微生物活菌计数方法
微生物总数检测方法(真菌)
微生物总数检测方法（真菌）一、检测用培养基配方与培养条件1.培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA培养基）配制：以北京路桥PDA培养基为例，按说明上配制需称取培养基4克，加水100毫升。
2. 培养条件：25℃-30℃；时间：72-96小时。
二、检测与计数方法1. 梯度稀释称取适量的样品，加入带玻璃珠的三角瓶中，加入100mL的无菌水（无菌水中事先加入了分散剂3—5滴，分散剂可以是吐温，OP—80，用来分散菌团），用玻璃棒搅拌使之溶解吸水均匀后，上旋转式摇床200 r/min充分振荡60 min，,即成母液菌悬液（基础液）。
2. 用10mL无菌移液管分别吸取10mL上述母液菌悬液加入90 mL无菌水中，按1:10进行系列稀释，分别得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……1:k稀释的菌悬液（每个稀释度应更换无菌移液管，每一个稀释度瓶种应放有适量的玻璃珠，以保证菌液分布均匀）。
3. 加样及培养取1个适宜的稀释度，用移液枪吸取菌悬液0.1 mL，加至预先制备好的固体培养基平板上，用无菌玻璃涂布棒将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。
此稀释度重复3次，同时以空白作对照，于适宜的条件下培养。
4. 菌落识别根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。
当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。
5. 菌落计数以出现20—70个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。
有效活菌数按式（1）计算，同时计算杂菌数：nm = x kv1/(m0v2) ×10-8或 nv = x kv1/(v0v2) ×10-8（1）式中：nm —质量有效活菌数，亿/gnv —体积有效活菌数，亿/mLx—有效菌落平均数，个k —稀释倍数v1—基础液体积， mLv2—菌悬液加入量， mLv0—样品量，mLm0—样品量， g重点需要注意的部分在菌悬液的制备及震荡过程上，因为固态发酵的的产品大部分为聚集状态不容易分散开来，这点与液态发酵产品不同。
细菌计数简述
细菌计数【目的要求】1、掌握倾注培养法、活菌计数法和光电比浊计数法。
2、熟悉菌落形成单位（cfu）含义。
【器材和试剂】1、器材无菌平皿（直径90mm）、孵育箱、水浴箱、菌落计数仪、无菌刻度吸管、灭菌空试管、坐标纸。
2、培养基普通营养琼脂（每支15ml）、液体培养基。
3、其他待检样品，如饮用水、饮料、食品、药品、化妆品等。
【步骤和方法】1、倾注培养和活菌计数（1）按食品微生物学检验和医药化妆品检验国家标准（GB）的要求处理样品，如固体标本用无菌研钵研碎制成匀浆、油脂类物品用分散剂Tween-80、医药标本宜加入消除药物作用的中和剂等。
所有操作过程必须严格无菌，防止污染。
（2）将标本用无菌生理盐水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5梯度稀释。
（3）取不同稀释度液体1ml注于直径90mm的无菌平皿，迅速加入已熔化并冷却至50℃的营养琼脂15ml，立即在平面上向同一方向平稳转动，使之混匀，待凝固后翻转平板。
一个稀释度接种两个平板。
（4）置35℃孵育18~24h，计数菌落形成单位（colony forming unit，cfu），求出每毫升或每克标本中所含活菌数。
1ml标本中活菌数=全平板cfu×稀释倍数（5）菌落计数方法：1）平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要使用放大镜检查，以防遗漏。
记下各平板上的菌落数后，应求出同一稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。
2）在求同一稀释度的平均数时，若其中一个平板有较大片状菌落时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。
3）若片状菌落不足平板一半，而其余一半中菌落数分布均匀，则计数后乘2代表全平板菌落数，然后再求该稀释度的平均菌落数。
（6）不同稀释度平均菌落数的确认：1）平均菌落数在30~300之间：①若两个稀释度的比值＜2，报告两个稀释度的平均菌落数，如表1-3-1例2；若比值≥2，应报告两个稀释度中较大菌落数者，如表1-3-1例3、例4.②当只有一个稀释度的平均菌落数在30~300之间时，即以该平均菌落数乘以稀释倍数报告之，如表1-3-1例1。
微生物计数方法
1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨制成1：10的均匀稀释液。
固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。
用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。
另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。
2．无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。
所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。
样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。
操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。
琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。
3．采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。
固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。
4．样品稀释误差：为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。
在进行连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。
为减少稀释误差，SN标准采用取10mL稀释液，注入90mL缓冲液中。
5．稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1%蛋白胨水），后者对食品中已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。
如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。
倾注培养1．操作方法：根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。
几种常用的细菌计数方法
几种常用的细菌计数方法1、计数器测定法即用血细胞计数器进行计数。
取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。
由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。
本法简便易行，可立即得出结果。
本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。
2、电子计数器计数法电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。
该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。
因此，要求菌悬液中不含任何碎片。
3、活细胞计数法常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。
取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。
此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。
使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确;②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O.001%2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC);③本法限用于形成菌落的微生物。
广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。
4、比浊法比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。
细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。
此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。
5、测定细胞重量法此法分为湿重法和干重法。
湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重;干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。
此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。
微生物生长繁殖的测定方法.doc
微生物生长繁殖的测定方法1. 内容1.计数法：通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。
（1）直接计数：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
缺点：不分死活菌。
（2）间接计数（活菌计数法）：其原理是每个活细胞在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。
2.重量法：以细胞的生长量作为细菌生长测定的指标。
（1）湿重法：将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重，如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。
（2）干重法：不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。
3.生理指标法：（1）含氮测定法：一般微生物细胞的含量比较稳定，故可用凯氏定氮法等测其总氮量，再乘以系数6.25即为粗蛋白含量。
蛋白含量越高，说明菌体数和细胞物质量越高。
（2）DNA含量测定法：微生物细胞的DNA含量较稳定，故可采用适当的荧光指示剂或染色剂与菌体DNA作用，荧光比色或分光光度法测得DNA含量。
2. 练习一、选择1. 测微生物活菌数通常采用：（）A.稀释平板法B.滤膜培养法C.稀释培养法答案：A二、简答1.试述涂片计数的基本方法。
答案：取载玻片一块，用蜡笔在中央画出一平方厘米的面积。
将待测样品稀释到一定浓度后取0.01毫升菌液滴在载玻片上的一平方厘米面积上。
然后在显微镜下计数每个视野的菌数（至少数10个视野，计算平均菌数）。
将视野的面积算出来后，按下列公式计算样品中的含菌数。
1cm2每克样品中的含菌数＝----------⨯每个视野的平均菌数⨯100⨯稀释倍数视野面积3. 测验一、填空1.一般细菌的干重约为湿重的______%。
二、简答1.简述平板菌落测试法。
4. 案例5. 资源下载课程讲义资源（Word文档）、教学课件资源（PPT）、视频录像资源（视频录像）。
微生物常见检测方法大全
微生物常见检测方法大全微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义。
常见的检测方法有：生长量测定法、微生物计数法、生理指标法和商业化快速微生物检测等。
微生物生长意味着原生质含量的增加，所以测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。
微生物生长的衡量，可以从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。
生长量测定法1、体积测量法：又称测菌丝浓度法。
原理：通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。
菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。
这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。
2、称干重法：原理：利用离心或过滤法测定。
一般干重为湿重的10-20%。
称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（activity dry yeast, ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。
3、比浊法：原理：微生物的生长引起培养物混浊度的增高。
通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。
该法主要用于发酵工业菌体生长监测。
4、菌丝长度测量法：方法：对于丝状真菌和一些放线菌，可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度。
微生物计数法1、血球计数板法:这种方法简便，直观，快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。
2、染色计数法：为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。
3、比例计数法：将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞）浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。
4、液体稀释法：对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5毫升试样，接种1毫升到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表MPN（most probably number）得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。
微生物活菌计数方法
2.1 母液（基础液）的制备
样品混合均匀：很重要 固体样品：称取10g左右样品加入到100mL无 菌水（ 500mL三角瓶）中，静置20min。 液体样品：量取10.0ml样品加入到90mL无菌 水（500mL三角瓶）中，静置20min 。 分散菌体：将三角瓶置于摇床上200r/min振荡 30min，即成母液菌悬液。
6.
彻底、操作过程是否合乎无菌要求。
2.3 平板的培养
将涂布好平板放在适宜的条件下培养
如： 温度条件 气体条件 培养时间 平板倒置培养
2.4 菌落识别和计数
1. 2. 3.
4.
通过菌落识别、涂片染色、镜检观察，确定 有效菌。（必要时做生化实验） 选择性培养基上长出的菌落并非都是有效菌， 培养基的选择性是相对的。 一种有效菌只在一种特定培养基上计数，不 同培养基上同一种有效菌不能累加。 细菌杂菌（包括放线菌）在培养细菌的培养 基上计数；霉菌和真菌杂菌在真菌培养基上 计数。但也不能重复计数。
3. 电子计数器计数法 工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小 孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔 时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在
电子记录装置上。
该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，
而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不
含任何碎片。不适于微生物肥料产品的检测。
核酸计数法
稀释、加样和涂布注意事项
1.
整个程序应在无菌间或超净台内进行，操作人员时刻有 无菌概念 适宜稀释度：根据标准或企业提供的信息选择稀释度。 系列稀释时不同的稀释度应更换吸管（移液管），加样
微生物检测菌落总数测定方法
微生物学检验菌落总数的测定1 原理微生物活体数量的测定方法，常用平板培养计数法。
它是通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液，再取一定的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克（或mL ）样品中的活菌数量。
2 材料和仪器2.1 平皿：φ90mm 。
2.2 无菌锥形瓶：容量250mL ，500 mL 。
2.3 无菌吸管：1mL （具0.01mL 个度）,10mL （具0.1mL 刻度）或微量移液器及吸头。
2.4 灭菌锅。
2.5 恒温培养箱2.6 涂棒。
2.7 酒精灯。
2.8 超净工作台。
2.9 磁力搅拌器。
2.10 漩涡振荡器3 检验程序菌落总数的检验程序见下图。
方法①↙ ↘方法②↘ ↙4 操作步骤4.1 培养基和试剂的配制4.1.1 平板计数琼脂培养基：LB培养基（最常用）牛肉膏5g蛋白胨10g氯化钠5g琼脂20g蒸馏水1LpH 7.0～7.2将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值，分装锥形瓶中，121℃高压灭菌30分钟。
4.1.2 无菌生理盐水的配制：称取8.5g氯化钠溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌30分钟。
4.2 样品的稀释：4.2.1 固体样品：称取10g固体样品置于盛有90mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中（内装数粒无菌玻璃珠），在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，制成1：10的样品均液，即10-1稀释液。
4.2.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品均液1mL（吸取前需要摇匀1：10稀释液），缓慢加入盛有9mL无菌生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不能触及稀释液面），用漩涡振荡器振荡，混合均匀，制成1：100的样品稀释均液。
4.2.3按照4.2.2操作程序，制备10倍系列样品稀释液，每递增稀释一次，换用一次1mL无菌吸管或吸头。
4.2.4 根据对样品活菌数量的估计，选择3~4个适宜稀释度的样品均液（比如10-6，10-7，10-8，10-9稀释液）。
微生物限度计数方法
微生物限度计数方法微生物限度计数方法是微生物学研究中常用的一种实验方法，它通过将样品中的微生物进行定量计数，从而评估样品的微生物污染程度。
本文将对微生物限度计数方法进行详细介绍，希望能为微生物研究提供有指导意义的参考。
微生物限度计数方法通常包括以下几个步骤：1. 样品制备：首先，需要将待测样品制备成适当的形式，以便于对微生物进行计数。
例如，对于液态样品，可以采用稀释平板法或过滤法进行计数；对于固体样品，可以使用剁碎法或振荡法等方法进行处理。
2. 稀释平板法：稀释平板法是一种常用的微生物计数方法。
该方法的基本原理是将不同稀释倍数的样品溶液分别加到含有培养基的平板上，经过培养后，可以根据每个平板上微生物的生长数量来计算样品中微生物的含量。
这种方法要求制备一系列稀释液，将样品进行逐步稀释，并接种到含有培养基的平板上。
3. 过滤法：过滤法适用于液态样品的微生物计数，尤其是样品中微生物数量较高的情况。
该方法的原理是通过滤膜，将微生物过滤出来并附着在膜上，然后将滤膜放置在培养基上进行培养。
培养后，可以通过计数膜上微生物的数量来评估样品中微生物的含量。
过滤法具有操作简便、有效快速等优点，适用于大量样品的计数。
4. 其他方法：除了稀释平板法和过滤法，还有一些其他常用的微生物计数方法，如MPN法、薄膜法、电子计数法等。
这些方法各有特点，可根据实际研究需要选择合适的方法进行微生物计数。
微生物限度计数方法在微生物学研究中具有重要意义。
通过对样品中微生物的计数，可以评估其污染程度，为食品安全、医药生产、环境监测等领域提供可靠的数据依据。
同时，微生物限度计数方法也有助于监控微生物的生长趋势，预测潜在的微生物污染风险，并采取相应的控制措施。
总之，微生物限度计数方法是微生物学研究中必不可少的一部分。
通过了解和掌握不同的计数方法，科研人员可以准确评估样品中微生物的含量，并及时采取措施来控制微生物的污染传播。
相信本文的内容能够为微生物研究者提供有用的指导意义。
高三一轮复习生物-例析菌落等微生物数目统计计数方法的几个常见问题
高中生物复习-例析菌落等微生物数目统计计数方法的几个常见问题1、从方法上分析菌落数目例 1 ：若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用直接计数;若要测定其活菌数量，可选用法进行计数。
例2 ：Ⅱl号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是。
(参考答案:血细胞计数板稀释涂布平板法稀释涂布平板法)显微镜直接计数法是利用显微镜、血细胞计数板等工具对纯培养悬浮液直接计数来检测样本中的细胞数目。
该方法能直观、快速地检测出单细胞状态下的微生物或丝状微生物所产生的孢子的数目，但是不能区分死细胞和活细胞，不适合细胞密度低的样品。
稀释涂布平板法常常需要先将样品进行一系列的稀释，然后吸取适量稀释样品涂布在平板上，在稀释度适宜的情况下一个菌落是由一个活细胞繁殖形成的，从而通过统计平板上的菌落数来推算活菌数。
该方法能灵敏地检测出样品中的活菌数，但实验过程手续繁、耗时长、影响因素较多。
显微镜直接计数法由于不能区分死菌和活菌，因此计数结果往往比实际活菌数偏高。
为避免把死菌计数在内，可用台盼蓝染色:被染成蓝色的为死菌，反之为活菌。
稀释涂布平板法测定活菌数目的时候，由于相邻两个或多个细胞连在一起，可能形成一个菌落，因此测定值比实际值小。
2、从对照原则上分析菌落数目例3：若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了现象。
若将30(即36-6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法(填“正确”或“不正确”)。
(参考答案∶污染不正确)设置不接种的空白培养基作为空白对照组，证明培养基制备过程中没有被杂菌污染，增强实验的说服力，保证实验结果的准确性。
若该培养基上出现了菌落则说明实验过程出现污染现象，应舍弃数据，查找原因，重做实验。
若为了证明选择培养基有选择作用，对照组往往是完全培养基。
统计活菌数目的方法
统计活菌数目的方法统计活菌数目是微生物学实验中的重要步骤，它可以帮助我们评估样品中微生物的数量，从而为后续的实验和研究提供重要数据支持。
在实验室中，有多种方法可以用来统计活菌数目，下面将介绍几种常用的方法。
首先，最常见的方法是平板计数法。
平板计数法是通过在琼脂平板上培养微生物，并根据菌落的数量来统计活菌数目。
具体操作步骤如下，首先，将样品经过适当稀释后均匀涂布在琼脂平板上，然后将琼脂平板在适当的温度下培养一段时间，最后根据菌落的数量进行统计。
这种方法简单易行，而且可以直接得到微生物的数量，因此在实验室中被广泛应用。
其次，滤膜计数法也是一种常用的方法。
滤膜计数法是通过将样品过滤到膜上，然后将膜放置在适当的培养基上培养，最后根据膜上的菌落数量来统计活菌数目。
这种方法适用于一些含有大量杂质的样品，因为过滤可以去除杂质，从而更准确地统计微生物的数量。
另外，涂布法也是一种常用的统计活菌数目的方法。
涂布法是将样品均匀涂布在琼脂平板上，然后进行培养，最后根据菌落的数量来统计微生物的数量。
这种方法操作简单，适用于一些微生物数量较少的样品。
除了上述方法外，还有一些新兴的方法，比如荧光显微镜法、流式细胞术等，这些方法在统计活菌数目方面也有着广泛的应用前景。
总的来说，统计活菌数目的方法有很多种，每种方法都有其适用的场景和特点。
在实际操作中，我们应根据实验的需要和样品的特点来选择合适的方法，从而获得准确的统计结果。
希望本文介绍的方法能够为大家在微生物学实验中的活菌数目统计提供一些帮助。
微生物活菌计数方法..
微生物肥料和食用菌菌种质检中心 曹凤明
微生物计数方法种类
➢ 直接计数法 ➢ 核酸计数法 ➢ 活菌计数法（培养法）
1. MPN（Most-Probable-Number ）最大可能数法 2. 混菌法 3. 平板技术法
直接计数法
1. 显微镜直接计数 2. 比浊法 3. 电子计数器计数法
稀释倍数：101， 102 ， 103 ，104 ，105
2.2.2 加样和涂布
每个样品取3个连续适宜稀释度，用0.5mL无菌 吸管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1mL，加至预先 制好的固体培养基平板上，分别用无菌玻璃刮刀将 不同稀释度的菌悬液均匀地涂于平板表面。
每一稀释度每种培养基做3个重复，同时以无 菌水作空白对照。
有效活菌数测定原始记录表
样品编号 室温，℃
仪器名称、编号 菌种名称
培养温度，℃ 培养时间， h 样品量m0(v0)，
g(mL)
稀释倍数 k
1.培养箱 重复Ⅰ
检测日期
年月日
相对湿度， %
2.洁净室
依据标准
培养基
基础液体 积v1，mL
加 样 量v2， mL
菌 落 数(cfu /皿)
重复Ⅱ 重复Ⅲ 平均
6
/
/
7
/
/
8
/
/
7.0
/
/
/
霉菌数 个/g
0.69×106
霉菌（个/ g） 7.0 103 100 0.69 106 10.10 0.1
稀释倍数
（真菌杂菌在马丁培养
重复 基上，不包括霉菌）
/
103
104
10513/来自22/
活菌计数的方法及在药典中的应用
活菌计数法在药典中的应用 平皿法 薄膜过滤法
用稀释液稀释成1∶10、1∶102、 1∶103 等稀释级的供试液。
一、 平皿法
方法 取供试液1ml，置直径90mm 的无菌平皿中，注入15～20ml 温
度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母 浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种 培养基至少制备2 个平板。 凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备2 个平板，均不得有菌 生长。
阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基， 培养和计数 除另有规定外，细菌培养3 天，霉菌、酵母菌培养5 天。
逐日观察菌落生长情况；点计菌落数。必要时，可适当延长培养时间 至7 天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点 计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报 告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的 菌落数不能相差1 倍或以上。
注
膜过滤法
膜过滤法是当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海 水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并 经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上 ( 或一定面积中 ) 的 细菌数
比浊法
比浊法原理是在一定范围内，菌的悬液中细胞浓度与混浊度成 正比。即与光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此可以借 助于分光光度计，在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光 密度 (O ． D ． ) 表示菌量。实验测量时一定要控制在菌浓 度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。微生物计数法， 发展迅速，现有多种多样的快速、简易、自动化的仪器和装置 等方法。
基本操作：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。
微生物计数方法
微⽣物计数⽅法1．操作⽅法：以⽆菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌⽣理盐⽔或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨制成1：10的均匀稀释液。
固体检样在加⼊稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。
⽤1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注⼊含有9ml灭菌⽣理盐⽔或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。
另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释⼀次即换⽤1⽀1ml灭菌吸管。
2．⽆菌操作：操作中必须有“⽆菌操作”的概念，所⽤玻璃器⽫必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。
所⽤剪⼑、镊⼦等器具也必须进⾏消毒处理。
样品如果有包装，应⽤75%⼄醇在包装开⼝处擦拭后取样。
操作应当在超净⼯作台或经过消毒处理的⽆菌室进⾏。
琼脂平板在⼯作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。
3．采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中⼀点，宜多采⼏个部位。
固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。
4．样品稀释误差：为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每⼀稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每⼀稀释度应更换⼀⽀吸管。
在进⾏连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流⼊，勿使吸管尖端伸⼊稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。
为减少稀释误差，SN标准采⽤取10mL稀释液，注⼊90mL缓冲液中。
5．稀释液：样品稀释液主要是灭菌⽣理盐⽔，有的采⽤磷酸盐缓冲液（或0.1%蛋⽩胨⽔），后者对⾷品中已受损伤的细菌细胞有⼀定的保护作⽤。
如对含盐量较⾼的⾷品（如酱油）进⾏稀释，可以采⽤灭菌蒸馏⽔。
倾注培养1．操作⽅法：根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平⽫中，每个稀释度做两个平⽫。
微生物生长的测定方法
微生物生长的测定方法:微生物生长的测定有计数、重量和生理指标等方法。
1、计数法此法通常用来测定样品中所含细菌、抱子、酵母菌等单细胞微生物的数量。
计数法又分为直接计数和间接计数两类。
(1)直接计数这类方法是利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
此法的缺点不能区分死菌与活菌。
计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm2和高O.Imm的计数室，在I mm2的面积里又被刻划成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成。
将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计算4-5个中格的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按下面公式求出每毫升样品所含的细菌数。
每毫升原液所含细菌数二每小格平均细菌数x400x1000x稀释倍数.(2)间接计数法此法又称活菌计数法，其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。
将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.2m1故人无菌平皿，再倒人适量的已熔化并冷至45℃左右的培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，放人适宜温度的培养箱或温室培养，长出菌落后，计数，按下面公式计算出原菌液的含菌数:每毫升原菌液活菌数=同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数x稀释倍数x5此法可因操作不熟练造成污染，或因培养基温度过高损伤细胞等原因造成结果不稳定。
尽管如此，由于该方法能测出样品中微量的菌数，仍是教学、科研和生产上常用的一种测定细菌数的有效方法。
土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含细菌、酵母、芽抱与抱子等的数量均可用此法测定。
但不适于测定样品中丝状体微生物，例如放线菌或丝状真菌或丝状蓝细菌等的营养体等。
除上述两种常用的计数方法外，还有膜过滤法、比浊法。
膜过滤法是当样品中菌数很低时，可以将一定体积的潮水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。
微生物计数方法【精选文档】
微生物的显微直接计数法一、实验目的了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能.二、实验原理测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质,常不易分辨。
菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser)细菌计数板。
两种计数板的原理和部件相同,只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。
而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图21-1）,计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开）,而每个大方格又分成16个小方格。
但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
计数区边长为1mm,则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。
盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106 .因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）三、实验器材1．活材料:酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。
微生物活菌计数方法
微生物活菌计数方法
微生物活菌计数是一种定量的方法，用于确定给定环境样品中存在的活跃的微生物的数量。
常用的微生物活菌计数方法有以下几种：
1. 平板计数法：将样品制备成不同稀释度的溶液，均匀分配到琼脂平板上，放置在适当的条件下培养，通过计算每个平板上菌落的数量，以得出样品中微生物的活跃数量。
2. 液体计数法：将样品制备成一系列稀释度的液体悬浮液，分别在培养基中培养一定时间后，使用显微镜观察计数室进行计数。
3. 膜过滤法：将样品通过膜滤器，并将膜滤器放置在含有适宜营养物的琼脂平板上培养，通过计算每个平板上菌落的数量，以得出样品中微生物的活跃数量。
4. 流式细胞计数法：使用流式细胞术来计数活跃的微生物。
通过将样品中的微生物标记上荧光染料，并通过流式细胞仪进行计数和分析。
在进行微生物活菌计数时，需要注意样品的制备过程、培养条件的控制以及计数过程中的技术操作等因素，以保证结果的准确性和可重复性。
同时，根据目标微生物的特性和分布情况，选择合适的计数方法和适宜的培养条件也是非常重要的。