋白技术取得了重大突破。
1982年,美国食品药品监督管理局(FDA)批准了世界上第一种重组蛋白药物——人胰岛素。
这标志着重组蛋白技术正式进入临床应用阶段。
四、重组蛋白的表达系统为了提高重组蛋白的产量和纯度,科学家们不断探索新的表达系统。
除了细菌表达系统,还有酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等表达系统。
每种表达系统都有其优缺点,科学家们选择合适的表达系统来生产目标蛋白。
五、重组蛋白技术的应用重组蛋白技术的应用范围越来越广泛。
除了生产蛋白质药物外,还可以应用于农业、工业等领域。
重组蛋白技术在农业领域的应用主要包括转基因作物和重组疫苗的开发。
在工业领域,重组蛋白技术可以用于生产酶、抗体等生物制剂。
六、重组蛋白技术的发展前景随着生物技术的不断发展,重组蛋白技术的发展前景非常广阔。
研究人员正在不断探索新的表达系统,提高重组蛋白的产量和纯度;同时,通过蛋白质工程技术,可以对重组蛋白进行改造,增强其药效或改善其稳定性。
利用原核和真核系统在重组蛋白质表达中的比较
利用原核和真核系统在重组蛋白质表达中的比较当今生物科学领域中,蛋白质表达技术的发展一直备受关注。
利用原核和真核系统来重组蛋白质,是常见的两种方法。
这两种系统在蛋白质表达中有着各自的优势和适用范围。
一、原核系统的蛋白质表达原核系统主要指大肠杆菌(Escherichia coli,简称E.coli)等细菌,并且是最常用的蛋白质表达系统之一。
原核细胞具有复制速度快、易于培养、表达量高等特点,使其成为研究人员的首选。
在原核系统中,通常使用表达载体质粒将目标基因插入到细菌细胞中,并利用细菌自身的转录、翻译系统来实现蛋白质的合成。
在表达载体上,一般包含启动子、转录终止子、选择性标记等功能元件,以控制目标基因的表达和纯化。
原核系统的蛋白质表达具有高效、简便、经济等优势。
然而,由于原核细胞的风险素材含量高,存在内源性的蛋白质翻译后修饰机制有限等局限,某些复杂蛋白质的表达可能会受到限制。
二、真核系统的蛋白质表达真核系统主要指哺乳动物细胞(如CHO细胞)、昆虫细胞(如Sf9细胞)等,相对于原核系统,真核系统具有更接近生物体内蛋白质表达的环境,更能实现复杂蛋白质的表达。
在真核系统中,常用的蛋白质表达包括稳定转染和瞬时转染两种方式。
稳定转染是将目标基因整合到宿主细胞的基因组中,从而实现长期稳定的表达。
而瞬时转染则是将目标基因引入宿主细胞的质粒中,通过短时间高表达来获得大量蛋白质。
真核系统的蛋白质表达能够实现更多的翻译后修饰,如糖基化、磷酸化、乙酰化等。
这些修饰对于某些蛋白质功能的发挥至关重要。
此外,真核细胞中包含更多复杂的蛋白翻译机制和分子伴侣蛋白,有利于蛋白正确折叠和纯化。
然而,真核系统的蛋白质表达过程更为复杂,所需时间和成本也相对较高。
此外,真核细胞具有更严格的质控机制和蛋白降解系统,蛋白质的表达稳定性较差。
三、原核与真核系统的比较原核和真核系统的选择应根据具体的研究目的和需求。
如果目标是表达小分子量、水溶性和结构简单的蛋白质,原核系统是较好的选择。
pet经典质粒pet系统是有史以来在大肠杆菌中表达重组蛋白
pET经典质粒pET系统是有史以来在大肠杆菌中表达重组蛋白的功能最强大的系统,也是现今原核表达方面使用最广泛的系统。
该系统中,目的基因被克隆到pET质粒载体上,受强噬菌体T7转录及翻译信号控制;表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。
T7 RNA聚合酶机制十分有效:充分诱导时,几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白;诱导表达后仅几个小时,目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。
尽管该系统极为强大,却仍能很容易地通过改变诱导物的浓度来降低表达水平。
降低表达水平常用以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。
该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下,可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。
用不含有T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因,即可解决免因目的蛋白表达对宿主细胞的毒性造成的质粒不稳定难题。
两种T7启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统,使各种目的蛋白都能得以最优化表达。
可选质粒最经典的pET-28a, pET-30a和pET-32a质粒,应用最广,参考文献最多。
下表列出三个经典系列载体主要特性。
其中命名后带有(+)的载体含有f1复制区,可以制备单链DNA,适合突变及测序等应用。
pET-28a: T7lac启动子,高效及严谨型控制表达水平;N端His.Tag/T7.Tag融合标签,可利用His.Tag进行金属离子螯合层析纯化表达蛋白,也可利用T7.T ag融合标签进行基于抗体结合的亲和纯化;含凝血酶(Thrombin)蛋白酶切位点;pET-30a:T7lac启动子;N端His.Tag/S.Tag融合标签,可利用His.Tag进行金属离子螯合层析纯化表达蛋白,也可利用S.Tag融合标签进行亲和纯化及高灵敏度定量检测;含凝血酶(Thrombin)及肠激酶(Enterokinase)蛋白酶切位点;pET-32a:T7lac启动子;Trx融合蛋白表达载体,帮助表达蛋白形成二硫键,增加蛋白溶解性及活性;His.Tag/S.Tag融合标签。
重组蛋白的高效表达及纯化技术研究
重组蛋白的高效表达及纯化技术研究随着生物技术的发展,蛋白表达与纯化技术在医疗、工业以及科学研究等领域中扮演着越来越重要的角色。
其中,重组蛋白的高效表达及纯化技术是蛋白质学研究的关键环节之一。
本文旨在探讨目前被广泛应用的几种重组蛋白表达及纯化技术,以及它们的新进展与应用前景。
一、背景介绍重组蛋白指的是通过基因重组技术将人工合成的DNA片段引导到细胞中,使其在受到特定刺激后大量表达特定功能蛋白的一种新型蛋白质。
由于其具有高度专一性、易制备性以及更高的效力和安全性,越来越多的药物被开发为基于重组蛋白的生物制剂。
二、重组蛋白表达技术1. 原核表达系统原核表达系统是将DNA片段导入大肠杆菌等细菌中,在其形成菌落的过程中进行表达。
该系统的优点在于表达速度快、操作简便、表达产量高。
但同时,由于原核表达与真核细胞中的表达相比,它对于蛋白翻译辅助因子和蛋白修饰等生物特征的模拟程度较差,不利于蛋白的正确折叠,因此该系统表达的蛋白质通常需要经过重新折叠处理。
2. 原核表达系统与原核表达系统相比,真核表达系统更接近真实情况中的表达方式,对于全长的蛋白大多数时候能够实现正确的折叠。
在真核表达系统中,常用的系统包括昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌表达系统等。
其中,哺乳动物细胞表达系统能够实现高产量、高质量的蛋白质表达,因此被广泛应用于蛋白质制备。
三、重组蛋白纯化技术1. 亲和层析法亲和层析法是一种将目标蛋白质从混合物中分离出来的技术。
该技术的依据是一种特定的与目标蛋白质具有相互作用的配体分离柱。
在该技术中,目标蛋白质与配体分离柱上的特定功能团结合,非特异性的蛋白质能够在洗脱过程中被去除。
2. 总体分离法总体分离法是将目标蛋白从混合物中分离出来,采用离心、可溶性和非可溶性的分离方法。
其中,在采用可溶性分离的方式时,常用的方法有两相法、分配层析等。
四、新兴技术及应用前景近年来,3D打印技术的应用逐渐渗透到生物医疗领域,并开始用于制备组织工程器官和人造蛋白质等领域。
重组蛋白的表达与纯化技术研究
重组蛋白的表达与纯化技术研究随着基因工程和生物技术的发展,重组蛋白的表达及纯化技术在生物医药领域得到了广泛应用。
重组蛋白是通过将目标基因转移到宿主表达系统中,利用宿主细胞表达并合成特定蛋白的技术。
表达后的蛋白需要经过纯化、鉴定和活性分析,以确保获得高纯度和高活性的蛋白。
本文将介绍重组蛋白的表达与纯化技术研究的相关内容。
重组蛋白表达技术是通过将目标基因克隆到表达载体中,然后将表达载体转入宿主细胞中进行表达。
常用的表达系统包括大肠杆菌、酿酒酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
在选择表达载体时,需要考虑载体的复制数、启动子的强度和宿主细胞的适应性。
而在选择宿主细胞时,需要考虑宿主细胞的生长特性、表达能力以及宿主细胞的酶切位点等因素。
表达载体和宿主细胞的选择将直接影响重组蛋白的表达水平和纯化效果。
在重组蛋白的表达过程中,除了选择适合的表达系统外,还需要优化培养条件和表达工艺。
培养基的组成、培养温度、培养时间、诱导条件等因素都会影响蛋白的表达水平和纯度。
常见的优化方法包括调整培养基的成分、优化培养条件和诱导条件、构建工程菌株以及使用辅助因子等。
通过合理的优化,可以提高蛋白的表达水平和纯度,为后续的纯化工作奠定基础。
重组蛋白的纯化是确保蛋白质高纯度和高活性的关键步骤。
常见的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、逆流色谱和层流洗脱等技术。
亲和层析是通过目标蛋白与特异性结合剂之间的亲和力选择性地捕获目标蛋白。
离子交换层析是利用蛋白质与带电离子交换剂间的相互作用进行纯化。
凝胶过滤层析则是根据蛋白分子大小进行分离纯化。
逆流色谱和层流洗脱则是利用目标蛋白与静电荷间的相互作用进行分离。
通过合理选择和组合这些方法,可以获得高纯度和高活性的重组蛋白。
在纯化过程中,还需要进行蛋白质的结构鉴定和活性分析。
结构鉴定可以通过质谱分析、核磁共振、X射线晶体学等技术来实现。
活性分析则是通过特定的活性测定方法来验证蛋白的功能和活性。
哺乳动物细胞表达系统的特点
哺乳动物细胞表达系统的特点
哺乳动物细胞表达系统是一种常用的重组蛋白表达系统,具有以下特点:
1. 表达的蛋白具有正确的翻译后修饰:哺乳动物细胞能够对表达的蛋白进行正确的翻译后修饰,如糖基化、磷酸化、乙酰化等,使表达的蛋白更接近天然蛋白的结构和功能。
2. 蛋白表达量较高:相对于其他表达系统,哺乳动物细胞表达系统能够产生较高水平的重组蛋白。
3. 适用于分泌型蛋白的表达:哺乳动物细胞具有完善的内质网和高尔基体等细胞器,可以将表达的蛋白分泌到细胞外,适用于分泌型蛋白的表达。
4. 产物易于纯化:哺乳动物细胞表达的重组蛋白通常具有较高的纯度,因为它们可以被分泌到细胞外,从而简化了纯化过程。
5. 适合治疗性蛋白的生产:由于哺乳动物细胞表达的蛋白具有与人体自身蛋白相似的结构和功能,因此适合用于生产治疗性蛋白,如单克隆抗体、细胞因子等。
重组蛋白的表达系统详细版
优化培养条件:优化 培养温度、pH、营养 物质等条件,提高重 组蛋白的表达水平。
开发更高效的亲和层析技术,提高目标蛋白的纯度和回收率。 引入连续层析技术,缩短纯化时间和降低成本。 利用蛋白质结晶技术,提高重组蛋白的结晶效率和纯度。 开发新型的蛋白去垢剂和清洗剂,减少对重组蛋白的损害和污染。
添加标题
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添加标题
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常用方法:离心、过滤、沉淀、亲 和层析等
注意事项:避免蛋白降解和活性丧 失
重组蛋白用于蛋白质晶体学研究,解析蛋白质结构 重组蛋白表达系统能够高效表达和纯化蛋白质,提高晶体学研究效率 通过重组蛋白表达系统,可以生产具有生物活性的蛋白质,用于药物筛选和开发 重组蛋白表达系统在蛋白质晶体学研究中具有广泛的应用前景,为生命科学研究提供有力支持
载体构建:选择合适的载体分子,将重组DNA分子插入到载体分子中,形成重组载体。
转化:将重组载体导入受体细胞中,使目的基因在受体细胞中复制和表达。
克隆筛选:通过筛选和鉴定,从众多的转化子中选育出含有目的基因的阳性克隆。
宿主细胞类型:原核细胞、真核细胞、昆虫细胞等 选择依据:表达产物的纯度、表达量、安全性等 转化方法:电击法、化学法、显微注射法等 转化后筛选:抗性筛选、互补筛选等
重组蛋白表达系统用于生产抗 体药物
高效、可重复的抗体药物研发 过程
重组蛋白表达系统在抗体药物 研发中的优势
抗体药物的种类和应用领域
用于研究病毒结构、功能和 传播机制
重组蛋白表达系统在疫苗生 产中的应用
用于开发新型疫苗和治疗策 略
提高疫苗产量和纯度,降低 生产成本
用于研究蛋白质 之间的相互作用, 帮助科学家更好 地理解生命活动 的本质和疾病的
发生机制。
基因工程的下游技术重组蛋白的表达、纯化和分析
2. 亲和层析柱的安装 把层析柱固定在铁支架上,柱下端出 口封闭。加入少量的无离子水,排去下端 的空气泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝胶 4mL到烧杯中,加入少量的无离子水制成 糊状,沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状凝 胶倒进柱内,打开下端的排水口,让亲和 凝胶剂随水流自然沉下。亲和层析剂为 45mL。
3. 1#:接50μL空载工程菌(含pUC18)过夜培 养物,25-28℃培养10 h-12h; 2# :接 50μL 重组菌(含 pGFPuv )过夜培养 物,25-28℃培养10 h-12h; 3#:接50μL重组菌(含pGFPuv )过夜培养 物, 37℃培养至 O.D600 约为 0.5 (约 3h-4h) , 然后加入20%葡萄糖50μL至终浓度为0.2%, 及100mM IPTG 5μL至终浓度为0.1mM,2528℃培养8h-10h或过夜; 6#:接500μL重组菌(含pGFPuv)过夜培养 物, 37℃培养至 O.D600 约为 0.5 (约 3h-4h) , 然后只加入 100mM IPTG 50μL 至终浓度为 0.1 mM,25-28℃培养8h-10h或过夜。
一.实验目的 了解和掌握IPTG诱导表达的原理。 了解降解物阻遏的现象及其机理。
二.实验原理
操纵子是基因表达的协调单位。通常由2 个以上功能相关的结构基因以及一些调节 序列(如启动子序列、操纵序列等)组成。
乳糖操纵子由三个结构基因 Z 、 Y 、 A 和 操纵序列、启动子、 CAP 结合位点等调 节序列组成。
四.实验仪器
超净工作台、 恒温摇床、离心机等。
五.操作步骤 1. 挑取含pUC18质粒工程菌及含pGFPuv质 粒工程菌单菌落,分别接种于含氨苄青霉 (终浓度为100μg/mL,以下同)的5mL的 LB培养基中,于37℃、250rpm过夜培养 12h-14h至对数生长期。 2. 取 3 支已灭菌的大试管,分别加入 5mL 含 有氨苄青霉素的 LB 培养液,编号为 1# , 2#,3#,另取一个250mL的灭菌三角瓶, 编号为6#,加入50mL含氨苄青霉素的 LB 培养液。
重组蛋白的表达系统
添加 标题
昆虫细胞表达系统:以Sf9和Bm5细胞为代表优点是 能够进行真核翻译后修饰表达的蛋白具有生物活性; 缺点是操作较为复杂且表达量有限。
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哺乳动物细胞表达系统:以CHO和HEK293为代表 优点是能够高度模拟真核生物的翻译后修饰表达的蛋 白具有高度生物学活性;缺点是操作复杂成本高且表 达量有限。
宿主细胞的选择与培养
宿主细胞的选择:根据重组蛋白的特性选择适合的宿主细胞如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺 乳动物细胞等。
宿主细胞的培育:通过培养基和生长条件的优化提高宿主细胞的生长速率和蛋白表达水平。
宿主细胞的遗传改造:通过基因敲除、基因沉默等技术手段对宿主细胞进行遗传改造以实现重 组蛋白的高效表达。
重组蛋白表达系统的分类
添加 标题
原核表达系统:以大肠杆菌为代表优点是操作简便、 成本低适用于大规模生产;缺点是表达的蛋白缺乏真 核生物特有的翻译后修饰且表达量不稳定。
添加 标题
酵母表达系统:以酿酒酵母和毕赤酵母为代表优点是 能够进行真核翻译后修饰表达的蛋白具有生物活性; 缺点是表达量相对较低且产物大多为包涵体。
宿主细胞的反应条件:通过调节温度、pH、营养物质等反应条件实现对重组蛋白表达过程的精 细控制。
重组蛋白的表达诱导与检测
诱导方法:使用诱导剂诱导目的基因的表达 检测方法:通过免疫印迹法、荧光检测等技术检测目的蛋白的表达情况 目的:验证重组蛋白表达系统的可行性 意义:为进一步研究重组蛋白的结构和功能奠定基础
重组蛋白表达系统的改进方向
优化宿主细胞:选择更合适的宿主细胞以提高重组蛋白的表达水平和产量。 基因工程改造:通过基因工程手段对重组蛋白进行改造以提高其表达效率和稳定性。 添加分子伴侣:利用分子伴侣的作用提高重组蛋白的折叠效率和分泌能力。 开发新型表达系统:不断探索和开发新型的表达系统以克服现有表达系统的限制和不足。
关于重组人血白蛋白的系统性表述
盛年不重来,一日难再晨。
及时宜自勉,岁月不待人。
关于重组人血白蛋白的系统性表述人血白蛋白(HSA)作为一种重要的临床急救药物及重要的药物辅料,在医药,科研及化妆品生产等领域应用广泛。
随着国内医疗水平及居民收入水平的提升和对血液制品认知度的提高,血液制品的临床使用量不断增加,市场容量不断增长,行业快速发展。
根据国家医药管理局的报告,2010年全国16城市医院血液系统用药金额约62亿元,其中白蛋白类药物占据了血液制品的主要份额(大于50%)。
但作为一种血液制品,HSA同时也面临原料短缺及病毒污染等缺陷的影响。
用基因工程重组人血清白蛋白(rHSA)替代HSA是国际上公认的最有前途的高新技术途径。
一.什么是重组人血白蛋白1.定义通过基因重组的技术将目的蛋白的基因克隆后,将该基因插入到某种生物(如细菌、酵母、植物,哺乳动物细胞等)中进行复制,然后收集的白蛋白称为重组人血白蛋白。
2.rHSA的等级分类按不同的质量标准分为了培养基级、药用辅料级和药用注射级(药用级)三类,三类级别的重组人血白蛋白生产工艺相同,但最终控制参数不同,药用级白蛋白质量标准最高。
3.rHSA的表达系统分类白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)是一组复杂的大分子蛋白质,必须经过正确的折叠、组装和翻译后修饰,才能赋予其特定的结构和功能,表达系统是重组人血白蛋白生产过程中极其重要的环节。
(1)原核表达系统HSA基因最早就是在原核生物大肠杆菌(E.coli)中表达成功的,Lawn等于1981年首次报道了rHSA的cDNA序列并首次构建了第一个表达rHSA的表达载体pHSA,然后在E.coli中表达成功,表达量为细胞总蛋白的7%,但E.coli表达系统体外很难正确折叠和组装结构复杂的HAS,缺乏翻译后的修饰和加工,表达的蛋白多形成包涵体,且纯化较难,所以未能得到有生物功能的蛋白,细菌细胞壁脂多糖还会造成热反应。
因为HSA在原核生物中表达量不高且分泌效果不够理想,所以研究的重点转向其在真核生物细胞中的表达。
重组人ZAP70蛋白表达系统说明书
Product datasheetRecombinant Human ZAP70 protein ab1528111 图像描述产品名称重组人ZAP70蛋白表达系统Wheat germAccession P43403蛋白长度Protein fragment无动物成分No性质Recombinant种属Human序列WSYGVTMWEALSYGQKPYKKMKGPEVMAFIEQGKRMECPPECPPELYALMSDCWIYKWEDRPDFLTVEQRMRACYYSLASKVEGPPGSTQKAEAACA预测分子量36 kDa including tags氨基酸523 to 619技术指标Our Abpromise guarantee covers the use of ab152811 in the following tested applications.The application notes include recommended starting dilutions; optimal dilutions/concentrations should be determined by the end user.应用SDS-PAGEWestern blotELISA形式Liquid补充说明Protein concentration is above or equal to 0.05 µg/µl.制备和贮存稳定性和存储Shipped on dry ice. Upon delivery aliquot and store at -80ºC. Avoid freeze / thaw cycles.pH: 8.00Constituents: 0.31% Glutathione, 0.79% Tris HCl功能Plays a role in T-cell development and lymphocyte activation. Essential for TCR-mediated IL-2production. Isoform 1 induces TCR-mediated signal transduction, isoform 2 does not.组织特异性Expressed in T- and natural killer cells.疾病相关Defects in ZAP70 are the cause of selective T-cell defect (STD) [MIM:176947]. STD is anautosomal recessive form of severe combined immunodeficiency characterized by a selectiveabsence of CD8-type T-cells.序列相似性Belongs to the protein kinase superfamily. Tyr protein kinase family. SYK/ZAP-70 subfamily.Contains 1 protein kinase domain.Contains 2 SH2 domains.结构域The SH2 domains bind to the phosphorylated tyrosine-based activation motif (TAM) of CD3Z andthe non-canonical phosphorylated tyrosine-based activation motif (TAM) of RHOH.翻译后修饰Phosphorylated on tyrosine residues upon T-cell antigen receptor (TCR) stimulation. Tyr-319phosphorylation is essential for full activity.细胞定位Cytoplasm. Cell membrane. After antigen stimulation, isoform 1 concentrates at theimmunological synapse and isoform 2 remains cytoplasmic. Co-localizes together with RHOH inthe immunological synapse. RHOH is required for its proper localization to the cell membrane andcytoskeleton fractions in the thymocytes.SDS-PAGE - Recombinant Human ZAP70 protein (ab152811)12.5% SDS-PAGE analysis of ab152811 stained with Coomassie Blue.常规信息图片Please note: A ll products are "FOR RESEA RCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIA GNOSTIC PROCEDURES"Our Abpromise to you: Quality guaranteed and expert technical supportReplacement or refund for products not performing as stated on the datasheetValid for 12 months from date of deliveryResponse to your inquiry within 24 hoursWe provide support in Chinese, English, French, German, Japanese and SpanishExtensive multi-media technical resources to help youWe investigate all quality concerns to ensure our products perform to the highest standardsIf the product does not perform as described on this datasheet, we will offer a refund or replacement. For full details of the Abpromise, please visit https:///abpromise or contact our technical team.Terms and conditionsGuarantee only valid for products bought direct from Abcam or one of our authorized distributors。
大规模蛋白质表达研究的方法和技术
大规模蛋白质表达研究的方法和技术随着生物医学研究的不断深入,对蛋白质的兴趣也越来越浓厚。
蛋白质的表达研究成为了近年来热门的研究领域之一。
本文将重点介绍大规模蛋白质表达研究的方法和技术,以帮助读者更好地了解和应用于实际研究。
一、重组蛋白质表达系统重组蛋白质表达系统是大规模蛋白质表达研究中最常用的方法之一。
该系统利用真核或原核细胞来表达目标蛋白质,通过转染、转化等方式将外源基因导入细胞中,从而实现大量蛋白质的表达和纯化。
常见的重组蛋白质表达系统包括大肠杆菌、酵母等。
大肠杆菌表达系统具有高表达效率、操作简便等优点,适合于大规模表达和纯化蛋白质。
而酵母表达系统则适用于复杂蛋白质的表达和折叠,因其能够实现真核细胞级别的蛋白质表达。
二、蛋白质结构预测和模拟技术蛋白质结构的预测和模拟是大规模蛋白质表达研究中必不可少的一步。
通过结构预测和模拟技术,研究人员可以了解蛋白质的三维结构、功能以及相互作用方式,为后续的功能研究和药物研发提供重要参考。
常用的蛋白质结构预测和模拟技术包括蛋白质同源建模、分子动力学模拟等。
蛋白质同源建模通过比对已知结构蛋白质与目标蛋白质的序列相似性,用已知结构蛋白质的结构模板来推测目标蛋白质的结构。
而分子动力学模拟则通过模拟蛋白质分子的运动行为,从而研究蛋白质的结构和性质。
三、蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用是蛋白质功能调控的关键环节,研究蛋白质相互作用可以揭示蛋白质的功能机制和信号传递网络。
随着研究技术的不断发展,越来越多的方法被应用于蛋白质相互作用的研究。
蛋白质亲和纯化技术是蛋白质相互作用研究中常用的一种方法。
该方法通过蛋白质之间的特异性结合来分离纯化目标蛋白质及其相互作用蛋白质。
常用的蛋白质亲和纯化技术包括免疫共沉淀、亲和色谱等。
另外,蛋白质结构冷冻电镜技术也成为研究蛋白质相互作用的重要工具。
该技术能够在近原子分辨率下探究蛋白质复合物的结构,揭示蛋白质相互作用的机制。
四、蛋白质组学研究技术蛋白质组学研究技术是大规模蛋白质表达研究中的新兴领域。
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• 表达菌株:
• 毕赤酵母的表达菌株都是由野生型石油酵 母NRRL-Y11430改造而来,含有一种或几种 营养缺陷(如his4、arg4等)以方便筛选 (表6)。研究发现,敲除了AOX基因的菌 株有时能更好的表达外源蛋白,而且诱导 所需的甲醇量也大大降低了。按照AOX基因 的敲除情况和利用甲醇的能力,毕赤酵母 表达菌株可以分为3类:在甲醇培养基中快 速生长的Mut+;敲除了AOX1,在甲醇培养 基中慢速生长的MutS和敲除了两个AOX基因, 不能利用甲醇的Mut-。不同的表型可以用来 检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合
• 酿酒酵母作为表达菌株具有一定的局限性, 如缺乏强有力的启动子,重组蛋白产率往 往只有全细胞蛋白的5%左右;难于高密度 培养;分泌效率低,几乎不分泌分子量大 于30 kD的外源蛋白,有时蛋白只被分泌到 周至空间而非培养基中;重组蛋白容易过
2.1.2 毕赤酵母(P. Pastoris)表达系统
• 毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母,可以依 赖甲醇作为唯一碳源生长,甲醇可以诱导 代谢所需的酶的表达。目前发现的所有甲 醇营养型酵母,其甲醇代谢途径都是相同 的,甲醇首先被乙醇氧化酶(AOX)氧化, 生成甲醛和过氧化氢。为了避免过氧化氢 毒害细胞,这步反应在过氧化物酶体中进 行。在毕赤酵母中,AOX有两个编码基因: AOX1和AOX2,其中AOX1基因编码了细胞内 绝大多数的乙醇氧化酶。AOX1的表达受AOX
其重组蛋白产率能够达到细胞总蛋白量的 15-30%。araBAD启动子的诱导剂是便宜无 毒的L-阿拉伯糖,本底表达量低,启动能力 比tac稍弱。T7则是目前原核表达系统中最 高效的启动子,pET表达系统即是以它为中 心构建的。T7启动子来源于λ噬菌体,专一
• 终止子:
• 转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的 作用分为两类,这两类终止子均在终止点 前含有一段7-20bp的回文序列。终止子可以 保护mRNA在核外不被降解,显著延长 mRNA的寿命,由此提高重组蛋白的表达量。 但是对于T7系统来说,由于T7 RNA聚合酶 效率极高,宿主中随时都有充足的mRNA以 供翻译,因此大部分在T7系统中表达的重 组蛋白并不在意质粒上是否有终止子,只 有一些自身带有翻译起始信号的外源基因 需要终止子。
• 处理高毒性蛋白:
• 外源基因的表达对大肠杆菌总有或多或少 的影响,一般来说,经过改造的宿主可以 在很大程度上容忍重组蛋白,重组蛋白可 以占到细胞总蛋白量的50%或更高。但少数 毒性极高的重组蛋白,其本底表达就会杀 死原核宿主,质粒容易丢失,使其在大肠 杆菌中很难得到高表达。以下方法可以降 低重组蛋白的本底表达量。
• 启动子受细胞类型的限制,在不同的细胞
• 融合标签:
• 融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽,方便 重组蛋白的纯化、固定和检测,表3给出了常用 的重组标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化, 尽量不要引入融合标签,以免影响蛋白性质;如 果重组蛋白本身能够结合某种亲和柱,如某些金 属结合蛋白可以结合Ni-NTA,某些糖结合蛋白能 够特异识别糖类,也不必引入标签。
1.1 表达菌株
• 原核表达系统刚用的宿主菌有E. coli, Bacillus等。其中革兰式阳性的Bacillus更适 宜在其周质空间分泌表达重组蛋白;革兰 氏阴性的E. coli能够广谱表达异源蛋白。
• 大肠杆菌表达系统是目前发展最完善的重 组蛋白表达系统。常用大肠杆菌菌株有 BL21(DE3)、BL21(DE3)Star、B834 (DE3)等,这些菌株都敲除了蛋白酶,并 溶源了噬菌体DE3。DE3是的一种衍生λ噬菌 体,带有噬菌体21抗性区和 lacI基因,
表2 常用E. coli表达菌株
1.2 质粒载体
• 大肠杆菌表达系统采用质粒为表达载体, 质粒上的重要元件包括复制子,启动子, 终止子,多克隆位点,信号肽,融合标签, 筛选标记等(图1)。原核表达载体已经发 展得比较完善,有多种质粒可供选择(表4)。
• 复制子:
• 复制子决定着质粒载体在宿主中的拷贝数。 通常情况下质粒拷贝数越高,重组蛋白的 表达量就越高,但是高拷贝的质粒也会严 重影响宿主的生长,质粒本身也不稳定,
• 在培养基中加入1%的葡萄糖。葡萄糖是大 肠杆菌的第一碳源,它的存在可以显著降 低由其他碳源引起的本底表达。
• 采用严格启动的载体和宿主。如PBAD载体、
1.4 包涵体表达:
• 在使用高效的E. coli表达系统时,过量表达 的重组蛋白常会在细胞内凝聚,形成无活 性的包涵体沉淀。在早期实验中,包涵体 被认为是重组蛋白表达的大敌:包涵体蛋 白折叠混乱、二硫键配对混乱、没有生物 活性、变复性条件需要长时间摸索等,即 使包涵体蛋白成功复性,其均一性和活性 依然备受质疑。但是包涵体表达也有其优 势:能够很轻松的获得超高的表达量,不 可溶的重组蛋白不会被宿主内的蛋白酶降
图2:酵母表达载体pPIC9K质粒图 谱
表7:常用毕赤酵母表达载体
2.2 表达条件的优化:
• 检查外源基因的一级序列:5’端不能有回文 结构;密码子构成需要适应宿主的密码子 偏好,特别是N端前几个,如使用了酵母厌 恶的密码子会大大影响表达量;高AT含量 的序列会使转录提前中止;检查重组蛋白 序列,分泌表达时需要糖基化位点Asn-XSer/Th梭质粒含有两套复制子和启动子,以及 相应的筛选标记,可以在原核和真核两种 宿主中分别完成复制和表达,以方便对质 粒进行遗传操作和大量制备。
• 酿酒酵母本身含有质粒,其表达载体可以 有自主复制型和整合型两种。自主复制型 质粒中,高拷贝载体通常采用酵母天然质 粒的复制子,如2μ复制子,以使载体在宿 主中达到较高的拷贝数(10-40),并独立 于宿主染色体进行复制;低拷贝复制子则 采用从酵母染色体中的自主复制序列(ARS)
• 检查终止密码,mRNA的通读会降低重组蛋 白的质量和稳定性。不同终止密码子的终 止效率在不同的物种中有很大差异,酵母 和哺乳动物偏爱UAA和UGA,昆虫和大肠杆 菌倾向于用UAA;终止密码子3’端紧邻的碱 基也会影响终止效率,对于UAG来说,终止 效率U、A>C>G,其他终止密码G>U、A>C; 也可以多加一个终止密码子,以确保翻译 在正确的位点结束。
• 常见的抗生素筛选标记有:青霉素抗性、 卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四环素抗性 等。氨苄青霉素由于会被抗性细菌分泌的β内酰胺酶和酸性环境破坏掉,其筛选效果
表4:常用原核表达载体质粒
1.3 优化表达条件
• 重组蛋白的表达流程很少有一次成形的, 为了提高蛋白表达量、改善蛋白质量,表 达条件和流程的优化是必须的。
表6:常用毕赤酵母表达菌株
• 表达载体:
• 毕赤酵母本身没有质粒,自主复制型载体 通常不稳定,因此一般采用整合型载体。 整合型载体的外源基因表达盒由几部分组 成:AOX启动子、多克隆位点、融合标签、 AOX终止子,有时还有一段AOX1基因的3’端 非编码区,以便将外源基因表达盒导入基 因组中的AOX1位点。一些载体还含有外分 泌信号肽,使重组蛋白分泌至培养基中。 某些载体允许构建多个串联的外源基因表 达盒,以弥补整合型载体拷贝数量的缺陷。 组成型表达的GAP启动子可以替代AOX启动 子:GAP启动子不需要甲醇诱导,表达水平
• 启动子:
• 表达重组蛋白时,我们需要考虑启动子的 强弱、作用方式、调控方式和本底表达水 平。表达载体通常选用强启动子以提高表 达量,但弱启动子也有其优点,如降低本 底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋 白等。按照作用方式,启动子可以分为两 类:组成型表达的启动子使宿主不停地表 达重组蛋白,常用于工业生产,如σS等;诱 导型表达的启动子使宿主仅在受到诱导 (诱导剂、温度等)时表达目的蛋白,诱 导型启动子使重组蛋白的表达容易控制, 同时降低了外源蛋白对细菌生长的影响。
• 融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流 程,并提高蛋白溶解度。商业化表达质粒,如 pET、pGEX等提供了各种纯化标签和融合蛋白供 选,应根据蛋白具体情况进行选择。
• His-tag是最常用的纯化标签,它具有很多优点:
表3:常用融合标签
• 筛选标记:
• 在没有压力的环境下培养时,细菌中的外 源质粒常常随着细胞复制而丢失。为了稳 定质粒、表达重组蛋白,需要在载体中加 入筛选标记,使宿主菌在原则压力下生长。 原核系统中,常见的筛选标记有蓝白斑筛 选(主要用于克隆)、营养缺陷性筛选和 抗生素筛选,也可以将几种筛选手段混合 起来使用。
表5:常用酿酒酵母表达载体
• 整合型质粒(如Yip5)不含ARS,必需整合 到染色体上,随染色体复制而复制。整合
过程是高特异性的,但是拷贝数一般很低。 多拷贝整合载体pMIRY2通过将目的基因靶 向整合到rDNA簇上(rDNA簇为酵母基因组中 串联存在的150个重复序列)克服了这个缺点, 利用pMIRY2质粒可以得到100个以上的拷贝。
• 可溶片段突变体与全蛋白之间经常有很大 差异,如等电点、抗原性、寡聚状态、活 性、细胞定位等,突变时一定要谨慎考虑; 突变掉可能引起顺反异构的Pro。顺反异构 伴随着很高的能量跃迁,是蛋白折叠的能 量壁垒。突变掉这样的Pro可以显著帮助重 组蛋白折叠,但是同样会改变蛋白性质, 要谨慎考虑;与分子伴侣和折叠酶共表达。 微量的分子伴侣即可显著改善重组蛋白的 折叠状况,与重组蛋白同源的分子伴侣效 果更加明显。引入分子伴侣同样也会引起 复制子相容性、额外的抗生素抗性等问题, 常用的分子伴侣有ATP依赖的DnaK-DnaJGrpE和GroEL-GroES,以及定位于周质空间
图1:大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱及多克隆位点
• 早期大肠杆菌表达体系中,常见的启动子 是lac和lacUV5。lac是一个弱启动子,很难
使外源基因得到高表达。目前使用的含有 需要小量共表达的蛋白(如分子伴侣,蛋白 抑制剂等)的载体,有很多都采用了经典的 lac启动子。
• 强启动子中,tac和trc是lac启动子的变体,
重组蛋白表达系统