烟草靶斑病菌毒素对烟草防御酶及丙二醛含量的影响

烟草靶斑病菌毒素对烟草防御酶及丙二醛含量的影响摘要：采用烟草靶斑病菌（rhizoctonia solani）粗毒素原液处理6叶期烟草幼苗，测定12、24、36、48、60、72 h后烟草叶片中过氧化物酶（pod）、多酚氧化酶（ppo）、超氧化物歧化酶（sod）、过氧化氢酶（cat）、苯丙氨酸解氨酶（pal）的活性和丙二醛（mda）含量。

结果表明，经烟草靶斑病菌粗毒素处理后的烟草pod、pal
的活性及mda含量都高于对照，并呈现一定的波动性；ppo和cat 先升高后下降，始终高于对照；而sod酶的活性表现为持续下降。

关键词：烟草靶斑病菌（rhizoctonia solani）；毒素；烟草；防御酶
中图分类号：s432.4.4 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）03-0575-03
真菌在侵染寄主植物过程中，毒素是其主要的致病因子之一，可在非常低的浓度范围内干扰植物正常生理功能，破坏细胞超微结构，从而严重影响植物的代谢过程和能量变化，引起一系列的不良反应，导致植物生理失调，最终导致细胞死亡。

立枯丝核菌毒素常引起水稻、小麦等农作物发病、萎蔫，甚至死亡[1，2]。

烟草靶斑病是中国烟草上的新病害[3]，国内外对其研究相对较少。

此次试验利用烟草靶斑病菌（rhizoctonia solani）产生的粗毒素（以下简称毒素）对烟草防御酶活性及丙二醛（mda）含量进行了研究，以探明该毒素的作用机理，为进一步研究烟草与立枯丝核菌互作及利用品种抗性育种提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于2010年在沈阳农业大学植物病毒研究室进行，供试烟草品种为nc89。

供试烟草靶斑病菌为强致病力菌株yc-9，由沈阳农业大学植物病毒研究室分离保存。

1.2 毒素制备
粗毒素提取参考vidhyasekaran等[4]方法进行。

将供试菌株于pda平板上培养3 d，取10块菌饼（直径5 mm）移至100 ml改良richard培养液中，于25 ℃恒温培养箱中培养15 d，每隔12 h人工振荡1 次。

培养液经过纱布和滤纸过滤、离心、活性碳吸附、甲醇洗脱等条件，获得病菌粗毒素。

1.3 毒素处理及酶活性测定
于烟苗6叶期取新鲜叶片，用无菌水洗净后针刺叶片造成伤口，然后处理组取20 μl浓缩后的粗毒素液接种于伤口上，对照组以空白培养液接种于伤口上，置于28 ℃光照培养箱中培养，分别于接种后12、24、36、48、60、72 h取样。

参考高俊凤[5]的方法测定过氧化物酶（pod）、多酚氧化酶（ppo）、超氧化物歧化酶（sod）、过氧化氢酶（cat）及苯丙氨酸解氨酶（pal）活性，mda含量采用硫代巴比妥酸反应比色法测定。

2 结果与分析
2.1 毒素对烟草叶片pod活性的影响
由图1可以看出，毒素处理烟草叶片后12～24 h pod活性呈下
降趋势，但明显高于对照；24～36 h pod活性呈升高趋势；处理36～48 h时再次呈下降趋势；处理60 h时pod活性再次升高并达到最大值，直至处理72 h时仍保持较高的活性。

2.2 毒素对烟草叶片ppo活性的影响
由图2可以看出，毒素处理烟草叶片后其ppo活性随处理时间的延长先上升后下降，对照则相对平稳。

处理12～24 h ppo活性比对照低，呈现缓慢升高的趋势，24 h后ppo活性开始急剧升高，明显高于对照，48 h时达到高峰，此后ppo活性开始下降，至72 h 依然高于对照。

2.3 毒素对烟草叶片sod活性的影响
由图3可以看出，毒素处理烟草叶片后其sod活性持续下降，明显低于对照。

处理12～24 h时其sod活性无明显变化，但低于对照，而36 h开始急剧下降，72 h时其sod活性降至最低，并呈现持续下降的趋势。

2.4 毒素对烟草叶片cat活性的影响
由图4可以看出，毒素处理烟草叶片后其cat活性随处理时间的延长呈现先升高后下降的趋势。

12～24 h其cat活性急剧上升，24 h时酶活达到高峰，明显高于对照，此后cat活性骤然下降，72 h时低于对照；而对照在此期间呈现小幅度的波动状态，在12～24 h烟草叶片sod活性呈现缓慢下降趋势，24～36 h缓慢升高，36～48 h开始下降，在48～72 h呈上升趋势。

2.5 毒素对烟草叶片pal活性的影响
由图5可以看出，毒素处理烟草叶片后的pal活性变化较大，在12～72 h出现2个酶活高峰，分别在处理24 h和72 h时，并且毒素处理的pal活性始终高于对照；而对照pal活性的变化也呈现波动状态，但变化幅度较小。

2.6 毒素对烟草叶片mda含量的影响
由图6可以看出，毒素处理后烟草叶片mda的含量出现了2个高峰。

在毒素处理12 h时其mda含量比对照低，此后迅速上升，于24 h时达到高峰，而24～48 h呈现下降趋势，48～60 h时又缓慢上升；而对照的mda含量表现出波动，但变化幅度相对较小。

3 小结与讨论
毒素可导致烟草叶片组织内防御系统酶活性发生变化，pod、ppo 和cat是具有清除活性氧作用的防御酶，寄主体内防御酶系统变化是致病毒素作用于寄主后的明显反应之一[6]。

本试验研究表明，经烟草靶斑病菌粗毒素处理后，烟草叶片pod活性高于对照水平，并呈现一定的波动性，而ppo和cat表现为先升高后降低，但大部分时间高于对照水平。

这表明烟草靶斑病菌毒素可能诱导了烟草细胞活性氧暴发，pod、ppo和cat活性升高以清除活性氧，但随着毒素处理时间延长产生大量活性氧导致ppo和cat活性开始下降，并因活性氧大量积累使细胞受到损伤。

史俊卿等[7]用立枯丝核菌毒素处理人参幼苗，发现其ppo和cat活性都呈先上升后下降趋势，此次试验的结果与其基本一致。

sod能够直接清除超氧阴离子自由基，往往在其他防御酶活性降
低时发挥直接补偿作用，减轻活性氧对寄主的伤害，但如果活性氧大量产生，超出了体内的清除能力，则会引发和加剧膜脂过氧化作用，破坏膜的结构和功能，甚至导致植物细胞死亡。

而此次试验sod 酶的活性表现为持续下降，可能是由于毒素致使细胞产生大量超氧阴离子，sod与超氧阴离子发生作用，而使其活性降低。

史俊卿等[7]研究sod活性都表现为先升高后下降，此次试验结果与其并不完全一致。

pal是能合成各种酚类化合物及木质素的关键酶，调控着酚类物质和木质素在植物体中的合成和积累，因而在植物抗病反应中起着重要作用[6]。

病原菌毒素能诱导pal活性升高。

刘琼光[8]用水稻基腐病菌毒素处理水稻，台莲梅等[9]用尖孢镰刀菌毒素处理大豆幼根，范兰兰等[10]用莲子草假隔链格孢毒素处理莲子草根，都证明了毒素对寄主体内pal活性的诱导作用。

此次试验研究表明经烟草靶斑病菌粗毒素处理后的烟草叶片pal活性高于对照水平，出现2个高峰。

在用毒素接种烟草的前期试验中，接种叶片组织变褐色，形成褐色坏死病斑，可能与pal活性升高，细胞内酚类物质大量积累、组织遭到破坏有关。

植物组织遭受伤害，往往会发生膜脂过氧化作用，mda是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度[11]。

本研究中烟草叶片mda含量在处理24 h时达到了高峰，尽管出现波动，基本都高于对照水平。

这与史俊卿等[7]研究结果基本一致。

随着mda含量不断升高，植物组织膜脂过氧化的程度逐渐
加剧，最终导致细胞死亡。

参考文献：
[1] 陈夕军，徐艳，童蕴慧，等.水稻纹枯病菌毒素致病机理研究[j].植物病理学报，2009，39（4）：439-443.
[2] blair i d. study on the growth in soil and the parasitication of certain rhizoctonia solani isolates from wheat[j]. canadian journal of research，1942，20（3）：174-185.
[3] 吴元华，王左斌，刘志恒，等.我国烟草新病害—靶斑病[j]. 中国烟草学报，2006，12（6）：22.
[4] vidhyasekaran p， ponmalar t r， samiyappan r， et al. host-specific toxin production by rhizoctonia solani the rice sheath blight pathogen[j].phytopathology，1997，87（12）：1258-1263.
[5] 高俊凤.植物生理学实验指导[m].北京：高等教育出版社，2006.
[6] 陈利锋，徐敬友.农业植物病理学[m].北京：中国农业出版社，2001.
[7] 史俊卿，张浩，于红威，等.立枯丝核菌毒素对人参防御酶活性及丙二醛含量的影响[j].湖南农业大学学报（自然科学版），2010，36（4）：434-436.
[8] 刘琼光.水稻基腐病菌侵染激发水稻活性氧代谢及其致病
毒素研究[d].广州：华南农业大学，2007.
[9] 台莲梅，许艳丽，闫凤云.尖孢镰刀菌毒素对大豆防御酶系活性的影响[j].中国油料作物学报，2008，30（2）：249-251.
[10] 范兰兰，姜子德，向梅梅.莲子草假隔链格孢毒素对空心莲子草根尖组织防御酶活性的影响[j].华南农业大学学报，2010，31（3）：28-31.
[11] 陈少裕.膜脂过氧化对植物细胞的伤害[j].植物生理学通讯，1991，27（2）：84-90.。