糖化黑曲霉复壮方法的研究
黑曲霉产糖化酶液态发酵条件研究
黑曲霉产糖化酶液态发酵条件研究孙继祥【摘要】The effects of additives,feeding time and feeding quantity on Saccharifying enzyme production by Aspergillus niger fermentation were investigated throug single factor test with the activity of Saccharifying enzyme as indicator.Then the effects of fermentation conditions on Saccharifying enzyme production were investigated by orthogonal experiments.The results suggested that the addition of（NH4） 2SO4 could enhance 17 % enzyme activity,the optimum feeding time was 48h,the best feeding quantity was 6 mL,feeding could prolong fermenting cycle from previous 96 h to 120 h,and the optimum fermentation conditions were 15 % inoculating quantity,50 mL liquid-filling in 250 mL triangle flask,and initial pH value as 4.5.%以糖化酶活力为指标,通过单因素实验,分别考察了添加物、补料时间和补料量对黑曲霉发酵产糖化酶的影响。
通过正交实验,考察了发酵条件对黑曲霉发酵产酶的影响。
黑曲霉固态发酵产纤维素酶条件优化及秸秆糖化研究
黑曲霉固态发酵产纤维素酶条件优化及秸秆糖化研究黑曲霉固态发酵产纤维素酶条件优化及秸秆糖化研究摘要：纤维素酶在生物能源领域中扮演着重要角色，能够有效降解秸秆等废弃物，并转化为发酵产物，如生物乙醇。
本研究通过固态发酵的方式培养黑曲霉，优化产纤维素酶的条件，并利用优化的酶解液对秸秆进行糖化实验，探究最佳的糖化条件。
关键词：黑曲霉；固态发酵；纤维素酶；秸秆糖化1. 引言随着能源危机的严峻形势和环境问题的日益突出，生物质能源作为一种可再生、环境友好的能源逐渐受到人们的关注。
秸秆作为生物质资源的一种，具有庞大的潜在能量价值，但其利用率低下。
纤维素作为秸秆主要成分之一，具有较高的结晶度和难以降解的特点，传统的物理、化学方法不能有效降解纤维素。
2. 方法及实验步骤2.1 培养黑曲霉产生纤维素酶选择黑曲霉作为研究对象，进行固态发酵培养。
黑曲霉菌种接种于固态培养基中，控制温度、湿度等条件。
根据黑曲霉固态发酵产酶曲线，确定最佳培养时间和培养温度。
2.2 优化产纤维素酶的条件通过单因素实验以及响应面试验，探究培养基配方、碳源浓度、氮源浓度、pH值等因素对纤维素酶产量的影响。
通过分析实验数据，确定最佳的产酶条件。
2.3 秸秆糖化实验利用优化的纤维素酶酶解液对秸秆进行糖化实验。
调整酶解液的酶解时间、温度和pH值等参数，探究最佳的糖化条件。
通过测定糖化液中的还原糖含量，评估糖化效果。
3. 结果与讨论3.1 产纤维素酶的固态发酵条件优化在黑曲霉固态发酵条件下，最佳培养时间为7天，最佳培养温度为32℃。
该条件下，纤维素酶的产量达到最高。
3.2 产纤维素酶的条件优化通过单因素实验和响应面试验优化产纤维素酶的条件，得到最佳培养基配方为：碳源浓度5g/L，氮源浓度4g/L，pH值5.5。
3.3 秸秆糖化效果评估在最佳糖化条件下，糖化液中的还原糖含量达到最高值，说明纤维素酶能够有效降解秸秆中的纤维素，释放出糖分。
4. 结论通过本次研究，确定了黑曲霉固态发酵产纤维素酶的最佳条件，并利用优化的纤维素酶对秸秆进行糖化实验，证实了纤维素酶能够有效降解秸秆中的纤维素。
产纤维素酶黑曲霉菌种的复壮
选料→清洗→粉碎→微波提取→分离→浓缩→ 洋芫荽、茴香、龙蒿、牛膝草、鼠尾草、百里香
干燥→粉化→产品
等。已用于板蓝根的板蓝根多糖、麻黄的麻黄碱、
４．３ 应用
高山红景天的红景天苷、柚皮的色素、罗汉果的罗
采用微波萃取技术提取活性成分的研究已包括 汉果皂苷、射干的鸢尾苷、金针菇的实体多糖、黄
了生物碱类、有机酸、萜类、蒽醌类、黄酮类、皂 芩的黄芩苷、金银花的绿原酸， 以及紫杉醇、麦角
工艺与设备
产纤维素酶黑曲霉菌种的复壮
张志焱， 徐海燕， 吕明霞， 杨军方， 曹 斌
（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东 泰安 ２７１０００）
摘 要： 介绍了饲用酶制剂生产菌种黑曲霉纯化复壮的方法， 并对复壮菌株、退化菌株、原始菌株的酶活力 及长势进行了比较， 结果表明经纯化复壮筛选出的 ７ 号菌株纤维素酶活力明显高于退化的菌株， 且生长快、长势 强， 甚至优于原始菌株。
标准曲线绘制： 取 ２５ ｍＬ 具塞刻度试管 ６ 支， 分 别 加 入 １．０ ｍｇ·ｍＬ－１ 的 葡 萄 糖 标 准 溶 液 ０， ０．４， ０．８， １．２， １．６， ２．０ ｍＬ， 再依次加纯化水 ２．０， １．６， １．２， ０．８， ０．４， ０ ｍＬ， 加 ＤＮＳ 试 剂 １．５ ｍＬ， 混 合 均匀后沸水浴 ５ ｍｉｎ， 取出立即用冷水冷却， 用纯 化水定容到 ２５ ｍＬ， 摇匀， 在 ５４０ ｎｍ 测吸光度 Ａ， 以吸光度为纵坐标， 葡萄糖的含量为横坐标， 绘制 标准曲线。
△Ａ＝Ａｓ－ Ａｃｋ 根据△Ａ 从标准曲线上查得葡萄糖含量 Ｐ。 酶活力（ Ｕ·ｇ－１） ＝Ｐ×Ｋ×１ ０００ ／ ０．５ ×３０ 式中 Ｋ 为稀释倍数。 ２．５．２ 水分的测定 采用水分快速测定仪法。 ３ 结果与讨论 ３．１ 初筛结果 经过纯化复壮， 以菌株生长性能为指标， 确定 符 合 标 准 的 ３ 号 、７ 号 、８ 号 、１３ 号 、１５ 号 、２２ 号为初筛菌株。 ３．２ 复筛结果 菌株在全麸皮培养基上纤维素酶活力测定结果 见表 １。
黑曲霉发酵过程中菌体形态的分析方法建立及应用_唐文俊
1.4
发酵培养
使用固体土豆培养基富集孢子。孢子使用
灭菌超纯水洗入无菌摇瓶，使用血球计数板技 术。最终接种浓度为 105 个 /mL。 反应器发酵采用平行发酵，对于不同耗氧 水平研究固定转速为 400 r/min，分别通入含氧 气 20%、40%、60%的富氧空气；对于不同转速 进行考察， 固定转速分别为 300 r/min、 450 r/min、 500 r/min 和 600 r/min。发酵周期均为 144 h。
生物技术与方法
黑曲霉发酵过程中菌体形态的分析方法建立及应用
唐文俊，夏建业，储炬，庄英萍，张嗣良
华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237
唐文俊 , 夏建业 , 储炬 , 等 . 黑曲霉发酵过程中菌体形态的分析方法建立及应用 . 生物工程学报 , 2015, 31(2): 291–299. Tang WJ, Xia JY, Chu J, et al. Development and application of morphological analysis method in Aspergillus niger fermentation. Chin J Biotech, 2015, 31(2): 291–299.
摘
要 : 丝状真菌 (Filamentous fungi) 的发酵生产通常具有较高的工业应用价值，但其菌体形态是一个区别
于其他非丝状菌的一个重要发酵指标。 针对目前形态分析的瓶颈， 本研究使用琼脂糖凝胶对黑曲霉菌形进行固 定，利用平板实现菌球样本的大量制备，并结合图形处理软件自建自动化处理程序，实现了大量准确可靠的菌 体形态参数的获得， 大大增加了形态数据处理通量及准确度。 应用该方法于黑曲霉发酵生产糖化酶过程中不同 供氧水平及剪切水平下菌体形态的研究， 通过大量形态数据定量阐明了黑曲霉在不同剪切水平下的分区域形态 分布特性，为进一步工业过程的形态优化提供了重要的研究方法。
黑曲霉糖化酶热稳定性的研究
黑曲霉糖化酶热稳定性的研究
陈冠军;罗贵民
【期刊名称】《生物工程进展》
【年(卷),期】1990(010)003
【摘要】本文报导了黑曲霉糖化酶三种同工酶的相似的热稳定性。
活力测定表明,糖化酶在60℃时易失活,三个同工酶的半衰期分别是GⅠ30’,GⅡ48.,GⅢ80’;而对40℃和50℃则有较强的抗性,但其活力曲线呈现复杂的变化,显示出在一定时间内,温热可以诱导酶活提高。
紫外吸收及紫外差示光谱表明,在热处理过程中引起了
酶分子的构象变化。
本文还对酶分子的构象及活力变化的关系进行了探讨。
糖化
酶(glucoamylase EC.3.2.1.3)水解淀粉为葡萄糖,是食品酿造工业的重要用酶之一。
我们已经从黑曲霉AS.3.4.309变异株B-11发酵液中分离提纯了三种糖化酶的同
工酶(1),并对其基本性质进行了研究。
本文主要对黑曲霉糖化酶的热稳定性作了进
一步的探讨。
【总页数】6页(P29-33,16)
【作者】陈冠军;罗贵民
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】Q81
【相关文献】
1.响应面法优化高产糖化酶的黑曲霉突变菌株制备糯米酒酒曲工艺研究 [J], 崔敬爱;邵智韬;徐岩;戴碧玮;庄若岩;曹勇;陈海燕;陈晓平
2.黑曲霉高产糖化酶的分子水平研究方法概论 [J], 杨丽娟;余少文
3.产高活性糖化酶黑曲霉的筛选工艺研究 [J], 沈奕
4.黑曲霉液态发酵产糖化酶条件的研究 [J], 梁绍勋;梁金辉;蒋军;王录
5.黑曲霉糖化酶基因表达调控的研究：I.高产及低产菌株糖化酶表达… [J], 乔殿华;唐国敏
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携多拷贝glaA的重组黑曲霉过量合成糖化酶的研究
携多拷贝glaA的重组黑曲霉过量合成糖化酶的研究
携多拷贝glaA的重组黑曲霉过量合成糖化酶的研究
以工业生产菌株黑曲霉CICIM F0410基因组DNA为模板,扩增出糖化酶glaA基因,测序并进行表达研究.GlaA基因的核苷酸序列长为2167 bp,包含4个内含子.氨基酸序列比对表明此黑曲霉糖化酶与其他曲霉属来源的糖化酶有很高的同源性.将glaA基因克隆到pBC-Hygro 载体中,构建重组质粒pBC-Hygro-glaA并转化A.niger F0410.携多拷贝glaA的转化子用150μg/mL潮霉素抗性筛选并通过荧光实时定量PCR鉴定.结果表明,在染色体整合2～3倍糖化酶基因对糖化酶的过量合成是适宜的,有助于提高糖化酶活力.对转化子进行摇瓶发酵研究,发酵终止时转化子GB0506的糖化酶活力比出发菌株F0410提高了17.5%.因此,增加黑曲霉染色体糖化酶基因的拷贝数可以显著提高糖化酶活力.
作者：姚婷婷王衍敏顾建龙王正祥 YAO Ting-Ting WANG Yan-Min GU Jian-Long WANG Zheng-Xiang 作者单位：姚婷婷,王正祥,YAO Ting-Ting,WANG Zheng-Xiang(江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,无锡,214036)
王衍敏,顾建龙,WANG Yan-Min,GU Jian-Long(江阴市百圣龙生物工程公司,江阴,214406)
刊名：生物工程学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2006 22(4) 分类号：Q78 关键词：黑曲霉糖化酶基因克隆染色体整合摇瓶发酵。
黑曲霉AS3.4309产糖化酶培养条件的研究
题目：黑曲霉AS3.4309产糖化酶培养条件的研究学院：生命科学院专业：生物技术姓名：学号：指导教师：毕业设计（论文）时间：2010年3月1 日～6月25日共17 周中文摘要对黑曲霉AS3.4309产糖化酶的培养条件进行了研究。
采用糖化力较强的黑曲霉进行液态培养，在单因素实验的基础上，采用4因素3水平正交实验对其产糖化酶的培养条件进行优化。
结果表明，该菌株产糖化酶的最优培养基组成为：玉米粉15%，玉米浆7%，麸皮5%，豆粕粉2%，(NH4)2SO40.15%；培养条件为：接种量10%，发酵液起始pH4.5，30℃，200r/min，摇瓶培养4d，最高酶活力达到382.734U/ml。
关键词：黑曲霉；糖化酶；发酵AbstractThe liquid fermentation conditions for the glucoamylase production by Aspergillus niger AS3.4309 were studied. Based on single factor test, the glucoamylase production conditions were optimized by L9(34)orthogonal test. The results indicated that the optimal medium contained 12% corn starch,1%corn steep liquor,3%bran,2%soybean flour and 0.15%(NH4)2SO4.The culture conditions were as follows: inoculum size 10%,initial pH 4.5,temperature 30℃,shaker speed 200 r/min and culture time 4d. Under above conditions ,the highest glucoamylase activity reached382.734U/ml.Key words: Aspergillus niger ;glucoamylase ; fermentation目录中文摘要 (2)ABSTRACT ...................................................................................................... 错误!未定义书签。
黑曲霉生产糖化酶及酶活测定
第19卷 第7期 牡丹江大学学报 Vol.19 No.7 2010年7月 Journal of Mudanjiang University Jul. 201092 文章编号：1008-8717（2010）07-0092-03黑曲霉生产糖化酶及酶活测定单 海 艳（牡丹江大学，黑龙江 牡丹江 157000）摘 要：本文对黑曲霉突变株Uv11－48生产糖化酶液体深层发酵进行了全程生产工艺的研究，证实了黑曲霉突变株是一种产孢力强、抗污染能力强、易培养的糖化酶生产菌，经液体深层通风发酵可得出：只要充分利用突变株的有利条件，掌握好菌种特性，合理配制营养，控制好发酵条件，便可获得高酶活力的高产糖化酶。
本实验还运用了几种酶活力测定方法，以资进行优劣探讨。
关键词：黑曲霉；液体通风发酵；糖化酶；酶活力 中图分类号：Q-331 文献标识码：B 一、前言（一）黑曲霉菌种特性 1．黑曲霉的分类地位黑曲霉在分类学上处于：真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、曲霉属、黑曲霉群，拉丁学名：Aspergillus niger 。
2．黑曲霉形态、生理、生态特性孢子头呈暗黑色，菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成，菌丝黑褐色，顶囊球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。
一般进行无性生殖，其可育细胞称足细胞。
3．黑曲霉突变株的形态、生理、生态、特征 在查氏培养基上菌落曲型为炭黑色，有辐射沟纹，从菌落边缘向中心，分化为伸长部位，活性部位，成熟部位，老化部位几个区域即孢子萌发最早出现于中心部位是伸展部位，并逐渐形成密生部位，分生孢子部位，最后在中心出现的是成熟部位，菌落背面无色或稍黄。
（二）糖化酶的分类、地位、性质及用途 1．糖化酶在国际酶学委员会，在系统命名法中的地位糖化酶是淀粉酶，在系统命名法中属水解酶类。
2．糖化酶的性质糖化酶（glucamylase ）又名糖化型淀粉酶（glueoamylase ）或淀粉葡萄糖苷酶。
其系统名称为淀粉α1.4-葡萄聚糖水解酶。
黑曲霉诱变产糖化酶
诱变黑曲霉提高糖化酶的生物合成摘要现今，筛选黑曲霉主要通过物理和化学突变。
用溴化乙錠和甲基磺酸乙脂（EMS）轮流处理亲代菌株。
这株突变菌株M4能产生更多的糖化酶。
简介糖化酶时淀粉工业中最重要的一种酶。
它能将淀粉水解成葡萄糖。
葡萄糖在各种食品行业中是一种必要的合成原料。
糖化酶广泛地应用于酿造，造纸，食品，制药，纺织行业中。
黑曲霉通过液态或固态发酵生产糖化酶中，食物残渣也能被利用到。
同时，食物残渣也能用于葡萄糖和啤酒行业中。
糖化酶是一种微生物的胞外酶，并且，它典型的性质是水解a-1，4和a-1，6糖苷键，通过其他酶作用于淀粉合成糖类。
糖化酶能水解非还原端的a-1，4葡萄糖苷键。
糖化酶能被成倍的生成，通过引起野生菌株突变。
据报道，黑曲霉的突变菌株能更好地生产糖化酶。
这种黑曲霉菌株能被紫外线照射或者化学的方法诸如N-甲基，N-硝基，N-亚硝基胍，硫酸二甲脂，甲基磺酸乙脂，溴化乙錠和亚硝酸来引诱突变，提高糖化酶产量。
突变菌株产糖化酶的特性能更好地影响对生淀粉的处理。
生产糖化酶的突变菌株在r-射线的处理下，亲代菌株的特性被改善并且产物乙醇的产量也被提高了。
这个突变黑曲霉是用联合诱变处理的，它产的糖化酶能将麦芽糊精转变为葡萄糖。
多重的轮流突变对葡萄糖的生成有着很好的影响。
糖化酶的比活度和它的热稳定性被提高。
并且，结果通常是提高葡萄糖产量。
对比几种黑曲霉突变株的酶产量和它们的特性，相比于野生株，突变株能更高水平地生产糖化酶。
但是，不管使用怎样的菌株，对所有糖化酶来说，酶的组成和特性都是类似的。
Britly进行本研究的目的是为了证明以小颗粒的形式增长有利于糖化酶生产，而大颗粒的形式则降低了糖化酶的生产量，导致结果不匹配。
现今研究这些的目的是为了激发菌株的潜能，通过化学或者无力突变来增加糖化酶的产量。
原料和方法改善菌株：黑曲霉能通过紫外线和诱变剂得以改善。
用溴化乙錠和甲基磺酸乙脂轮流处理亲代菌株。
两种诱变剂同时使用。
响应面法优化高产糖化酶的黑曲霉突变菌株制备糯米酒酒曲工艺研究
响应面法优化高产糖化酶的黑曲霉突变菌株制备糯米酒酒曲工艺研究崔敬爱;邵智韬;徐岩;戴碧玮;庄若岩;曹勇;陈海燕;陈晓平【期刊名称】《食品与发酵科技》【年(卷),期】2018(054)003【摘要】本文利用经电子束辐照后高产糖化酶的黑曲霉突变菌,复合Q303米根霉制曲.根据单因素实验结果,通过响应面法优化制备糯米酒酒曲工艺.结果表明:在制曲温度29.7℃、制曲时间50.6h、接种量0.18%、黑曲霉与米根霉菌种配比(质量比)1.09∶1条件下,酒曲的糖化力为580.1mg/g·h,多项验证实验值在95%的置信区间内,符合预测值.【总页数】5页(P101-105)【作者】崔敬爱;邵智韬;徐岩;戴碧玮;庄若岩;曹勇;陈海燕;陈晓平【作者单位】吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春 130118;吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春 130118;吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春 130118;吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春 130118;吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春 130118;吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春130118;长春科技学院,吉林长春 130600;吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春 130118【正文语种】中文【中图分类】TS261.1+5【相关文献】1.黑曲霉糖化酶基因表达调控的研究：I.高产及低产菌株糖化酶表达… [J], 乔殿华;唐国敏2.黑曲霉糖化酶高产和低产菌株糖化酶基因调控区的克隆及其分析比较 [J], 钟丽婵;乔殿华3.响应面法优化薏米糯米酒发酵工艺研究 [J], 王含;郭淼4.酒曲中高产糖化酶霉菌的筛选及其固态发酵产酶条件优化 [J], 刘茗铭;周阳子;袁乐梅;刘新玉;边名鸿5.黑曲霉突变菌株产糖化酶的酶学特性表征 [J], 崔敬爱;戴碧玮;邵智韬;徐岩;庄若岩;曹勇;陈海燕;陈晓平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
黑曲霉固态发酵产糖化酶的研究
黑曲霉诱变方法比较研究
由于自然突变几率很低，在育种中只靠自然突变获得变体的数量很少，要从群体中筛出个别有价值的优良变异体的机会就更少。
应用物理、化学或生物因子提高突变率，能够获得有价值的优良突变体，所以目前诱发突变已广泛应用于微生物育种等许多方面。
诱变育种就是利用物理、化学或生物因素，使微生物体内的遗传物质———DNA的分子结构发生改变，及产生基因突变，从而导致微生物的性状发生变异。
然后用一些方式将少数有益的变异株选出来，从而达到获得优良菌株的目的。
诱变育种的方法有物理诱变、化学诱变以及复合诱变。
现存资料有关对黑曲霉的诱变报道中，所采用的方法大多是紫外线物理诱变、亚硝酸或亚硝基胍化学诱变以及两者结合的复合诱变[1]。
本研究在此基础之上，比较了黑曲霉的紫外诱变与复合诱变的效果，希望能够为以后深入的研究提供一个参考依据。
1材料与方法1.1材料黑曲霉(Aspergillus niger A3)菌种：哈尔滨微生物研究所；α—淀粉酶；木瓜蛋白酶：南宁海江贸易有限公司；小麦麸皮：黑龙江地产。
1.2方法1.2.1木聚糖粗提物的制备将麦麸配制成一定底物浓度的溶液，装于1000mL 锥形瓶中在沸水浴中煮沸15min，冷却后加入一定量的蛋白酶，在水浴中维持50℃，反应4h，以除去麸皮中的蛋白质。
水解结束后将水浴升温到80℃，维持20min对酶进行灭活，冷却。
用油布进行过滤，残渣用蒸馏水反复冲洗，直至滤液澄清为止。
所得残渣再次配成一定底物浓度的溶液，加入一定量的α—淀粉酶，在95℃搅拌酶解25min，以除去麸皮中的淀粉。
冷却，用油布进行过滤，残渣用蒸馏水反复冲洗,直至滤液澄清为止。
将麸皮平铺于滤纸上，自然晾干。
1.2.2培养基斜面培养基：马铃薯培养基。
陈凤莲１，２，方桂珍２，许世玉２（1．哈尔滨商业大学，黑龙江哈尔滨150076；2．东北林业大学，黑龙江哈尔滨150046）黑曲霉诱变方法比较研究摘要：黑曲霉A3为出发菌株，采取两种方法对其进行诱变处理，第一种是利用紫外线进行物理诱变，第二种是利用紫外线和亚硝酸进行复合诱变，以得到产木聚糖酶较高的菌种，利用其产木聚糖酶来降解小麦麸皮中木聚糖得到低聚木糖。
产高活性糖化酶黑曲霉的筛选工艺研究
1 实验材料
1.1 实验原料及试剂
本实验室保藏的菌株；试剂均为分 析纯，由中科生物工程有限公司提供。 1.2 培养基
筛选培养基：硝酸钠 0.3%、硫酸 亚铁 0.001%、硫酸镁 0.05%、磷酸氢 二钾 0.1%、氯化钾 0.05%、蔗糖 3%、 玉 米 淀 粉 1.0%、 琼 脂 1.5% ～ 2%， 自然 pH。
关键词：突变株；酶活力；筛选
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
黑曲霉（Aspergillus niger）属于 子囊菌门，散囊菌纲，散囊菌目，发 菌科，曲霉属的一种丝状真菌，由于 其强大的蛋白分泌能力，已被广泛应 用于发酵工业中 [1]。
糖 化 酶 属 于 糖 苷 水 解 酶 类 蛋 白， 大多数动植物以及微生物都能在细胞中 合成糖化酶，其中真核微生物如丝状真 菌和酵母菌由于在生产和分泌方面的优 势使其成为微生物生产糖化酶的重要来 源 [2]。从 20 世纪 50 年代开始，已有大 量关于黑曲霉产糖化酶的研究 [3]。
子都已死亡。 选取透明圈 / 菌株比值直接最大
的 菌 株（ 紫 外 线 照 射 11 min）， 保 存，命名为 SK-2。与最初菌株进行摇 瓶对照实验，结果表明 SK-2 比原菌株 的产酶能力提高 10.8%，摇瓶活力达 2 604.2 U/mL。
3.2.2 DES 诱变 测 量 后， 计 算 比 值。 诱 变 0~ 15 min 时，随时间的增加，致死率上升； 在 20 min 以后，致死率达到 87% 左 右。选取致死率在 70%~80%、透明圈 / 菌株比值直接最大的菌株（DES 诱变 处理 15min），说明诱变效果最好， 突 变 菌 株 产 酶 最 多， 保 存， 命 名 为 SK-3。与最初菌株进行摇瓶对照实验， 结果表明 SK-3 比原菌株的产酶能力提 高 9%，摇瓶活力达 2 562.0 U/mL。 3.2.3 遗传稳定性实验 由测定结果可知，经过 8 次传代实 验以后，突变菌株的 8 代所表现的产酶 能力较为稳定，测得的酶活在 2 336~ 2 773 U/mL。其中第 6 代菌株的酶活最 高，为 2 773 U/mL，与最初菌株进行 摇瓶对照实验，结果表明比原菌株的产 酶能力提高 17.98%，命名为 SK-4。
黑曲霉诱变产糖化酶
诱变黑曲霉提高糖化酶的生物合成摘要现今，筛选黑曲霉主要通过物理和化学突变。
用溴化乙錠和甲基磺酸乙脂（EMS）轮流处理亲代菌株。
这株突变菌株M4能产生更多的糖化酶。
简介糖化酶时淀粉工业中最重要的一种酶。
它能将淀粉水解成葡萄糖。
葡萄糖在各种食品行业中是一种必要的合成原料。
糖化酶广泛地应用于酿造，造纸，食品，制药，纺织行业中。
黑曲霉通过液态或固态发酵生产糖化酶中，食物残渣也能被利用到。
同时，食物残渣也能用于葡萄糖和啤酒行业中。
糖化酶是一种微生物的胞外酶，并且，它典型的性质是水解a-1，4和a-1，6糖苷键，通过其他酶作用于淀粉合成糖类。
糖化酶能水解非还原端的a-1，4葡萄糖苷键。
糖化酶能被成倍的生成，通过引起野生菌株突变。
据报道，黑曲霉的突变菌株能更好地生产糖化酶。
这种黑曲霉菌株能被紫外线照射或者化学的方法诸如N-甲基，N-硝基，N-亚硝基胍，硫酸二甲脂，甲基磺酸乙脂，溴化乙錠和亚硝酸来引诱突变，提高糖化酶产量。
突变菌株产糖化酶的特性能更好地影响对生淀粉的处理。
生产糖化酶的突变菌株在r-射线的处理下，亲代菌株的特性被改善并且产物乙醇的产量也被提高了。
这个突变黑曲霉是用联合诱变处理的，它产的糖化酶能将麦芽糊精转变为葡萄糖。
多重的轮流突变对葡萄糖的生成有着很好的影响。
糖化酶的比活度和它的热稳定性被提高。
并且，结果通常是提高葡萄糖产量。
对比几种黑曲霉突变株的酶产量和它们的特性，相比于野生株，突变株能更高水平地生产糖化酶。
但是，不管使用怎样的菌株，对所有糖化酶来说，酶的组成和特性都是类似的。
Britly进行本研究的目的是为了证明以小颗粒的形式增长有利于糖化酶生产，而大颗粒的形式则降低了糖化酶的生产量，导致结果不匹配。
现今研究这些的目的是为了激发菌株的潜能，通过化学或者无力突变来增加糖化酶的产量。
原料和方法改善菌株：黑曲霉能通过紫外线和诱变剂得以改善。
用溴化乙錠和甲基磺酸乙脂轮流处理亲代菌株。
两种诱变剂同时使用。
菌种报告-黑曲霉
菌种报告—黑曲霉一、黑曲霉简介①、黑曲霉（Aspergillus niger）属于半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。
可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等，是重要的发酵工业菌种。
②、培养温度23～28℃，好氧二、使用注意事项①、是四类病原微生物，即在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物。
但由于生长快速，极易通过空气扩散污染环境，对产品的生产检验人员与环境构成威胁。
故操作过程要在阳性室生物安全柜中进行。
②、所有的培养物、储存物及其它的废物在释放前，均应121℃，30min湿热蒸汽灭菌。
实验结束后，用0.1%的新洁尔灭擦拭台面，照紫外消毒。
菌种保存方案—黑曲霉（Aspergillus niger）1、实验材料：器具：-80℃冰箱，2～8℃冰箱，试管，电动助吸器，锥形瓶，恒温培养摇床，1ml移液管，10ml移液管，冷冻管，振荡器，棉塞，接种环，250ml盐水瓶，500ml 盐水瓶试剂：冻干菌种，改良马丁培养基，改良马丁琼脂培养基，TSA平板，SDA平板，20%甘油，含0.05%（v/v）聚山梨酯80的生理盐水2、实验步骤：2.1 菌种复苏和复壮（改良马丁培养基）2.1.1 将干菌种（0代）按上述步骤转移到装有100ml改良马丁液体培养基的锥形瓶中复苏（第1代），23～28℃摇床震荡培养5天。
2.1.2 用接种环挑起活化后的孢子悬液，划线到改良马丁琼脂斜面复壮，接种10支试管（第2代），23～28℃静置培养5～7天。
2.1.3 向每支试管中加入5ml含0.05%（v/v）聚山梨酯80的生理盐水，反复吹打洗脱孢子。
将孢子悬液全部转移至250ml盐水瓶中，2～8℃冻存备用。
2.2 稀释倍数探索2.2.1 取1ml孢子悬液加入9ml生理盐水中，混匀得10-1管，同法依次稀释至10-6。
2.2.2 取10-3～10-6梯度稀释孢子悬液，1ml涂布SDA平板，各做3个平行。
黑曲霉液态发酵产糖化酶条件的研究
３ ． Ａ ｎ ｈ ｕ ｉ Ｓ ｏ ｌ ｉ ｄ － ｓ ｔ ａ ｔ ｅ ｆ ｅ ｒ ｍ ｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｉ ｒ ｎ ｇ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｙ ｇ Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ， Ｂ ｏ ｚ ｈ ｏ ｕ ， Ａ ｎ ｈ ｕ ｉ ２ ３ ６ ８ ２ ０ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
ｍａ ｔ ｅ ｒ ｉ ｌ ａ ｄ ｏ ｐ ｅ ｐ ｔ ｏ ｎ ｅ ，２ ９℃ ｉ ｎ ｃ ｕ ｂ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ， Ａｓ ｐ ｅ ｒ ｇ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｎ ｉ ｇ ｅ ｒ ｃ ａ ｌ ｌ ｂ ｅ ｕ ｓ ｅ ｄ ａ ｓ ｈｅ ｔ ｏ ｐ ｔ ｉ ｍａ ｌ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｘ ｉ ｍｕ ｍ ｇ ｌ ｕ ｃ ｏ ａ ｍｙ ｌ ａ ｓ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ．
Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄ ｓ ： ａ ｓ ｐ ｅ ｒ ｇ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ； ｌ ｉ ｑ ｕ ｉ ｄ； ｆ ｅ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ； ｇ ｌ ｕ ｃ ｏ ａ ｍｙ ｌ ａ ｓ ｅ
葡 萄糖 淀 粉 酶简 称 糖化 酶 ， 可 水 解 淀粉 、 糊精 、
黑 曲霉 。 １ ． １ ． ２ 实验 试剂 可 溶 性 淀粉 、 葡 萄糖 、 酵母 膏 、 琼脂 、 蛋 白胨 、 硫 酸铜 、 次 甲基蓝 、 亚铁 氰 化钾 、 氢 氧 化钠 、 硫 酸亚 铁 、
１ ． １ － ３实验 主要 仪 器 恒 温培 养箱 、 立 式 自动 电热压力 蒸 气灭 菌 锅 、 数
糖原等物质 ， 产物为葡萄糖 。 在工业发酵生产酒精、 有机酸 、 氨基酸等过程中淀粉液化后 的糖化酶作用
紫外光对黑曲霉进行诱变提高糖化力
、
每 步 处 理 提 高 产 量 幅度
等 缺 点 须 视 具 体 情 况 采 用 本 试 验 对 两 株 黑 曲霉 菌种进 行 了 紫 外 光 诱 变 试 图 以 此 提
,
高 其糖化酶活性
已 取 得 较 显 著 的 结果
现 报道如 下
。
材 料 与 方法
供试菌株
黑 曲霉 ’
,
’
菌 株从 自然 界 分 离 纯 化 并 经 多 次 筛 选
,
及
干抱子
单位
均 为 两 瓶 发 酵 液 测 定 结 果 的平均 数
,
抱 子 悬 浮 液两 种 不 同处 理 中
, ,
经过培养测定
前 者 诱 变效 果 不 明 显
。
其原 因 与
,
紫 外 光 的 穿 透 性 能 差 对 不 均 匀 分 散 的 样 品 处 理 效果 欠 佳 有 关 而 对 均 匀 分 散 的抱 子 悬 浮 液
、 、
,
、
,
因 此在 生 产上 糖化 酶 制剂 有着 一 定
。
,
,
它 活性高
,
、
使用方便
,
故使用较普遍
, ,
。
国 内商 品 糖 化 酶 制 剂 主 要 来 自微 生 物 中的 黑
根霉等
其 菌种质量 的优 劣
,
决 定 着 糖 化 酶 产量 的 高 低 及 淀 粉分 解 的 得 率 和 效 果
,
历
。
来 人 们 用 这 些 微 生 物 生 产酒 曲 使 淀 粉分 解 为 葡 萄 糖 供 酵 母 菌 发 酵 生 产酒 精 及 各 种 白酒
在发 酵工 业 方面 则 利 用 淀 粉 转 化 为糖 后 进 行 发 酵
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收稿日期:2000-03-13作者简介:郝林,山西农业大学食品系食品微生物教研室主任、副教授、硕士研究生导师。
糖化黑曲霉复壮方法的研究郝 林1,陈立新2,司俊玲1,贾 莉1(1山西农业大学食品科学系,山西太谷030801;2山西省太谷县科委,山西太谷030800)摘要:采用透明圈法对糖化黑曲霉AS31324和AS314309的复壮方法进行研究,选出了三种适合的筛选培养基,确定了具体的操作步骤。
复壮后菌株的麸曲糖化酶活力分别比退化的出发菌株的麸曲糖化酶活力提高45%和44%。
关键词:透明圈;糖化酶活力;黑曲霉;复壮中图分类号:TS26111+2;TS26111+5文献标识码:A 文章编号:1002-8110(2000)03-0045-03黑曲霉是我国白酒及食醋企业使用的重要糖化菌。
在一些中、小企业中,由于缺少微生物学方面的专业人员,对微生物的遗传变异及菌种退化缺乏了解,因而对生产菌种退化无力解决,只好定期购买菌种。
实际上,菌种退化是指群体中退化个体在数量上占一定数量后,所表现出的菌种生产性能的下降。
因此完全有可能采取一些相应措施,使退化菌种复壮。
狭义的复壮是指已发生退化的菌种,通过纯种分离和性能测定等方法,从退化的群体中找出尚未退化的少数个体,以恢复该菌种原有典型性状的一种措施。
广义的复壮则是在菌种的生产性能尚未退化前就经常有意识地进行纯种分离,以期使菌种的生产性能逐渐提高,它实际上是一种利用自发突变在生产中进行选种的工作。
本研究根据上述原理,经过对有关资料介绍的方法进行试验比较,得到了一种较好的透明圈筛选方法。
1 材料与方法111 菌种AS31324和AS314309均为本教研室多年传代保藏的材料。
112 设备及器皿高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、电炉、酒精灯、三角瓶、培养皿、试管、吸管及糖化酶活力测定所需用具等。
113 培养基及试剂A 培养基:可溶性淀粉10g 、NaNO 3lg 、K C1015g 、K 2HPO 4015g 、MgS O 417H 2O 015g 、琼脂20g ,加水至1000ml 、自然pH 。
B 培养基:蛋白胨10g 、淀粉10g 、NaNO 33g 、K Cl 015g 、FeS O 40101g 、K 2HPO 41g 、MgS O 4015g 、蔗糖20g 、琼脂18g 、水1000ml 。
C 培养基:NaNO 33g 、K 2HPO 41g 、K Cl 015g 、MgS O 4015g 、FeS O 40101g 、琼脂20g ,麸皮150g 加少量水浸泡30min 后用纱布过滤,再次加水过滤一次,将两次得到的麸皮浸出液加水定容至1000ml [1]。
D 培养基:可溶性淀粉4g 、蛋白胨10g 、NaCl 5g 、牛肉膏3g 、琼脂20g 、加水至1000ml ,pH712[2]。
碘液:首先将碘化钾2g 溶于5-10ml 水中,再加入碘1g ,使其溶解后加水至300ml 。
114 试验方法11411 为了避免非退化性的种性变化给复壮分离工作带来的失误,对于在冰箱中经过长期保藏的菌种,在进行复壮分离前要进行菌种活化,使菌种中的不同个体能够充分表达出它应有的个性。
菌种活化就是将保藏的试管斜面菌种转接到新的试管斜面上,经过培养,待长出孢子后再转入另一支试管斜面上培养,待长满孢子后备用。
如果用于复壮分离的菌种是新转接的菌种或是新制成的种曲,则可省去活化过程。
・54・2000年第3期(总第138期)N o 13 2000 T ol 1138 酿 酒NIANGJ IU 11412 将上述四种培养基分别加热溶解及融化,装入三角瓶中,在011MPa 、121℃灭菌20min ,然后倒入培养皿中制成平板备用。
11413 挑取经过活化的菌种孢子,接入内含10ml 无菌水的试管中,制成孢子悬液,并在此基础上,继续稀释成10-3、10-4等稀释度的孢子悬液。
稀释时可利用血球计数板推断选择适宜稀释度的孢子悬液。
方法是当整个计数室中只有一个孢子时,可再经过100至1000倍稀释,使每011ml 孢子悬液含孢子10个左右。
本试验选择10-3、10-4两个稀释度的孢子悬液进行平板涂布接种,用1ml 无菌吸管吸取孢子悬液011ml 注入平板内,用三角形玻璃棒涂布器在培养基平板表面均匀涂布,然后盖上皿盖。
11414 将培养基平板倒置于培养箱内30℃培养3-4d ,用碘液作显色剂,倒于菌落周围轻轻旋转平板使碘液均匀铺满整个平板,3-4min 内测量菌落周围的透明圈及菌落大小。
该圈的形成是由于微生物产生淀粉酶使菌落周围的淀粉水解,因而不能与碘形成淀粉—碘络合物呈现蓝色。
11415 挑取生长快、透明圈宽的菌落中心部的孢子移入试管斜面上培养使其长出孢子成为初筛试管菌株。
11416 对初筛菌株进行三角瓶小样制曲。
三角瓶麸曲培养基的配制方法:麸皮150g 、水140ml ,用H 2S O 4调至pH415-5,物料拌匀后装入三角瓶内以115cm 厚为宜,121℃、30min 灭菌后摇散冷却备用。
接种时从试管菌株斜面上挑取3环孢子,接入三角瓶内摇匀后,置于30℃培养箱内培养,等物料结饼明显时进行扣瓶培养,使上下部分菌体生长一致,当孢子略发褐色或黑色时停止培养,自然风干后进行糖化酶活力测定。
注意避免阳光直射和过高温度。
11417 糖化酶活力测定采用G B8276-87方法[3]。
2 结果与分析211 不同筛选分离培养基的培养效果由表1可见,除A 培养基外其余3个培养基均适合AS31324和AS314309生长。
C 培养基透明度差,对透明圈的观测有妨碍,需要对麸皮浸出液采取更好的过滤方法加以解决。
212 筛选菌株性状表现表1四种筛选培养基的培养效果比较(30℃、72h )培养基菌株平均菌落直径(mm )培养基状况A AS31324AS31430911平板透明B AS31324AS314309615214平板透明C AS31324AS3143091016618平板混浊不透明D AS31324AS314304715615平板透明 表2 初筛菌株的透明圈和糖化酶活力初筛菌株培养基培养时间(h )菌落直径(mm )透明圈宽(mm )麸曲糖化酶活力(u/g )小样麸曲长势AS31324-h1D 7271142743强、快AS31324-h2D 87832082强、快AS31324-h3D 87832140强、快AS31324-h4D 87933526强、快多年传代的AS313242436中AS314309-h1C 72542871强、快AS314309-h2C 7231533631强、快AS314309-h3C 72443103中AS314309-h4B 8722112726强、快AS314309-h5B 87222088AS314309-h6B 87222569强、快AS314309-h7B 87333187强、快AS314309-h8B 8722153045强、快AS314309-h9B 96543103强、快AS314309-h10B 96552709中AS314309-h11B 96552122强、快AS314309-h12B 96553056强、快AS314309-h13B96553085中多年传代的AS3143092523中 由表2可见,AS31324在D 培养基上可形成适当宽度的透明圈,AS314309在C 、B 培养基上都可以形成较宽的透明圈。
透明圈的宽窄与酶活力、培养基成份及培养条件有关。
适宜的宽度对直观比较不同菌株之间酶活力大小是重要的。
透明圈不应过窄、边缘应当清楚。
本试验中的透明圈都十分明显、边缘・64・ 酿 酒NIANGJ IU 2000年第3期(总第138期)N o 13 2000 T ol 1138 清楚且大小适宜。
所选菌株AS31324-h4麸曲糖化酶活力达3526u/g ,比本教研室多年传代的AS31324麸曲糖化酶活力提高45%。
所选菌株AS314309-h2麸曲糖化酶活力为3631u/g ,比本室多年传代的AS314309麸曲糖化酶活力提高44%。
在制备三角瓶小样麸曲时发现,所选菌株AS31324-h4和AS314309-h2都比原出发菌株生长快、长势强,制曲培养时间缩短。
3 结论进行糖化黑曲霉复壮可利用本研究所使用的B 、C 、D 三种培养基,通过纯种分离并结合透明圈宽度大小进行初筛,然后再结合糖化酶活力测定进行复筛,最后选出最佳菌株。
当然菌种的复壮除了应考虑主要生产性状外,还应兼顾其它次要生产性状。
C 培养基透明度差可以在麸皮浸出液制备时把用双层纱布过滤改为用脱脂棉过滤加以解决。
研究中发现透明圈宽度的大小及与其菌落直径比值的大小,在小范围内并不与糖化酶活力的高低简单对应。
因此,笔者认为透明圈宽度的大小只能作为初筛的依据,对某菌水解淀粉能力的强弱进行初步判断。
初筛一定要保证足够的数量,避免漏掉优良的菌株。
只有依据糖化酶活力实测结果进行复筛,才能保证筛选出好的菌株。
菌种复壮是一项细致复杂的工作,需要长期坚持进行,使生产菌株的生产性能不但不退化,而且能逐渐提高。
[参考文献][1]罗维,孙高翔,刘永婷等1应用曲霉菌淀粉酶透明环育选菌种的研究[J ]1酿酒,1997,(3):28-291[2]谢广发,夏祖宏1筛选糖化菌的方法—透明圈法[J ]1中国酿造,1998,(1):301[3]上海市酿造科学研究所1发酵调味品生产技术(修订版)[M]1北京:中国轻工业出版社,1998,65-691Studies on R ejuvenescent Method of Saccharifying Aspergillus nigerHao Lin 1,Chen Li -Xin 2,Si Jiun -ling Jia Li1(Department of F ood Science ,Shanxi Agricultural University ,T aigu 030801China )Abstract This paper studied the rejuvenescent method of saccharifying Aspergillus niger AS 31324and AS314309,used the transparent ring 1The results were to obtain three kinds of suitable medium and concrete operative step 1The saccharifying enzymic activity of rejuvenated strains were separately 45percent and 44percent m ore than degenerate original AS 31324and AS3143091K ey Words :T ransparent ring ;Saccharifying enzymic activity ;Aspergillus niger ;Rejuvenation白酒生产许可证开始发放发证工作结束后,无证企业将被严厉查处据悉:国家质量技术监督局从4月开始审批和发放白酒产品生产许可证。