优选第三章基因工程载体
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大学优质课课件《基因工程》第三章 基因工程载体
多克隆位点(multiple cloning site)
复制起始点
ori
MCS
pUC Ampr 遗传标记
克隆载体具备的条件
①载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞， 或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA 上，随着染色体DNA的复制而同步复制。
②载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶 位点，即多克隆位点。
5.4 T-载体
6 质粒克隆载体的用途
用于保存和扩 作为核酸杂交时探针的来源。
二、 λ噬菌体载体
噬菌体的研究历史，是同分子生物学、分 子遗传学的创立和发展过程密切相关的。DNA 复制机理的阐明、转录的终止作用、连接酶和 解旋酶的发现、位点特异的重组作用、SOS修 复机制等，均是以噬菌体为材料取得的重要研 究成果。依据噬菌体的复制和生活周期等特点， 已经构建了许料。
⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷 酸序列。
一、质粒载体
质粒载体是以质粒DNA分子为基础构建而成 的克隆载体,主要用于smid )的概念：
独立于染色体外能够进行自我复制的双链DNA分子。 天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、 开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型。
pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切 识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部， 2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位 点插入外源片断可以导致tetr 基因的失活；另外有3种限制酶 在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，
Amp Tet
pBR322
322质粒分子。
5.3 pUC质粒系列
pUC质粒在pBR322基础上改建的，其组成如下： 含有pBR322完整的Ampr基因和复制起始点。 含有大肠杆菌-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其 编码-肽链的DNA序列，即lacZ’基因。 在lacZ’基因中靠近5’端的一段有MCS区段，但并 不破坏该基因的功能。
复制起始点
ori
MCS
pUC Ampr 遗传标记
克隆载体具备的条件
①载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞， 或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA 上，随着染色体DNA的复制而同步复制。
②载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶 位点，即多克隆位点。
5.4 T-载体
6 质粒克隆载体的用途
用于保存和扩 作为核酸杂交时探针的来源。
二、 λ噬菌体载体
噬菌体的研究历史，是同分子生物学、分 子遗传学的创立和发展过程密切相关的。DNA 复制机理的阐明、转录的终止作用、连接酶和 解旋酶的发现、位点特异的重组作用、SOS修 复机制等，均是以噬菌体为材料取得的重要研 究成果。依据噬菌体的复制和生活周期等特点， 已经构建了许料。
⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷 酸序列。
一、质粒载体
质粒载体是以质粒DNA分子为基础构建而成 的克隆载体,主要用于smid )的概念：
独立于染色体外能够进行自我复制的双链DNA分子。 天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、 开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型。
pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切 识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部， 2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位 点插入外源片断可以导致tetr 基因的失活；另外有3种限制酶 在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，
Amp Tet
pBR322
322质粒分子。
5.3 pUC质粒系列
pUC质粒在pBR322基础上改建的，其组成如下： 含有pBR322完整的Ampr基因和复制起始点。 含有大肠杆菌-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其 编码-肽链的DNA序列，即lacZ’基因。 在lacZ’基因中靠近5’端的一段有MCS区段，但并 不破坏该基因的功能。
基因工程-载体
质粒的复制过程 质粒的复制主要是通过θ型复制和滚环复制两种方式之一进行的，其中以θ型
复制为主。在θ型复制中，有单向半保留复制和双向半保留复制。
θ型复制
Ori复制起点
滚环复制
在革兰氏阳性细菌中大多数质粒是以滚环方式复制。
复制起点(ori)区的功能 复制起点是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，在其相关的调控元件中 含有由质粒或宿主染色体编码的、参与DNA合成起始调控因子的结合位点。 在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于ori序列附近，因此ori位点周 围的小范围DNA是质粒复制所必需的。 如果质粒DNA的大部分区域被去掉，而只保留质粒的ori序列，而且质粒是环 状的，则质粒仍然能进行复制。 将ori区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNA分子上并引入到原核细胞后， 该重组DNA具有自主复制能力。分子克隆中常用的质粒载体就是以这种方法构建 的，同时用这种方法可以确定哪部分DNA是ori区并研究ori区的功能。 ori区域常决定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。
理想质粒载体必须具备的基本条件：
1、具有复制起点（ORI） 2、具有抗菌素抗性基因：是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性 基因。 3、若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源DNA片断。且插入后不影响 复制功能。 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。
质粒的选择标记及其工作原理：
抗菌素抗性
pBR322的缺点
保留了转移蛋白（mob）的作用位点。能够被pColK质粒编码的mob蛋白识别， 如果再有F质粒的参与，就有可能转移！
pBR322的改良
删除mob识别位点 如pAT153，pBR322的改造衍生质粒，除去了mob识别位点，同时增加质粒的
第三章 基因工程载体
②对colicin E1敏感的细菌群体中自发突变产
生抗colicin E1的频率很高！
插入片断
抗 colicinE1
仍抗 colicinE1
ColE1
杀ColE1-
ColE1
不杀ColE1-
质粒克隆载体构建
过程：严密的实验设计→构建（切割、修饰和连接重组）
构建原则
1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如ori、选择标 记、克隆位点、启动子和终止子 2、正确获得构建质粒克隆载体的元件 3、组装合适的选择标记基因 4、选用合适的启动子 5、构建过程力求简单
阻遏基因 I 操纵基因O 启动基因P 核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。
五、经典的大肠杆菌质粒载体
1. pSC101
第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。
（1）类型 天然质粒，属低拷贝型。
（2）长度
9.09 kb。
（3）选择标记 四环素抗性Tetr
（4）克隆位点 6个克隆位点：
迁移作用
不含tra基因而含bom（oriＴ）位点的质粒，当宿主
细胞存在辅助质粒mob基因产物时，即可打开oriＴ位
点，非结合质粒借助接合质粒tra基因的产物而迁移
入受体细胞。
质 粒 的 迁 移 作 用
1. 接合型质粒：
除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带 有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
（3）失控的质粒载体 runaway plasmid vectors
这是一类温度敏感型复制控制质粒。 1979年B. E. Uhlin等构建。 如pBEU1、pBEU2。
温度低（低于37 oC），拷贝数很少；
温度增加（>40 oC）时，拷贝数会很快增加到 1000个以上。
基因工程第三章基因工程的载体
基因工程载体的种类
质粒载体
质粒是一种裸露的、独立于细菌 拟核DNA之外的DNA分子，具有 自我复制能力，可携带外源DNA 片段。
病毒载体
病毒载体是指能够将外源DNA片 段插入到病毒基因组中，并利用 病毒的复制机制将外源DNA片段 导入到受体细胞中的媒介。
基因工程载体的作用
基因转移
基因工程载体能够将外源DNA片 段导入到受体细胞中，实现基因 的转移和表达。
通过优化载体结构，提高其在宿主细胞内的稳定性，降低丢失和突变 的风险。
开发NA的载体，提高基因工 程的效率和安全性。
拓展载体功能
通过基因工程技术对载体进行改造，赋予其新的功能，如表达调控、 靶向输送等。
智能化载体
利用合成生物学和纳米技术，开发具有智能响应能力的基因工程载体， 实现基因治疗的精准化和个性化。
利用基因工程载体生产食品添加剂、 酶制剂等，提高生产效率和产品质量。
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此外，噬菌体载体还可以用于疫苗研 发和生物治疗等领域。
04 人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体是一种通过基因工程技术 构建的染色体，具有与天然染色体相 似的结构和功能。
人工染色体具有高容量、可定制和可 调控等特性，能够承载和表达大量的 外源基因，为基因治疗、生物制药等 领域提供了新的工具。
质粒载体的应用
总结词
质粒载体在基因工程中广泛应用于基因克隆、表达和基因治疗等领域。
详细描述
质粒载体此外，质粒载体还可以用于基因治疗和疫苗研制等领域， 为疾病治疗和预防提供了新的手段。
03 噬菌体载体
噬菌体的生物学特性
基因克隆
基因工程载体可作为基因克隆的 工具，将外源DNA片段插入到载 体中，通过复制和扩增实现基因 克隆。
zj基因工程第3章(载体)[可修改版ppt]
![zj基因工程第3章(载体)[可修改版ppt]](https://img.taocdn.com/s3/m/326e05ca6c85ec3a86c2c522.png)
原核生物启动子保守序列
-35区
-10区
RNA转录起始
trp
TTGACA N17 TTAACT N7
A
tRNATyr TTTACA N16 TATGAT N7
A
lac
TTTACA N17 TATGTT N6
A
recA TTGATA N16 TATAAT N7
A
Ara BAD CTGACG N16 TACTGT N6
的过程应力求简单。
质粒载体 4 常用的质粒载体类型
4.1 克隆质粒载体
质粒克隆载体的用途： ①用于保存和扩增片杂交时探针的来源。由于现在核酸标记方
法的成熟，将质粒载体上的目的基因切下并标记即 可作为核酸杂交探针，现在的DNA杂交探针大部分 来源于质粒。
T载体
质粒载体 4 常用的质粒载体类型
4.2 表达质粒载体
表达质粒载体是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋 白质的质粒载体。 表达质粒载体必须具有： ①强启动子，可诱导的强启动子可使外源基因有效地转录。 ②在启动子的下游区和ATG上游区有一个好的S-D序列，从而 利于核糖体与mRNA的结合。 ③在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终止序列，保 证外源基因的有效转录和mRNA的稳定性。
质粒载体
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制——质粒DNA复
制启动控制
质粒载体
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制——质
粒DNA复制启动控制
质粒载体
1 质粒的生物学特征
质粒的可转移性
革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个
细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、 Col、R质粒等 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发 生接合作用如Col、R的其它成员
基因工程第三章基因工程的载体共59页文档
4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白 质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码 一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分 子进入细菌细胞。
苏州科技学院生物系
叶亚新
5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα）
β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性， 装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。 前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者 都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两 个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称 之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可 作为标记基因。
01.05.2020
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体必须具备的基本条件
1. 具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 2. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合
位点 3. 长度尽可能小，以提高其载装能力 4. 具有多种单一的酶切位点 5. 具有合适的选择性标记
7）荧光素酶基因
荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧 光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌
（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与FMN-氧化
还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
8）发光蛋白质基因
发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠 杆菌菌落呈蓝色。
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白 质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码 一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分 子进入细菌细胞。
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5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα）
β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性， 装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。 前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者 都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两 个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称 之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可 作为标记基因。
01.05.2020
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体必须具备的基本条件
1. 具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 2. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合
位点 3. 长度尽可能小，以提高其载装能力 4. 具有多种单一的酶切位点 5. 具有合适的选择性标记
7）荧光素酶基因
荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧 光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌
（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与FMN-氧化
还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
8）发光蛋白质基因
发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠 杆菌菌落呈蓝色。
第三章基因工程载体
2020/2/22
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大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
PO
lacZ
调控蛋白P
β-半乳糖苷酶 分解半乳糖
2M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i
PO
lacZ -
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段
β-半乳糖苷酶-
分解半乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
• 松弛型
▪高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达 10-60份拷贝，这类质粒被称为“松弛型” 复制控制的质粒(relaxed plasmid)。
2020/2/22
13
(二)分子量较小
低分子量的质粒如下优点
•通常拷贝数较高 •克隆时所预期的基因表达产物的数量较大 •限制酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制酶 切点，便于制作酶切图谱。 •外源DNA容量较大， •容易转化，当质粒大于15kb时，将成为转化效率的制 约因素。 •遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不易断裂。
2020/2/22
14
(三)带有可供选择的标记
• 常采用的标记是对某种抗生素的抗性，如氨卞青 霉素抗性(Ampr)、卡那霉素抗性(Kanr)、四环素 抗性(Tetr)等，而且希望各抗性基因内有若干单一 的限制酶切点。
• 在克隆时通过单一酶切点插入外源基因，使该抗 性基因失活、宿主菌变为对该抗生素敏感的菌株 ，这样较易检查到克隆是否成功。
lacZ’
lacZ’
缺陷型大肠杆菌
2020/2/22
29
pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原理
pUC18/19
Plac MCS lacZ’
5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷
第三章基因工程载体
如下图所示
三、λ噬菌体的生活周期
λ噬菌体DNA进入细菌细胞后,可有2种生活周期: 裂解周期(溶菌周期)和溶源性周期
何谓裂解周期(溶菌周期)?
在裂解周期中, λ噬菌体的DNA分子进入宿主细胞后, 便可借助宿主的复制和转录系统进行复制和外壳蛋白的 合成,同时二者组装成完整的噬菌体颗粒,20min后可使宿
四、λ噬菌体载体的构建
3.构建λ噬菌体载体的基本内容
野生型λDNA包装的上限为51kb,本身
缩 短 长 度
长度为48.5kb,只有当插入的外源DNA片段 不大于2.5kb时,才能被包装成有感染能力 的噬菌体颗粒.因此,缩短野生型λDNA的 长度,可以提高装载量.其实野生型λDNA
上约有40%-50%的片段是复制和裂解所非
③选择时的遗传标记，如抗生素
基因；
④易从宿主细胞中回收。
pUC19质粒
三、载体的分类 依据用途的不同 克隆载体：以繁殖DNA片段为目的的载体。 穿梭载体：既能在真核细胞又能在原核细胞
繁殖的载体。
表达载体：用来将克隆的外源基因在寄主细 胞内表达成蛋白质的载体。
三、载体的分类 依据受体细胞不同 原核生物载体 大肠杆菌载体 植物基因工程载体 真核生物载体 酵母载体 动物基因工程载体
必需的.
Байду номын сангаас、λ噬菌体载体的构建 3.构建λ噬菌体载体的基本内容
根据切除的多少,可将λDNA分成两大类载体: 缩 短 长 度 插入型载体:只有1个限制性核酸内切酶的酶
切位点可供外源DNA插入的λ噬菌体派生载体.
取代型载体:具有2个限制性核酸内切酶的酶 切位点,它们之间的DNA区段可被外源DNA区段 所取代的λ噬菌体派生载体.
四、对天然质粒载体的人工改造
三、λ噬菌体的生活周期
λ噬菌体DNA进入细菌细胞后,可有2种生活周期: 裂解周期(溶菌周期)和溶源性周期
何谓裂解周期(溶菌周期)?
在裂解周期中, λ噬菌体的DNA分子进入宿主细胞后, 便可借助宿主的复制和转录系统进行复制和外壳蛋白的 合成,同时二者组装成完整的噬菌体颗粒,20min后可使宿
四、λ噬菌体载体的构建
3.构建λ噬菌体载体的基本内容
野生型λDNA包装的上限为51kb,本身
缩 短 长 度
长度为48.5kb,只有当插入的外源DNA片段 不大于2.5kb时,才能被包装成有感染能力 的噬菌体颗粒.因此,缩短野生型λDNA的 长度,可以提高装载量.其实野生型λDNA
上约有40%-50%的片段是复制和裂解所非
③选择时的遗传标记，如抗生素
基因；
④易从宿主细胞中回收。
pUC19质粒
三、载体的分类 依据用途的不同 克隆载体：以繁殖DNA片段为目的的载体。 穿梭载体：既能在真核细胞又能在原核细胞
繁殖的载体。
表达载体：用来将克隆的外源基因在寄主细 胞内表达成蛋白质的载体。
三、载体的分类 依据受体细胞不同 原核生物载体 大肠杆菌载体 植物基因工程载体 真核生物载体 酵母载体 动物基因工程载体
必需的.
Байду номын сангаас、λ噬菌体载体的构建 3.构建λ噬菌体载体的基本内容
根据切除的多少,可将λDNA分成两大类载体: 缩 短 长 度 插入型载体:只有1个限制性核酸内切酶的酶
切位点可供外源DNA插入的λ噬菌体派生载体.
取代型载体:具有2个限制性核酸内切酶的酶 切位点,它们之间的DNA区段可被外源DNA区段 所取代的λ噬菌体派生载体.
四、对天然质粒载体的人工改造
基因工程第三章基因工程的载体
或称染色体复制型 3) 病毒复制型—复制起点来自病毒，若为RNA病毒，必须反
转录为cDNA。 4) 混合复制型
a. 同种生物复制起点混合—质粒形式存在；质粒或病毒形式 存在
2024/1/12
苏州科技学院生物系
叶亚新
例：大肠杆菌（E.coli）的噬粒（phagemid）载体既含有来自质
粒的复制起点，又含有来自噬菌体（如M13）的复制起点。 在不同条件下，它可以质粒或噬菌体的复制起点进行复制， 从而获得质粒ds- DNA或噬菌体ss –DNA
苏州科技学院生物系
叶亚新
第一节 E.coli 质粒载体
一、质粒（plasmid）的一般性质 2、特征
自主复制性
质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控 制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染 色体DNA而自主复制
2024/1/12
苏州科技学院生物系
叶亚新
第一节 E.coli 质粒载体
位点 3. 长度尽可能小，以提高其载装能力 4. 具有多种单一的酶切位点 5. 具有合适的选择性标记
2024
遗传标记基因
1. 标记基因的作用
1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主 细胞
这种指示可以是选择性的（Apr ，Tcr ，Kanr），也可以是非 选择性的（如lacZ）
2024/1/12
苏州科技学院生物系
叶亚新
第一节 E.coli 质粒载体
一、质粒（plasmid）的一般性质
2、特征
携带遗传标记
在实验室中将质粒通过物理方法导入受体细胞，但是 即使在最佳条件下，受体细胞中也只有少数细胞能稳 定地接受质粒，要想找到这些进入了质粒的受体细胞， 就要利用载体质粒上的遗传标记，天然质粒上碰巧携 带许多功能基因，它们便可被用作选择标记。
转录为cDNA。 4) 混合复制型
a. 同种生物复制起点混合—质粒形式存在；质粒或病毒形式 存在
2024/1/12
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叶亚新
例：大肠杆菌（E.coli）的噬粒（phagemid）载体既含有来自质
粒的复制起点，又含有来自噬菌体（如M13）的复制起点。 在不同条件下，它可以质粒或噬菌体的复制起点进行复制， 从而获得质粒ds- DNA或噬菌体ss –DNA
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第一节 E.coli 质粒载体
一、质粒（plasmid）的一般性质 2、特征
自主复制性
质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控 制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染 色体DNA而自主复制
2024/1/12
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叶亚新
第一节 E.coli 质粒载体
位点 3. 长度尽可能小，以提高其载装能力 4. 具有多种单一的酶切位点 5. 具有合适的选择性标记
2024
遗传标记基因
1. 标记基因的作用
1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主 细胞
这种指示可以是选择性的（Apr ，Tcr ，Kanr），也可以是非 选择性的（如lacZ）
2024/1/12
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叶亚新
第一节 E.coli 质粒载体
一、质粒（plasmid）的一般性质
2、特征
携带遗传标记
在实验室中将质粒通过物理方法导入受体细胞，但是 即使在最佳条件下，受体细胞中也只有少数细胞能稳 定地接受质粒，要想找到这些进入了质粒的受体细胞， 就要利用载体质粒上的遗传标记，天然质粒上碰巧携 带许多功能基因，它们便可被用作选择标记。
基因工程的载体
第三章基因工程的载体一、概述二、质粒载体三、表达载体一、概述•1 概念•载体：携带外源目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行复制和表达的工具称之为载体，化学本质是DNA分子。
•克隆载体：主要用来克隆和扩增DNA片段，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。
•表达载体：除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA元件，使外源基因在宿主细胞中有效表达。
一、概述•2 功能•运送外源基因高效转入受体细胞；•为外源基因提供复制能力和整合能力；•为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
一、概述•3 分类•按来源分：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、酵母人工染色体载体•按功能和用途分：克隆载体和表达载体•按性质分：融合型载体和非融合型载体•按受体细胞分：原核细胞载体和真核细胞载体一、概述•4 特性•载体能在宿主细胞内进行独立稳定的DNA自我复制；或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制；在载体中插入外源基因后，仍然保持稳定的复制状态和遗传特性；•载体容易从宿主细胞中分离纯化；•有限制性酶切的克隆位点，以便于目的基因的组装，即多克隆位点；一、概述•4 特性•能赋予细胞特殊的遗传标记，以便于对导入的重组体进行鉴定和检测；•载体在细胞内的拷贝数高，方便外源基因在细胞内大量扩增；•载体在细胞内稳定性高，保证重组体稳定传代而不易丢失；•用于表达目的基因的载体还应具有启动子、增强子二、质粒载体1、质粒的基本特性2、常用的质粒载体3、质粒DNA的提取4、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化二、质粒载体质粒载体是以质粒DNA分子为基础构建而成的基因载体，主要用于原核生物和真核生物的基因转移及建立基因组文库和cDNA文库。
1、质粒的基本特性（1）概念①染色体外的遗传因子，能进行自我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋白质）；②大多数为双链，闭环DNA分子，少数为线形；③大小为1 kb-200 kb，也有更大的。
双螺旋共价闭合环（超螺旋）开环双螺旋（一个裂口）线状双螺旋（两个裂口）构型：共价闭合环状、开环和线性（2）质粒的复制﹡ 复制起始区：通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区。
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（2）功能相近的基因在基因组中聚集在一起
目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需基因
（二）λ噬菌体载体的构建
1.选用λ噬菌体作为构建克隆载体材料的依据 • 是一种温和噬菌体。 • 能承载比较大的外源DNA片段 • λDNA分子上有多种限制酶的识别位点
2.构建λ噬菌体克隆载体的技术路线 • 用限制酶切去λDNA上的非必需区 • 在λDNA上非必需区内插入选择标记基因 • 建立λDNA分子体外包装系统
优选第三章基因工程载体
2. 基因工程对载体的要求
（1）在宿主细胞内能独立复制，ori。 （2）有选择性标记 Ampr、Tetr、Kanr等。 （3）多克隆位点：外源基因插入的单一限制酶位点。 （4）分子量小，可容纳较大的外源基因片段。 （5）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。 （6）具有对受体细胞的可转移性。 （7）具有较好的安全性，不能任意转移。
1. pBR322：
人工构建载体
p:质粒； BR：质粒两位主要 构建者姓氏的第一个 字母； 322：实验编号
pSF2124
pSC101
Байду номын сангаас
➢三个亲本质粒：
pMB1:出发质粒(ColE1)
pSF2124: Ampr
pMB1
pSC101: Tetr
3个会导致Ampr基因失活
9个导致Tetr基因失活
氨苄青霉素和四环素抗性 24个单一克隆位点。
第三节、人工染色体克隆载体
利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复 制的载体。
基本元件： 含有质粒克隆载体所必需的第一受体（大肠杆菌） 的质粒复制起始点； 第二受体（如酵母菌）染色体DNA着丝点、端 粒和复制起始点的序列.
➢合适的选择标记基因。
酵母人工染色体（YAC） 细菌人工染色体（BAC）
（一）酵母人工染色体（YAC）
二.λ噬菌体载体的主要类型
（1）插入式载体
只具有一个可供外源DNA插入的限制酶位点的λ噬菌体。 常用：λ gt10、λNM1149等载体.
（2）置换型载体（取代型载体）
具有成对的限制酶位点，在这两个位点之间的λDNA区段 可以被外源插入的DNA片段所取代。 常用：EMBL3、 EMBL4
、 三 λ-DNA作为载体的优点
➢ 载体的种类
基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
第一节 质粒载体
一、质粒（plasmid）
独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状 DNA分子（Covalently Closed Circular DNA, ccc DNA）。并不是细胞生长所必需的，但可以赋予细 胞某些抵御外界环境因素不利影响的能力，如抗生 素抗性、对重金属离子的抗性、分泌细菌毒素等。 分子量在1-500kb之间广泛存在于细菌。
（2）适用于组织化学法检测重组体
通过-互补作用，利用菌落颜色筛选重组子。而pBR322质粒的重组 子要进行两步的选择。
（3）具有多克隆位点区段（MCS）
适合不同粘性末端的DNA片段插入，不必连接接头
组织化学法检测重组体
X-Gal
-半乳糖苷酶 IPTG诱导物
半乳糖 ＋ 5-溴-4-氯-靛蓝
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
化
（3） LacZ′基因
编码β—半乳糖酶的α—肽链
（4）MCS区段
（MCS）区段位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点。 但它并不破坏该基因的功能 。
与pBR322相比， pUC质粒载体优点：
（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数
如pUC8为2 750bp，pUCl8为2 686bp，控制质粒复制rop 基因的缺失，平均每个细胞即可达500～700个拷贝
• 可在体外包装成噬菌体颗粒，高效转染大肠杆菌 λ-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒 的装载量重组。 λ-DNA分子的筛选较为方便。
•λ-DNA载体适合克隆和扩较麻烦，包装率又不稳定，购买包装蛋白 的费用又高； (2)没有质粒的用途广泛。
一、大肠杆菌的λ-噬菌体DNA
（一） λ-噬菌体的生物学特性 1、由外壳包装蛋白和λ-DNA组成 2、 λ-DNA的物理图谱
48.5kb
（1）线状双链DNA，两端各有一个12bp的互补单 链（粘性末端，cohesive-end site），称λcos site ， 粘性末端粘连接变成环状DNA。
λcos位点是噬菌体包装必需序列。
三、质粒载体的构建
1、 质粒构建基本策略 1.加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于选 择转化体 2.增加或减少合适的酶切位点，便于重组 3.缩短长度，提高导入效率，增加装载量 4.改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝
5.根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件
四、经典的大肠杆菌质粒载体
把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装 在质粒上，令质粒行使酵母chr的转录功能和复制功能。
含有的元件：酵母自主复制序列(ARS) 着丝粒序列(cen)
装载量为350400kb
质粒选择标记
酵母系统的选择标记
质粒复制起点
四膜虫端粒（tel）
酵母人工染色体（YAC）
释放出的蓝色物质可以 将整个菌落染成蓝色， 非常容易辨别，如果 LacZ’插入外源基因被破 坏，菌落则是白色的 。
第二节 噬菌体载体
Bacteriophage(phage) 是比细菌还小得多的微生物，
噬菌体侵犯细菌，可以认为它 是细菌里的“寄生虫”。
组成：蛋白质、核酸.
结构：蛋白质外壳、尾巴
尾巴上的微丝可以把噬菌 体的DNA注入细菌内。
① 分子小，克隆能力大
长度4363bp，易于纯化，可以携带6-8Kb的外源 DNA片段。
②高拷贝数
氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copies
③ 安全
失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通 过接合转移。
④具有较多的单一酶切位点（24种）
4、pUC质粒载体
1987年，J.Messing和 J.Vieria采用MCS技术在 pBR322基础上构建的 结构： （1）来自于pBR322的Ori （2）氨苄青霉素的抗性基因 (ampr)。 但核苷酸序列发生了变