洛伐他汀

洛伐他汀发酵培养基配方优化及15L罐放大作者:作者：吴波陈长华* 杨琳作者单位：华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海200237 来源：医学期刊 / 药学收藏本文章【摘要】利用响应面方法对土曲霉生产洛伐他汀的培养基进行了优化，使用两水平因子实验对培养基中的碳、氮源组分：葡萄糖、豆粕、蛋白胨、麦精和硝酸钠对洛伐他汀效价的影响进行分析，发现主要的影响因素为葡萄糖和豆粕。

通过进一步中心组合实验，考察葡萄糖和豆粕浓度对菌浓、效价、残糖浓度、单位菌体产量(YP/X)和得率(YP/S)的作用。

并通过引进残糖浓度为参考，得到最优的葡萄糖和豆粕配比分别为22%和5%，结果比对照提高了17%。

同时在15L发酵罐上放大，确定最适初始葡萄糖浓度为21%，效价为7.34g/L。

【关键词】响应面设计法；洛伐他汀；土曲霉；发酵Optimization of medium components forlovastatin production and scale up in 15L bioreactorWu Bo, Chen Chang-hua and Yang Lin(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University ofScience and Technology, Shanghai 200237)ABSTRACT Response surface design method was used to optimize the medium components for lovastatin produced by Aspergillus terreus. Effects of glucose, soybean meal, peptone, malt extract and NaNO3 on lovastatin productivity were evaluated using a 2-level factorial design. Among the components investigated, glucose and soybean meal played important roles in lovastatin production. A central composite design was used to review the effects of glucose and soybean meal to concentration of biomass, lovastation, and residual glucose respectively, as well as YP/X and YP/S. The optimized concentrations of glucose and soybean meal were 22% and 5% respectively, by using residual glucose concentration as a reference, and the optimized medium resulted in a significant increase of lovastatin yield by 17%, as compared with the original one. It was concluded that the optimal concertration of glucose was about 21% and the lovastatin yield was 7.34g/L.KEY WORDS Response surface design; Lovastatin; Aspergillus terreus; Fermentation洛伐他汀(lovastatin)是第一个经FDA批准上市的降血脂他汀类药物，由于其竞争性的抑制了体内胆固醇合成的关键酶-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG)的活性，从而起到降低血液中胆固醇含量的作用。

使用土曲霉发酵法生产洛伐他汀，有作者着眼前体的影响［1］，本文考虑培养基中成分如碳源、氮源、无机盐和维生素等多种因素的影响。

采用响应面设计法从原发酵培养基中选出对洛伐他汀合成最主要的影响因素，并考察了培养基中主要的碳、氮源对菌浓、残糖、单位菌体产量(YP/X)和得率(YP/S)的影响。

1 材料与方法1.1 菌种和培养基(1)菌种土曲霉(Aspergillus terreus)Top253由河南天方药业提供。

(2)种子培养基(%) 葡萄糖10，豆粕2，蛋白胨0.5，麦精0.5，氯化钠0.2，磷酸二氢钾0.05，硫酸镁0.05。

(3)发酵培养基(%)葡萄糖20，豆粕4，蛋白胨1，麦精0.5，氯化钠0.2，磷酸二氢钾0.05，硫酸镁0.05，硝酸钠0.1，豆油0.1。

1.2 培养方法(1)种子培养斜面挖块约1cm2于500ml的种子摇瓶中，培养基装量50ml，26℃培养120h，摇床转速220r/min。

(2)发酵培养种子液按20%的接种量接入发酵培养基中，26℃培养240h，摇床转速220r/min。

1.3 测定方法(1)洛伐他汀含量测定方法实验条件高效液相色谱为Waters HPLC系统，数据处理器为Breeze Date Processor，色谱柱为Phenomenx C18柱(250mm×4.6mm)，流动相为0.1%磷酸溶液∶乙腈(30∶70)，流速为1.0ml/min，检测波长238nm。

以上所有试剂为分析纯或高纯。

样品预处理吸取发酵液(包括菌体)5ml于250ml锥形瓶中，加入20ml乙酸乙酯以及玻璃珠数颗，用橡胶塞塞好，在摇床上萃取10h，取上清液约5ml，用高速离心机以10000r/min转速离心10min，0.22μm孔径膜过滤上清液，置进样管中分析。

数据处理根据高效液相色谱图积分求得的峰面积S由标准曲线y=kx+b，进样体积V(μl)和稀释倍数n计算洛伐他汀的含量C：C=(S-b)/(kV)×n(g/L)(2)菌浓测定方法菌浓采用离心菌体体积测定，吸取发酵液10ml于15ml 离心管中，用超速离心机以3000r/min转速离心15min，取出倒掉上清液读数，菌浓单位为ml菌体/100ml发酵液。

(3)残糖的测定方法残糖使用斐林法测定。

(4)YP/X和YP/S的计算单位菌体产量(YP/X)=效价/菌浓(g产物/ml菌体)得率(YP/S)=效价/初始总糖(g产物/g葡萄糖)2 结果与讨论2.1 两水平因子设计试验及结果根据初始培养基配方，从中选取主要的碳、氮源：葡萄糖(A)，豆粕(B)，麦精(C)，蛋白胨(D)，硝酸钠(E)5种成分，应用Design-Expert 7.0软件进行两水平因子设计，找出最显著的影响因子，实验设计和结果如Tab.1。

从Tab.2的实验结果看出，该模型的F值为86.89，说明这个模型是显著的；如果P<0.05，则说明模型中该项有显著性影响，该模型中A、B、AB、BD和CE是模型的显著项。

Curvature F(曲率)值为35.10，表示响应面中有显著的弯曲(通过中心点和因子点的平均值不同测量得知)。

Lack of fit(不符合度)反映的是实验数据与模型不相符的情况，它的F值为2.31，与整个模型的86.89比起来很小，表示不符合的数据相对于纯误差是不显著的，也就是说该模型比较符合实验数据。

对模型进行方差分析得到如下数据：R2=0.9858，Adj R2=0.9745，Adeq Precision=24.453Adeq Precision测得是信号与噪音的比率，它的值通常应大于4，本实验等于24.453，说明这个模型能合适地反映实验结果。

方程系数R2为0.9858表示此方程有较好的拟合度，方程与实际情况比较相符，并能做出相对准确的预测［2，3］。

在模型中可以看出葡萄糖(A)和豆粕(B)的浓度对洛伐他汀的效价是显著的影响因子。

其中葡萄糖的P值<0.0001，说明葡萄糖的量对洛伐他汀的效价是最显著的因子。

葡萄糖是培养基中最主要的碳源，供应菌体生长，并且产生洛伐他汀合成所必需的前体乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A［4］。

培养基中的氮源为限制性因素，豆粕是培养基中重要的氮源，直接影响菌浓的高低，洛伐他汀是胞内产物，所以其高产量必然要求一定的菌体量，当豆粕浓度过高时，使得过多的碳源用于合成菌体，而流向洛伐他汀合成的碳源减少。

2.2 中心组合实验根据以上两水平因子设计实验选出两个主要影响因素(葡萄糖和豆粕)，接下来的中心组合实验固定麦精、蛋白胨和硝酸钠的浓度，对葡萄糖和豆粕的浓度进行优化。

前面实验设计的结果显示，洛伐他汀的效价随着初始糖浓度的提高而增大，在实验设计的葡萄糖浓度范围(10%～30%)内，并没有出现拐点。

但是初始糖浓度太高，使得残糖浓度上升，当培养基中初始糖浓度达到30%时，发酵结束时测得的残糖浓度还有7%，这对实际生产中生产成本以及后期的提取是不利的，所以我们引进残糖浓度作为参考，调整初始糖浓度为16%～24%，使得发酵结束残糖浓度适中，同时考察葡萄糖和豆粕对菌浓、效价、残糖浓度、单位菌体产量(YP/X)和得率(YP/S)的影响。

实验方案和结果见Tab.3、Tab.4。

用Design-Expert 7.0软件对数据进行分析，得到葡萄糖和豆粕浓度对菌浓影响的三维模拟图(Fig.1)，其中A为葡萄糖，B为豆粕，Fig.1表明对菌浓的影响是一个线性的模型，并由软件得到菌浓的模拟公式：菌浓(%)=20.0+0.130×A+5.20×B从以上公式看出培养基中豆粕的含量对菌浓的高、低是最主要的影响因素。

当葡萄糖浓度为20%时，将培养基中豆粕浓度由3%提高到5%，则菌浓由38%增加到49%。

由于培养基中氮源是限制性因素，随着豆粕的增加，菌浓增大。

葡萄糖的量增加也会影响菌浓，当豆粕浓度为4%时，葡萄糖浓度从16%提高到24%，菌浓从43%增加到44%，可见葡萄糖浓度对菌浓影响不显著。

用Design-Expert 7.0软件对数据进行分析，得到葡萄糖和豆粕浓度对洛伐他汀效价影响的三维模拟(Fig.2)，Fig.2表明葡萄糖和豆粕相对于效价的影响是一个线性模型，葡萄糖的量对洛伐他汀的效价是最显著的影响因素，随着葡萄糖的增量，洛伐他汀的效价也增长，培养基中豆粕浓度为4%时，葡萄糖由16%增加到24%，效价从5.00g/L提高到6.78g/L，与Casas等［5］报道的初始碳氮比高更有利于洛伐他汀的合成是一致的。