ISO4832大肠菌群和粪大肠菌群测定
粪大肠菌群的测定
15.7mg硫代硫酸钠可去除样品中1.5mg活性氯，硫代硫酸钠用量可 根据样品实际活性氯量调整。
4 .无菌水:取适量实验用水，经 高压蒸汽灭菌20min， 备用。 5. 硫代硫酸钠( Na2S2O3.5H2O)。 (去除游离氯) 6.乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2O8Na2 .2H2O)。 7.乙二胺四乙酸二钠溶液: ρ (C10H14N2O8Na2 .2H2O) =0.15 g/ml 称取15g乙二胺四乙酸二钠,溶于适量水中，定容至100ml,此溶液可保存 30d。 8.硫代硫酸钠溶液: ρ ( Na2S2O3.5H2O) =0.10 g/ml 称取15.7g硫代硫酸钠， 溶于适量水中，定容至100ml，临用现配。
2. 浓缩乳糖蛋白胨培养液： (此溶液用于检验大肠菌群) 按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸馏水外，各组分用量 增加至三倍。 (即按上述配方比例三倍 (除蒸馏水外) ，配成三倍浓 缩的乳糖蛋白胨培养液)
①在何种情况下用多少三倍浓度的培养基接种？ 答：接种体积为10ml时，试管内应装入有3倍浓度乳糖蛋 白胨培养液5ml。
• 三、肯定要加塞子的，我们用的塞子是软材料 (好像是软橡胶？ 白色的，塞子中间另有一 个可以活动的塞子，能保证加塞后的试管透气，其实用什么材料不重要的。
• 四、需要的仪器设备为：生化培养箱、无菌操作台 (空气精华级别100) 、高压灭菌锅、 冰箱、干燥箱。
五、干扰和消除
1.
,能破坏微生物细胞内的酶活性，导
若接种量过高，培养液应加倍成分。这是由于样品的量大 的情况下，培养液稀释大,各种成分的相对浓度就会不足， 就不能满足细菌的生长要求，存在实验失败的概率。因此， 合理调整样品量和营养液浓度的比例需要反复实验和多组 对照。
粪大肠菌群检测标准
粪大肠菌群的检测标准根据不同的国家和地区以及不同的应用场景可能会有所不同。
一般来说，粪大肠菌群的检测标准通常是以每克或每毫升样品中的大肠菌群数量来表示的，常用的单位有CFU/g或CFU/mL。
在某些国家或地区，对于饮用水、食品等相关行业的检测标准可能会更加严格。
例如，某些国家可能规定饮用水中不得检出大肠菌群，而在某些食品中则可能规定每克样品中大肠菌群的数量不得超过一定数值。
需要注意的是，粪大肠菌群并非单一菌种，而是一组菌群的统称。
因此，在检测过程中需要针对这一组菌群进行检测，而非单一菌种。
同时，为了确保检测结果的准确性，检测过程需要严格遵守相关操作规范，避免交叉污染等因素的影响。
粪大肠菌群的测定
粪大肠菌群的测定1 卫生学意义粪大肠菌群测定的卫生学意义：一、与大肠菌群相比，粪大肠菌群在人和动物粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。
因此，粪大肠菌群的存在表明食品近期内可能直接或间接的受到了粪便的污染；二、作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性；三、常用做贝类和贝类养殖用水的卫生指标。
2 检验方法2.1 术语与定义一群在44.5 °C培养24h-48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
卫生学概念，又称为耐热大肠菌群，主要是大肠杆菌，但也包括克雷伯氏菌属等。
2.2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：(1)恒温培养箱：36C±1C。
(2)冰箱：2C〜5C。
( 3)恒温水浴箱：46C±1C。
( 4)天平：感量0.1g 。
(5)无菌吸管：1mL(具0.01m该U度)、10mL(具0.1m该U度)或微量移液器及吸头。
( 6)无菌锥形瓶：容量500mL。
( 7)无菌培养皿：直径90mm。
(8) pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2.3 培养基和试剂(1)月桂基硫酸盐胰蛋白胨(Lauryl Sulfate Tryptose , LST)肉汤：1) 成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0g ;氯化钠：5.0g ;乳糖：5.0g ;磷酸氢二钾(KHPO): 2.75g ;磷酸二氢钾(KHPQ): 2.75g ;月桂基硫酸钠：0.1g ; 蒸馏水：1000mL; pH：6.8±0.22) 制法：将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH。
分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。
121 C高压灭菌15 min。
(2)EC肉汤(E.coli , BGLB :1)成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0 g; 3号胆盐或混合胆盐：1.5 g；乳糖:5.0g ;磷酸氢二钾(K2HPQ) : 4.0g ;磷酸二氢钾(KHPQ) : 1.5g ;氯化钠：5.0g ; 蒸馏水：1000mL pH:6.9 ± 0.1。
粪大肠菌群的测定步骤
粪大肠菌群的测定1、半个月前配好初、复发酵所需培养液2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口3、操作（1） 培养液初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨 10 g牛肉浸膏 3 g乳糖 5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml调节PH 为7.2—7.4（NaOH ）6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。
共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。
双月10个地表水，2个创业。
共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。
创业的水一个月采两次水样复发酵 EC 培养液胰胨 20 g乳糖 5 g胆盐三号 1.5 g磷酸氢二钾 4 g磷酸二氢钾 1.5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml（2）做样初发酵：地表水15根管为一个水样。
5根为一组。
第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。
（10、1、0.1的取样量）创业，每个水样15根单倍。
同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、0.001ml。
将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。
观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。
复发酵：呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。
粪大肠、总大肠、细菌总数的测定
一、微生物分析的总体要求（一）、采样瓶及玻璃器皿的清洗1、新购置的玻璃器皿，因含游离碱，2%的盐酸浸泡数小时，自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净，沥干。
2、培养细菌后的玻璃器皿，应先经高压蒸汽灭菌，趁热倒出培养基，用洗涤剂刷洗干净，自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净，沥干。
3、洗涤吸管时可高压蒸汽灭菌30min，用洗涤剂刷洗干净，自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净，沥干。
用牛皮纸包好，可干热灭菌（于烘箱中160℃烘150min）和高压蒸汽灭菌（121℃灭菌20min）。
备用。
所有的吸管上端要用少量普通棉花填塞，注意松紧度，取液时使其准确快速的流出）4、洗涤采样瓶时，用刷子刷洗干净，自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净，再烘箱烘干，用牛皮纸包好（鸡肠带捆好），可干热灭菌（于烘箱中160℃烘150min）和高压蒸汽灭菌（121℃灭菌20min）5、培养皿：洗净后，用烘箱烘干，用牛皮纸包好进行灭菌，待冷后放入冰箱中备用。
（二）、培养基的制备1、单倍乳糖蛋白胨培养液-液体培养基用量筒量取1000mlUP水，加23g营养物质，沿烧饼边沿搅拌，使其完全溶解。
用移液管移取9ml培养液分装于试管中，用针管将小导管从底部注满营养液，斜扣入试管中，用胶塞塞紧，用牛皮纸每十个进行包扎。
2、三倍乳糖蛋白胨培养液：营养物质加入69g，用移液管移取5ml培养液分装于试管中，用针管将小导管从底部注满营养液，斜扣入试管中，用胶塞塞紧，用牛皮纸每十个进行包扎。
3、EC培养液（配制过程同乳糖蛋白胨培养液）(称取37g)-液体培养基4、无菌水，吸取9ml新鲜UP水于试管中，其余包扎过程同乳糖蛋白胨培养液。
5、上述培养基及无菌水准备好后高压蒸汽灭菌（121℃灭菌20min）。
灭菌后等室温再放入冰箱。
6、伊红美蓝培养基（EMB培养基）(固体培养基-平板)①称取42g营养物质，加入到1000mlUP水中，加热溶解，用三角瓶分装，盖上绵塞，至于高压蒸汽灭菌锅内，121℃灭菌20min。
食品卫生微生物学检验 大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌计数
大肠菌群计数：第一法 6 操作步骤
6.2 初发酵实验 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品匀液，液体 样品可以包括未经稀释的原液，每个稀释度接种三管月桂基硫酸 盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量需要超过1mL， 则用双料LST肉汤）。36℃±1℃培养24h±2h，检查倒管内是否有气 泡产生或轻摇试管时是否有密集连续的细小气泡从管底逸出，如 未产气则继续培养至48h±2h。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管 数。未产气者为大肠菌群阴性；对产气者，则进行复发酵试验。
食品卫生微生物学检验 大肠杆菌计数
Microbiological examination of food hygiene -Enumeration of Escherichia coli
大肠菌群计数
大肠菌群
定义：一群在36℃条件下培养24~48小时能发酵乳糖、产酸 产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 卫生学概念，包括埃希氏菌属，克雷伯氏菌属、肠杆菌属 和柠檬酸杆菌属等的细菌 检验比较简单，所以被广泛用做水源的卫生指标和食品加 工卫生状况的通用指标
Microbiological examination of food hygiene -Enumeration of Coliforms
食品卫生微生物学检验 粪大肠菌群计数
Microbiological examination of food hygiene -Enumeration of faecal coliforms
℃± 1 ℃ 36 36℃
验
24h~ 48h
报告结果
大肠菌群计数
大肠菌群计数
大肠菌群计数
第一法
MPN法
第二法 平板计数法 第三法 Petrifilm测试片法
粪大肠菌群检测标准
粪大肠菌群检测标准
粪大肠菌群检测是评价消化道微生物菌群组成和功能的重要指标，常用于评估肠道健康和消化功能。
以下是一般粪大肠菌群检测的参考标准：
1. 总菌群量：正常情况下，粪便样本中的大肠菌群数量应该在10^7~10^9 CFU/g之间。
2. 菌群多样性指数：通常使用菌群多样性指数（如Shannon指数）评估菌群的多样性程度。
正常情况下，指数应该在较高水平。
3. 优势菌群和病原菌：粪大肠菌群检测还可以确定主要的优势菌群种类和比例，以及是否存在潜在的病原菌。
正常情况下，优势菌群应该是益生菌（如双歧杆菌、乳酸菌等），而病原菌应该是少量或不存在。
4. 菌群平衡和稳定性：正常的粪大肠菌群应该具有良好的平衡和稳定性。
如果菌群失调或不稳定，可能会导致肠道问题和消化不良等症状。
需要注意的是，粪大肠菌群检测的标准可能因不同的实验室和研究领域而有所差异。
因此，具体的标准应根据实验室或临床医生的建议进行参考。
实验二 大肠菌群和粪大肠菌的检验
实验二大肠菌群和粪大肠菌的检验一、实验目的要求1、了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义。
2、学习并掌握大肠菌群检验的原理和方法。
二、原理大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
一般认为该菌群细菌可包括：大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。
它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。
食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number-简称MPN）表示。
三、试剂和仪器（一）最先准备的器材规格名称数量用途1、500ml广口瓶 1个稀释样品2、500ml三角瓶 2个制生理盐水3、250ml三角瓶 1个制EMB琼脂4、18×180mm试管 8支稀释及制双料乳糖胆盐发酵管5、18×150mm试管20～25支单料乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管6、13×130mm试管20支制蛋白胨水、EC肉汤7、1ml移液管 5 支8、10ml移液管 3 支9、直径为90mm平皿12套制EMB平板10、250ml量筒1支（二）应灭菌消毒的器材剪刀1把开瓶器不锈钢药匙1把滴管胶头4只称量纸适量（三）应制备的培养基培养基总量所用容器1、0.85%NaCl生理盐水（蒸馏水）300ml 500ml三角瓶2、乳糖胆盐发酵管双料：10ml/支 5支 60ml 18×180mm试管(装有导管)单料：10ml/ 8支 90ml 18×150mm试管(装有导管)3、EMB琼脂： 1瓶 120ml 250ml三角瓶4、乳糖发酵管： 3ml/支 5支20ml 13×130mm试管(装有导管)5、EC肉汤： 3ml/支 6支20ml 13×130mm试管(装有导管)6、蛋白胨水： 2ml/支 10支20ml 13×130mm试管四、实验内容（第一天）样品处理及初发酵接种：所需培养基与器材：◆培养基：1.0.85%NaCl生理盐水：300ml 1瓶2.乳糖胆盐发酵管双料：10ml/支3～5支18×180mm试管(有导管)单料：10ml/支6～8支18×150mm试管(有导管)◆灭菌器材：500ml广口瓶（内带5mm带玻璃珠）1～2个18×180mm试管3支250ml量筒1支1ml移液管 5 支10ml移液管3支当样品袋装样品时：消毒酒精、棉花、无菌剪刀、称量纸、不锈钢药匙、橡皮胶头3只；当样品瓶装样品时：石炭酸消毒纱布两块、开瓶器。
ISO4833-2003菌落总数的检测方法
ISO与美国FDA的不同处食品微生物检验方法（FDA与ISO对比）内容提要：l 菌落总数检测l 大肠菌群及大肠杆菌检测l 金黄色葡萄球菌检测l 沙门氏菌检测l 单核细胞增生李斯特氏菌检测菌落总数测定——菌落总数的概念l 菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数。
菌落总数测定——卫生学意义l 判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。
l 及时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食品卫生学评价提供依据。
l 通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越大，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
FDA BAM 菌落总数测定流程检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）适当十倍稀释样品选择2~3个连续适宜稀释度各取1mL分别加入灭菌平皿内（每个稀释度做两个平行）每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA）35 ℃ 48 ± 2h菌落计数FDA BAM 菌落计数方法l 选择25~250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下：N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*dl 所有平板的菌落数都不足25CFU，报告EAPC/ml（g）为＜25*1/d。
EAPC：estimated aerobic plate countl 所有平板的菌落数都超过250CFU，但不足100/cm2 ，报告EAPC/ml（g）为最接近250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度。
l 所有平板的菌落数都超过100/cm2 ，计算平板的面积（直径为90mm的平板面积为65cm2），估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml（g）为＞65*100* 1/d。
l 无法计数的平板报告LA（Laboratory Accident）。
l 最终结果保留前两位有效数字。
按照4舍6入，5是奇进偶不进。
实验四 大肠菌群和粪大肠菌的检验
实验四大肠菌群和粪大肠菌的检验一、实验目的要求1、了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义。
2、学习并掌握大肠菌群检验的原理和方法。
二、原理大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
一般认为该菌群细菌可包括：大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。
它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。
食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number-简称MPN）表示。
三、试剂和仪器（一）最先准备的器材规格名称数量用途1、500ml广口瓶 1个稀释样品2、500ml三角瓶 2个制生理盐水3、250ml三角瓶 1个制EMB琼脂4、18×180mm试管 8支稀释及制双料乳糖胆盐发酵管5、18×150mm试管20～25支单料乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管6、13×130mm试管20支制蛋白胨水、EC肉汤7、1ml移液管 5 支8、10ml移液管 3 支9、直径为90mm平皿12套制EMB平板10、250ml量筒1支（二）应灭菌消毒的器材剪刀1把开瓶器不锈钢药匙1把滴管胶头4只称量纸适量（三）应制备的培养基培养基总量所用容器1、0.85%NaCl生理盐水300ml 500ml三角瓶2、乳糖胆盐发酵管双料：10ml/支 5支 60ml 18×180mm试管(装有导管)单料：10ml/ 8支 90ml 18×150mm试管(装有导管)3、EMB琼脂： 1瓶 120ml 250ml三角瓶4、乳糖发酵管： 3ml/支 5支20ml 13×130mm试管(装有导管)5、EC肉汤： 3ml/支 6支20ml 13×130mm试管(装有导管)6、蛋白胨水： 2ml/支 10支20ml 13×130mm试管四、实验内容（第一天）样品处理及初发酵接种：所需培养基与器材：◆培养基：1.0.85%NaCl生理盐水：300ml 1瓶2.乳糖胆盐发酵管双料：10ml/支3～5支18×180mm试管(有导管)单料：10ml/支6～8支18×150mm试管(有导管)◆灭菌器材：500ml广口瓶（内带5mm带玻璃珠）1～2个18×180mm试管3支250ml量筒1支1ml移液管 5 支10ml移液管3支当样品袋装样品时：消毒酒精、棉花、无菌剪刀、称量纸、不锈钢药匙、橡皮胶头3只；当样品瓶装样品时：石炭酸消毒纱布两块、开瓶器。
粪大肠菌群检测方法
粪大肠菌群检测方法
粪大肠菌群检测是一种常用的微生物检测方法，用于评估肠道内大肠埃希杆菌等菌群的数量和组成。
以下介绍几种常见的粪大肠菌群检测方法：
1. 传统培养法：该方法通过将粪便样本接种在含有特定培养基的培养皿中，利用培养皿中的营养物质、温度等条件，使大肠菌群等菌种在培养基上生长。
然后通过观察培养皿中的菌落形态、颜色等特征，或进行进一步的生化试验，来鉴定和计数菌群。
这种方法操作简便，但需要较长时间（通常需要2-3天）。
2. PCR法：PCR（聚合酶链反应）是一种快速、高效的核酸扩增技术，可用于检测微生物的DNA或RNA。
在粪大肠菌群检测中，可以选择一种或多种特异引物，通过PCR扩增粪便样
本中的大肠菌群DNA片段。
扩增后的产物可以进行电泳分析，根据特定的条带模式来鉴定和计数菌群。
相比传统培养法，PCR法的优势在于快速、高灵敏度和特异性。
3. 16S rRNA测序法：16S rRNA是细菌基因组中高保守的区域，其序列具有物种特异性。
基于16S rRNA序列的差异，可以通
过测序技术快速准确地鉴定粪大肠菌群的组成。
该方法可通过提取粪便样本中的总DNA，进行PCR扩增和纯化后，进行高
通量测序。
测序结果可以使用相应的数据库比对，识别和计数样本中的各种大肠菌群。
总结来说，传统培养法、PCR法和16S rRNA测序法是常见的
粪大肠菌群检测方法。
其中，PCR法和16S rRNA测序法更加
快速、准确，逐渐成为主流的检测方法。
这些方法的应用有助于揭示肠道微生物群落的组成和功能，为相关疾病的诊断和治疗提供依据。
水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定 多管发酵法
水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定多管发酵法1. 原理总大肠菌群和粪大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。
多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。
试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN表示。
2. 仪器(1)高压蒸气灭菌器。
(2)恒温培养箱、冰箱。
(3)生物显微镜、载玻片。
(4)酒精灯、3mm接种环。
(5)培养皿（直径100mm）、试管（5×150mm），吸管（1、5、10mL）、烧杯（200、500、2000mL）、锥形瓶（500、1000mL）、采样瓶、移液枪。
3. 培养基及染色剂的制备3.1 乳糖蛋白胨培养液：将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节溶液pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，贮存于冷暗处备用。
3.2 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。
除蒸馏水外，各组份用量增加至三倍。
3.3伊红美蓝培养基：①贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解。
再加2.0g邻酸二氢钾及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至1000mL，调节溶液pH值为7.2～7.4。
趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀后定量分装于250mL或500mL锥形瓶内，于121℃高压灭菌15min，贮于冷暗处备用。
②平皿培养基的制备：将上述制备的贮备培养基融化。
根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液（0.4g伊红溶于20mL水中）和一定量已灭菌的0.5%美蓝水溶液（0.065g美蓝溶于13mL 水中），加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用。
ISO4833-2003菌落总数的检测方法
ISO与美国FDA的不同处食品微生物检验方法（FDA与ISO对比）内容提要：l 菌落总数检测l 大肠菌群及大肠杆菌检测l 金黄色葡萄球菌检测l 沙门氏菌检测l 单核细胞增生李斯特氏菌检测菌落总数测定——菌落总数的概念l 菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数。
菌落总数测定——卫生学意义l 判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。
l 及时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食品卫生学评价提供依据。
l 通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越大，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
FDA BAM 菌落总数测定流程检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）适当十倍稀释样品选择2~3个连续适宜稀释度各取1mL分别加入灭菌平皿内（每个稀释度做两个平行）每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA）35 ℃ 48 ± 2h菌落计数FDA BAM 菌落计数方法l 选择25~250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下：N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*dl 所有平板的菌落数都不足25CFU，报告EAPC/ml（g）为＜25*1/d。
EAPC：estimated aerobic plate countl 所有平板的菌落数都超过250CFU，但不足100/cm2 ，报告EAPC/ml（g）为最接近250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度。
l 所有平板的菌落数都超过100/cm2 ，计算平板的面积（直径为90mm的平板面积为65cm2），估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml（g）为＞65*100* 1/d。
l 无法计数的平板报告LA（Laboratory Accident）。
l 最终结果保留前两位有效数字。
按照4舍6入，5是奇进偶不进。
大肠菌群检测方法中文翻译
大肠菌群检测方法中文翻译3 定义和简介3.1 定义所有的大肠菌群均是发酵乳糖，革兰氏阴性，无牙孢的杆菌。
官方的对大肠菌群的定义可能以培养温度（30、32、35、37）不同作评价；或以确定是否发酵乳糖产气作为定义的一个特征.大多数ISO和其它官方标准是利用发酵乳糖产气作为一个定义特征。
而在ISO 4832 中则利用了在VRBL上的菌落大小作为其唯一的定义特征。
鉴于这些定义的不同，建议实验室根据相关定义用相应的适当方法。
●国际标准：样品分析是否符合国际交易规范●官方主市场调整定义：样品分析是否符合地方标准●一般定义：样品分析是否符合一般规范。
任何必要方法的调改必须经过市场实验室质量确认中心和雀巢研究中心食品安全微生物组的协助。
以下为一些官方定义例子：*ISO 4831大肠菌群是经过其在选择性肉汤上的生长和发酵乳糖产气能力来定义*AOAC INTERNATIONAL, APHA/FDA定义大肠菌是指发酵乳糖产酸产气（T=32或35度）革兰氏阴性杆菌*ISO 4832大肠菌群定义是根据其在VRBL-agar(30or35or37度)的菌落大小（最小5mm直径）和产酸情况。
(T=30或35或37℃)3．1．1 液体培养基中ISO 4831 大肠菌群是根据其在选择性肉汤中生长能力和发酵乳糖产气情况来定义.(T=30或35或37℃)AOAC INTERMATIONAL,APHA/FA中大肠菌群是指发酵乳糖产酸产气革兰氏阴性杆菌。
（T=32或35℃）由LI第一章概述，大肠菌群是指发酵乳糖气微生物群。
3．1．2 固体培养基中IOS 4832大肠菌群定义是根据其在VRBL-agar(30or35or37度)的菌落大小（最小5mm直径）和产酸情况。
(T=30或35或37℃) AOAC INTERMATIONAL,APHA/FA中大肠菌群是指发酵乳糖产酸产气革兰氏阴性杆菌。
基于以上定义可知大肠菌群在VRBL培养基上会形成5mm以上直径的红色菌落且在确认试验中发酵乳糖产气由LI第二章概述，大肠菌群是指在VRBL琼脂培养基上会形成特征性菌落且在确认试验中发酵乳糖产气微生物群。
【干货分享】大肠菌群、粪大肠、大肠埃希氏菌检验的相关知识
【干货分享】大肠菌群、粪大肠、大肠埃希氏菌检验的相关知识食品微生物检测1、大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌检验方法（1）大肠菌群（colifoms）一群在36°C培养48h可发酵乳糖产酸产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
该菌主要来源自人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。
（2）粪大肠菌群（Fecal colifoms）也称耐热大肠菌群。
指大肠菌群中能在44.5C生长、发酵乳糖产生气体的一群细菌。
与大肠菌群一样，并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某-一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的-组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。
食品卫生学意义：作为粪便污染食品的指标菌，MPN值愈低则说明食品受粪便污染程度及对人体健康危害程度愈低作为肠道致病菌污染食品的指针，大肠菌群数量越多则肠道致病菌存在的可能性就越高，但两者之间并不总是呈平行关系。
（3）大肠埃希氏菌（Escherichia coli）分类学概念：肠杆菌科、埃希氏菌属。
是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。
一般生活在人大肠中并不致病，但它侵入人体一些部位时，可引起感染。
主要有：■O抗原(菌体抗原，150个)■K抗原(荚膜抗原，90个)■H抗原( 鞭毛抗原，50个)（4）致泻性大肠埃希氏菌能侵入肠粘膜上皮细胞,引起食物中毒的大肠埃希氏菌。
产毒性大肠埃希氏菌(ETEC)-肠胃炎、旅行性腹泻。
■致病性大肠埃希氏菌(EPEC)-婴儿腹泻；■肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)--出血性结肠炎；(O157∶H7；O104∶ H4；O111；O126等)■侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC)—杆菌性痢疾；■粘附性大肠埃希氏菌(EAEC)—急慢性腹泻。
2、大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌的关系3、相关检验方法标准■GB4789.3-2016食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数■GB 4789.38-2012食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数■GB 4789.39- -2013食品安全国家标准食品微生物学检验粪大肠菌群计数■GB4789.6- 2016 食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验■GB4789.36-2016食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验。
大肠菌群和粪大肠菌的检验
实验四大肠菌群和粪大肠菌的检验一、实验目的要求1、了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义。
2、学习并掌握大肠菌群检验的原理和方法。
二、原理大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
一般认为该菌群细菌可包括：大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。
它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。
食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number-简称MPN）表示。
三、试剂和仪器（一）最先准备的器材规格名称数量用途1、500ml广口瓶1个稀释样品2、500ml三角瓶2个制生理盐水3、250ml三角瓶1个制EMB琼脂4、18×180mm试管8支稀释及制双料乳糖胆盐发酵管5、18×150mm试管20～25支单料乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管6、13×130mm试管20支制蛋白胨水、EC肉汤7、1ml移液管 5 支8、10ml移液管 3 支9、直径为90mm平皿12套制EMB平板10、250ml量筒1支（二）应灭菌消毒的器材剪刀1把开瓶器不锈钢药匙1把滴管胶头4只称量纸适量（三）应制备的培养基培养基总量所用容器1、0.85%NaCl生理盐水300ml 500ml三角瓶2、乳糖胆盐发酵管双料：10ml/支5支60ml 18×180mm试管(装有导管)单料：10ml/ 8支90ml 18×150mm试管(装有导管)3、EMB琼脂：1瓶120ml 250ml三角瓶4、乳糖发酵管：3ml/支5支20ml 13×130mm试管(装有导管)5、EC肉汤：3ml/支6支20ml 13×130mm试管(装有导管)6、蛋白胨水：2ml/支10支20ml 13×130mm试管四、实验内容（第一天）样品处理及初发酵接种：所需培养基与器材：? 培养基：1. 0.85%NaCl生理盐水：300ml 1瓶2. 乳糖胆盐发酵管双料：10ml/支3～5支18×180mm试管(有导管)单料：10ml/支6～8支18×150mm试管(有导管)? 灭菌器材：500ml广口瓶（内带5mm带玻璃珠）1～2个18×180mm试管3支250ml量筒1支1ml移液管 5 支10ml移液管3支当样品袋装样品时：消毒酒精、棉花、无菌剪刀、称量纸、不锈钢药匙、橡皮胶头3只；当样品瓶装样品时：石炭酸消毒纱布两块、开瓶器。
ISO4832大肠菌群和粪大肠菌群测定
BS ISO 4832:2006食品和动物饲料的微生物学大肠菌群计数水平法--菌落计数技术序ISO是国际标准的全球性组织。
准备国际标准这项工作通常由ISO技术联盟来完成。
每一个团体成员负责各自的学科。
与ISO有合作的国际性机构、政府与非政府机构，也有参与这项工作。
ISO与国际电子组织（IEC）在电子标准化方面有着密切的合作关系。
国际性标准的起草原则在《ISO/IEC 细则》第三部分中有给出。
起草的国际性标准被技术委员会采用是通过全体成员投票决定的。
发布一个国际性标准需要至少75％成员投赞成票。
国际性标准ISO 4831 由ISO/IEC 34技术委员会（农产品，小组委员会SC9，微生物）起草的。
这个第三版的ISO 4832取代了ISO 4832:1991和ISO 5541-1:1986。
主要的修改内容如下：——在35℃下培养这个可选择的程序已被删除（见4.2）；——引入使用亮绿乳糖胆汁培养基做确证实验（见5.4和9.4）。
考虑到本标准的上一个版本已被修改，已确认ISO 4832:1991的选择性方法不受影响。
绪论由于食品与饲料的种类繁多，这个标准不一定适合某一类产品。
在这种情况下，可使用不同的方法，但必须有绝对的技术上的理由。
否则，要尽可能地完全遵循本标准。
当这个标准下一次回顾时，将会对这个标准的使用做数据统计，特殊产品偏离本标准使用也会做相关统计。
同一类产品的检测方法也有可能不统一，国际性标准和/或国家标准也不一定完全与本标准相符合。
希望相关标准做回顾时，会遵循本标准做出相关的修改，以使只有已被证明的技术上的理由才能与本标准偏离。
本标准在技术上的描述没有ISO 4831那样精确，但大部分的微生物检测能根据本标准开展，每克或每毫升样品中含大数量的大肠菌群可使用本标准。
此外，由于另外两个标准中对“大肠菌群”的定义也不一致，因此检测出的微生物含量也不一定一致。
针对一些特殊的产品，方法的选择可参照相关的国际性标准。
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BS ISO 4832:2006食品和动物饲料的微生物学大肠菌群计数水平法--菌落计数技术序ISO是国际标准的全球性组织。
准备国际标准这项工作通常由ISO技术联盟来完成。
每一个团体成员负责各自的学科。
与ISO有合作的国际性机构、政府与非政府机构，也有参与这项工作。
ISO与国际电子组织（IEC）在电子标准化方面有着密切的合作关系。
国际性标准的起草原则在《ISO/IEC 细则》第三部分中有给出。
起草的国际性标准被技术委员会采用是通过全体成员投票决定的。
发布一个国际性标准需要至少75％成员投赞成票。
国际性标准ISO 4831 由ISO/IEC 34技术委员会（农产品，小组委员会SC9，微生物）起草的。
这个第三版的ISO 4832取代了ISO 4832:1991和ISO 5541-1:1986。
主要的修改内容如下：——在35℃下培养这个可选择的程序已被删除（见4.2）；——引入使用亮绿乳糖胆汁培养基做确证实验（见5.4和9.4）。
考虑到本标准的上一个版本已被修改，已确认ISO 4832:1991的选择性方法不受影响。
绪论由于食品与饲料的种类繁多，这个标准不一定适合某一类产品。
在这种情况下，可使用不同的方法，但必须有绝对的技术上的理由。
否则，要尽可能地完全遵循本标准。
当这个标准下一次回顾时，将会对这个标准的使用做数据统计，特殊产品偏离本标准使用也会做相关统计。
同一类产品的检测方法也有可能不统一，国际性标准和/或国家标准也不一定完全与本标准相符合。
希望相关标准做回顾时，会遵循本标准做出相关的修改，以使只有已被证明的技术上的理由才能与本标准偏离。
本标准在技术上的描述没有ISO 4831那样精确，但大部分的微生物检测能根据本标准开展，每克或每毫升样品中含大数量的大肠菌群可使用本标准。
此外，由于另外两个标准中对“大肠菌群”的定义也不一致，因此检测出的微生物含量也不一定一致。
针对一些特殊的产品，方法的选择可参照相关的国际性标准。
基于一个可实行的方法的目的，在条况3中给出的“大肠菌群”的定义并作为操作程序的基础，并不需要与其它相关文献保持一致。
在其它文献中定义的“大肠菌群”，部分通过发酵管检测并不能产气。
因此本标准中的检测方法并不能用于所有其它文献中提及的“大肠菌群”。
1 范围本标准给出常规的方法检测及计数大肠菌群。
它可适用于：——人类的食物及动物饲料；——食品生产和食品处理领域的环境样品。
通过计数固体培养基培养后的菌落数，温度控制在30℃或37℃。
注意：必须注意使用的温度，牛奶或奶制品的培养温度为30℃。
当估计每克或每毫升样品的数量超过100时，可使用本标准检测。
2 参考文献本标准的参考文献如下。
已过期的文献，后来改善或修订的，部分这种文献已经不适用。
未过期的文献，最新版本都是适用的。
ISO 6887（所有部分），食物与动物饲料原料微生物学——样品准备原则，微生物检测样品原液及十倍法稀释——第一部分：样品原液和十倍法稀释的指导准则。
ISO 7218，食物与动物饲料原料微生物学——微生物检验指导准则。
ISO 8261，牛奶和奶制品——样品原液和十倍法稀释的指导准则。
ISO/TS 11133-1，食物与动物饲料原料微生物学——准备和配制培养基的指导方针——第一部分：实验室中培养基的配制及质控。
ISO/TS 11133-2:2003，食物与动物饲料原料微生物学——准备和配制培养基的指导方针——第二部分：培养基配制的指导方针。
3 术语和定义以下术语和定义适用于本标准。
3.1 大肠菌群在特殊的温度下（例如30℃或37℃），按照本标准的操作，在结晶紫中性红胆汁乳糖培养基上的典型菌落，在确证实验中能发酵乳糖产气的一类细菌。
4 原理4.1 准备两个固体选择性培养基，接种一定量的液体样品原液或其它类型样品的悬液。
在相同的条件下，接种其它稀释梯度，每梯度两个平板。
4.2 平板置于30℃或37℃培养24h。
4.3 计数平板上的典型菌落数，如必要，选取一定量的菌落做乳糖发酵实验。
4.4 选择计数的平板上的典型菌落数可给出每克或每毫升样品的大肠菌群数量。
5 培养基与稀释液5.1 概述参照ISO 7218，ISO/TS 11133-1和ISO/TS 11133-2中准备和配制培养基，及培养基性能测试部分。
5.2 稀释液参照ISO 6887（相关部分），ISO 8261 或相关的国际性标准。
5.3 固体选择性培养基：结晶紫中性红胆汁乳糖（VRBL）培养基5.3.1 成分5.3.2 准备以下操作程序是为了保存该选择性培养基并维持性状。
将所有成分或干粉培养基溶解至水中，静置数分钟。
调整pH值，使之在煮沸后为7.4±0.2，在25℃下。
加热至煮沸，并使它沸腾数次。
维持沸腾2min。
然后在水浴锅中冷却至44℃～47℃。
为了避免过分加热，不能加热过长时间或反复加热。
因此，不能放于灭菌锅中灭菌，并在使用前检查无菌状况。
在准备好后4h内使用。
5.3.3 培养基质量控制参考ISO/TS 11133-1和ISO/TS 11133-2:2003，表B1。
5.4 确证培养基：亮绿乳糖胆汁肉汤5.4.1 成分5.4.2 准备溶解所有成分或培养基干粉于水中，如需要可加热。
如需要，可在25℃调整pH值至7.2±0.2。
分装培养基至规格为16mm×160mm试管中，每管10ml。
121℃灭菌15min。
必须保证灭菌后试管中不产生气泡。
5.4.3 培养基质量控制参考ISO/TS 11133-1和ISO/TS 11133-2:2003，表B1。
6 仪器设备及玻璃器皿一般的微生物实验室设备（参照ISO 7218），特别的，增加以下几项。
6.1 干热灭菌和湿热灭菌设备6.2 培养箱，可恒温35℃±1℃或37℃±1℃6.3 平皿，塑料或玻璃的，直径90mm～10mm6.4 移液器，1ml6.5 水浴锅，能恒温至44℃～47℃或100℃。
6.6 菌落计数器6.7试管，规格16mm×160mm6.8发酵小导管6.9三角瓶，用来煮沸和贮藏培养基6.10 pH计6.11接种环，白金或铬化镍，直径大概3mm。
7 取样ISO 6888中并不涉及取样。
如果没有相关的国际标准，建议需经过多方同意。
微生物实验室接收到的样品必须是真实代表样品的，并在运输和储藏期间没有损坏或改变微生物的性状。
8 样品前处理参照ISO 6887和ISO 8261 进行样品前处理。
如果没有相关的国际标准，建议需经过多方同意。
9 程序（见附录A）9.1 试验部分和样品原液参照ISO 6887和ISO 8261和特殊产品的相关标准。
9. 2 接种和培养9.2.1 准备两个平皿，接种1ml样品原液或其它稀释梯度。
每个稀释梯度用一个移液器。
9.2.2 每个平皿倾注15ml冷却至44℃～47℃的VRBL培养基。
从准备完样品原液至倾注平板的时间必须控制在15min内。
充分混匀接种物与培养基。
静置在水平面上凝固。
倾注15ml相同的培养基于空白平板中，做培养基无菌检查。
9.2.3 待培养基凝固后，覆盖一层冷却至44℃～47℃的VRBL培养基于平板表面，大概4ml。
按照上述操作放置待凝固。
9.2.4 倒置平板于培养箱中，30℃或37℃培养24h±2h。
9.3 平板计数培养结束后，选用10～150个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环。
菌落直径为0.5mm或更大。
详细的菌落计数操作见ISO 7218。
非典型的菌落同样要做计数和确证，从奶制品中分离出来的菌落不仅含有乳糖，还有食糖。
培养后要立即按照9.4操作。
转化食糖会使菌落大小比典型菌落更小一些。
注意：红色的胆盐沉淀环的产生由菌种的类型及培养基的质量决定。
9.4 确证试验每个非典型的菌落类型挑取5个菌落，接种亮绿乳糖胆汁肉汤，30℃或37℃培养24h±2h，观察产气情况。
按照证实实验的结果计算菌落数。
10 结果报告结果表述见ISO 721811 精密度在微生物检测的泊松分布基础下，本标准的置信界限随着菌落计数结果的不同在16％～52％之间变化。
在实际操作中，更大的变化可能出现。
根据大量的研究，重复性的标准偏差（Sr）为0.2个log单位，再现性的标准偏差（S R）为0.35个log单位。
更详细的置信界限信息在ISO 7218中已给出。
12 测试报告测试报告需包括以下：——样品的信息；——取样的程序，如果指导；——使用的方法；——使用的培养温度；——本标准中没有涉及的具体操作，和任何可能对结果造成影响的细节；——结果的获得，——如有检查实验的重复性，给出结果。
翻译人：翻译日期：校核人：校核日期：批准人：批准日期：。