猪2型链球菌

石河子部分猪场链球菌2型的分离鉴定与毒力因子检测霍永，李劼，张银国*(新疆石河子大学动物科技学院，石河子市832003)摘要：为了解石河子垦区具有呼吸道病症状的病死猪感染猪链球菌2型的情况，对采集的53份肺脏组织进行了猪链球菌的分离培养、生化鉴定、PCR鉴定以及cps2J、ef、mrp毒力因子的检测。

结果：分离出猪链球菌2型21株；其中株毒力因子为ef，株毒力因子为cps2J/ef结论：关键词：猪链球菌2型；分离鉴定；毒力因子猪链球菌2型(Streptococcus suis,SS2)是一种严重危害养猪业的重要病原之一，能引起猪的关节炎、脑膜炎、胸膜肺炎、败血症、脓肿等，并且猪链球菌2型能引起人感染发病，是重要人畜共患病病原[1]，从事屠宰或与生猪肉打交道的人易通过伤口感染，引致人脑膜炎、败血症、心内膜炎、并可致死[2]。

为了解石河子垦区具有呼吸道病症状的病死猪感染猪链球菌2型的情况，对采集的55份肺脏样品进行了猪链球菌2型的分离鉴定与药敏试验，以期为垦区预防和控制该病的流行提供重要依据。

1材料与方法1.1材料1.1.1病料于12个猪场无菌采集具有明显呼吸道病症状的病死猪肺脏组织，共75份。

1.1.2主要试剂及仪器含5%血清的Todd-Hewitt肉汤(THB)，含5%血清的选择性THB，普通琼脂绵羊血平板，选择性普通琼脂绵羊血平板；药敏纸片由本实验室自制；小白鼠由石河子大学实验动物中心提供。

2×Taq PCR MasterMix（北京诺维森生物科技有限公司），定量Marker1、Marker2000(广东东盛生物科技有限公司)，PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统均为Bio-Rad公司产品。

1.3.3引物合成猪链球菌2型荚膜多糖基因(cps2J)、溶菌酶释放蛋白基因(mrp)、胞外因子(ef)的引物参照文献[4]由上海生工生物工程有限公司合成。

详见表1：表1 PCR引物、退火温度及目的片段大小目的基因引物序列退火温度/时间产物大小ef P1 5'-ACA AAG GCG TAG GTT CAA TC-3'55℃/30s 269bp P2 5'-CGG CAT CAA GAA TGT CTT TG-3'cps2J P1 5'-GTT GAG TCC TTA TAC ACC TGT T-3' 55℃/30s 450bp P2 5'-CAG AAA ATT CAT ATT GTC CAC C-3'mrp P1 5'-GGTATACCT TGC TGG TAC CGT TC-3' 60℃/30s 532bp P2 5'-AGT CTC TAC AGC TGT AGC TGG-3'1.1.3PCR阳性对照××疫苗。

1.2方法1.2.1细菌的分离鉴定参照文献[3]，在无菌条件下，采集病死猪肺脏，革兰染色，镜检，将有G+双球菌或短链状的球菌病肺划线接种于普通琼脂绵羊血平板，37℃培养24h～36h；挑取平板上单个可疑菌落涂片，革兰染色后镜检，将镜检中发现的G+短链状球菌的单个菌落接种于选择性THB中，37℃培养24h，将菌液接种于选择性普通琼脂绵羊血平板，37℃培养24h，挑取平板上单个可疑菌落涂片，革兰染色后镜检，对G+链球菌菌落做过氧化氢酶试验，阴性者初步确定为猪链球菌2型分离株，将分离株菌落接种于含5%血清THB培养基中，37℃培养24h，接种于灭菌甘油-生理盐水中，-20℃冰箱保存备用。

1.2.2细菌的生化鉴定将分离的纯培养菌株分别接种于含5%血清THB培养基中，37℃培养24h 后，接种于5%乳糖、蔗糖、葡萄糖、D-核糖、甘露醇、山梨醇生化培养基中，每菌各接种2管，培养24h后观察并记录结果。

1.2.3PCR扩增及电泳鉴定1.2.3.1模板制备取经THB培养的菌液1mL，12000r离心10min，弃上清，沉淀用300μL TE洗涤1次，弃上清，沉淀加100μL无菌去离子水，在沸水浴中煮沸10min，12 000r离心10min收集上清为模板，置-20℃备用。

1.2.3.2反应体系与反应条件反应体系(25μL)：2×Taq PCR MasterMix12.5μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，模版5μL，灭菌ddH2O 5.5μL。

反应条件：预变性94℃5min，变性94℃40s，退火温度与时间见表1，延伸72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸10min。

取扩增产物8μL在1.5%琼脂糖凝胶中，以电压120V电泳30min，凝胶成像仪获取结果。

1.2.3 动物试验挑选30只健康小白鼠，试验前观察2d，确定无病健康后作为试验所用小鼠。

将含cps2J、ef、cps2J/ef毒力因子的分离株分别接入含5%血清THB培养液，37℃培养24 h后，将小白鼠分成1、2、3、4组，1、2、3组每组9只小白鼠，分3个笼子喂养每个笼子3只小白鼠，第4组为对照。

对第1、2、3组小鼠分别腹腔注射含cps2J 、ef 、cps2J/ef 毒力因子的细菌菌液0.3mL 、0.5mL 、1.0mL 并做好标记。

第4组小鼠腹腔注射不含细菌的5%血清THB 培养液作对照。

观察小鼠的发病及死亡情况，并对死亡小鼠进行细菌分离。

2结果与分析2.1细菌分离鉴定75份病肺组织直接涂片镜检后，有26份可见成对或链状G +球菌，链的长短不同。

将可疑菌接入含5%血清THB 中，24h 后出现白色絮状沉淀；在普通琼脂绵羊血平板上，37℃培养24h ～36h 后，长出灰白色、圆形、透明、湿润、中央突起，表面光滑、边缘整齐、呈α溶血、针尖大小的半透明小菌落，菌落直径在2-3mm 之间(见图1)，涂片镜检可见单个椭圆形或短链状G +球菌(见图2)；在选择性平板上的菌落呈灰白色半透明，圆形，扁平，表面光滑，菌落直径在1-2mm 之间(见图3)，显微镜观察可见长链状G +球菌(见图4)。

因此，该菌在普通琼脂绵羊血平板及选择性普通琼脂绵羊血平板上生长的菌落形态略有不同。

2.2生化鉴定分离株生化特性结果见表2：表2 生化鉴定结果试验项目结果 蔗糖+ 葡萄糖+ 麦芽糖+ D-核糖- 山梨醇- 甘露醇 -2.3 PCR 鉴定21株可疑分离株经PCR 鉴定，cps2J 毒力因子阳性 ? 株， ef 毒力因子阳性 ? 株，cps2J+ef 毒力因子阳性 ? 株。

尚未检出含有mrp 毒力因子的菌株。

M: DS TM 2000 Marker ；1：阳性对照，2-6：为分离细菌 M 1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5 6图5. 部分分离株cps2J 的PCR 检测结果bp2000→ 1000→ 750→ 500 250 100图7. 部分分离株cps2J 、ef 双重PCR 检测结果M ：Marker 1；1：阳性对照，2-8：为分离细菌2.4动物试验24h 后第2、3组小白鼠注射1.0mL 菌液的小鼠全部死亡，第3组注射0.5mL 菌液的一只体型较小的小白鼠死亡，两只较大体型的未死但精神不振，采食饮水下降，被毛直立见有轻度咳嗽症状。

注射0.3mL 菌液的小白鼠精神不振，卷缩在垫料中采食下降。

将死亡小鼠剖检可见小鼠心脏病变明显，出现淤血，个别见有胸腔积液。

将死亡小鼠心脏图片镜检，可见大量G +链球菌，将心脏剪碎在THB 培养基中培养24小时取菌液1.0mL 进行PCR 检测，结果与猪链球菌2型ef 毒力因子条带位点相同，证明从小白鼠体内分出的链球菌为含有ef 毒力因子的猪链球菌2型。

第1组未见小鼠死亡，只有注射1.0mL 的小鼠出现严重精神萎靡不振采食严重减少，其余小鼠采食饮水略微减少。

第4组未见异常。

48小时后第2组注射0.5mL 的小鼠死亡一只，第3组为见死亡，其余组小鼠也未见死亡。

3讨论本实验从细菌和菌落的形态特征、生化特性及PCR 方面对猪链球菌2型进行了分离鉴定。

通过细菌的菌落形态观察、显微镜观察、过氧化氢酶试验及生化试验初步确定为猪链球菌2型，最后经PCR 检测确定为部分含有cps2J 毒力因子部分含有ef 毒力因子的猪链球菌2型。

动物试验表明分离出的株猪链球菌2型中，含有ef 毒力因子的菌株具有致病性，而只含有cps 毒力因子的菌株无致病性，这与陆承平、何孔旺等人的有关报道相一致[9-10]。

试验还发现，导致小鼠死亡的原因与注射剂量、小鼠体型及个体差异有关。

参考文献[1] 杨珍，王楷宬，范伟兴，等.表观健康猪群携带猪链球菌情况流行病学调查[J].中国人兽共患病学报，2009，25 (10)：977-979.[2] 董国英,李敏,向华.人畜共患新病原—猪链球菌2型的研究进展[J].广东畜牧兽医科技, 2005, 30 (5)：8-13.[3] GB/T 19915.2-2005，猪链球菌2型分离鉴定操作规程[S].bp600 500 400 300200 100[4] 罗隆泽，王鑫，崔志刚，等.四川资阳地区健康猪2型猪链球菌分离与分子生物学特征分析[J].中国人兽共患病学报，2009，25 (9)：842-845.[5] 姚火春主编.兽医微生物学实验指导(第2版)[M].北京：中国农业出版社，2002：36-45.[6] 赵慧梅，黄素珍，梁航，等.山西省猪链球菌的分离鉴定及药敏试验[J].动物医学进展，2009，30(4)：17-23.[7] 徐引弟，王治方，朱文豪，等.河南省规模化猪场猪链球菌2型的分离鉴定和药敏试验[J].中国畜牧兽医，2010，37 (1)：155-157.[8] 俞伏松，车勇良，郭长明，等.猪链球菌2型福建株的分离鉴定[J].福建农林大学学报(自然科学版)，2008，37(3)：291-294.[9] 何孔旺，陆承平，倪艳秀，等.PCR方法检测2型猪链球菌2种毒力因子[J].扬州大学学报(农业与生命科学版)，2002，23 (3)：1-3.[10] 何孔旺，陆承平.猪链球菌2型的致病特性与毒力因子[J].中国兽医科技，2000，301(9)：7-19.。