细胞壁成分测定

一、杏鲍菇(pleurotus eryngii) 冷藏保鲜技术及自溶机理研究

(巩晋龙2013福建农林大

学)

细胞壁物质成分(蛋白质、可溶性糖、几丁质、纤维素)的测定

(1) 细胞壁乙醇不容物(AIS)的制备：参照Ziva no vic S et al. 等［144］方法并做一些

修改：取混匀后的样品组织200 g于95%的乙醇溶液中浸提10 min，然后煮沸5 min，放置于室温下沉淀过夜，过滤，残渣用78%乙醇进行洗涤，过滤后60 C真空干燥过夜，置于干燥器中冷却至室温，干样经粉碎后过筛，即得乙醇不容物(AIS)。

(2) 细胞壁物质成分的测定：

乙醇不容物(AIS)中可溶性蛋白质含量的测定参照考马斯亮蓝染色法［117］，以标准牛血清蛋白溶液制作标准曲线。精确称取25 mgAIS，加蒸馏水，浸提10 min , 12000 x g离心

20 min，吸取1.0 mL 上清液于10 mL容量瓶并定容至刻度。吸取 1.0 mL 样品提取液，

放入具塞试管中，加入 5.0 mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置 2 min后在波长

595 nm处比色测定其吸光度，重复3次，计算可溶性蛋白质的含量。

乙醇不容物(AIS)中可溶性糖含量的测定采用苯酚-硫酸法［117］以标准蔗糖溶液制作标准曲线。精确称取25 mgAIS于20 mL具塞试管中，加入10 mL蒸馏水，薄膜封口，沸水中煮沸提取30 min，冷却、过滤，将残渣回收到试管中，加10 mL蒸馏水，重复沸水浴提

取10 min，过滤，洗涤，将滤液一并转入50 mL容量瓶并定容至刻度。吸取 1.0mL提取

液于具塞试管中，加入 1.0 mL蒸馏水，1.0 mL0.09 g/mL苯酚溶液，摇匀，再加入 5.0 mL 的浓硫酸，充分振荡后在室温下反应30 min，在波长485 nm 处比色测定其吸光度，重复

3次，计算可溶性糖的含量。

乙醇不容物(AIS)中几丁质的测定方法参照傅海舰等［145］，以标准D-氨基葡萄糖盐酸盐溶液制作标准曲线。精确称取25 mg于25 mL容量瓶中，加入 5 mL 2 mol/L 盐酸溶液

溶胀，混匀后，冰水浴中加入15 mL浓硫酸，沸水中煮沸30 min，冷却至室温，去离子水

定容至刻度。吸取水解液 1 mL与10 mL容量瓶中，依次加入 1.0 mL 2%间苯二酚水溶液、

7.5 mL 75%浓硫酸溶液，混匀，沸水浴加热30 min，凉水冲至室温，定容，以空白作对照，

在500 nm处比色测定其吸光度，重复3次，计算几丁质含量。

乙醇不容物(AIS)中纤维素含量的测定方法参照宁正祥等［146］以标准葡萄糖溶液制作

标准曲线。精确称取0.5 gAIS与烧瓶内，加入120 mL2%盐酸溶液，回流煮沸 3 h，抽滤，用热水洗涤2~3次，抽干，再用乙醇和乙醚洗涤1次，低温烘干。用20 mL80%硫酸溶液

将其转移到锥形瓶内，摇匀，放置 2 h，加入300 mL蒸馏水，置于沸水浴中加热 5 h,冷

却，过滤至500 mL容量瓶并用蒸馏水定容至刻度。取0.5 mL样品提取液加入25 mL具

塞刻度试管中，加 1.5 mL蒸馏水、0.5 mL蒽酮-乙酸乙酯试剂和 5.0 mL浓硫酸，充分振

荡，沸水浴加热1 min ，冷却至室温，在630 nm 处比色测定其吸光度，重复3次，计

算纤维素含量。

二、主要食用菌采后品质劣变机理及调控技术研究(姜天甲2010浙大)

1细胞壁乙醇不溶物(alcohol-i nsoluble residue,AIR) 的提取

乙醇不溶物(AIS)的制备参照Zivanovicetal.(2000) 等的方法。细胞壁各组分抽提参照

Sietsmaetal.(1981) 的方法并做了些修改：取20omgAIS,用煮沸的蒸馏水15mL抽提Zh,提取

溶液在4oc经13000只g离心20min,收集上清液并定容至25mL得水溶性组分；取水不溶性沉淀,以IMNaoH溶液15mL在60OC下抽提20min,旋转离心，收集上清液并用冰醋酸将PH值调至7.0,定容至25mL得IMNaOH可溶性组分；取IMNaOH不溶残渣,以10MNaOH溶液15mL煮沸并抽提111,旋转离心，收集上清液并用冰醋酸将PH值调至7.0,定容至25mL得lOMNaOH

可溶性组分；取lOMNaO不溶残渣，以6MHel溶液smL煮沸并抽提4h,旋转离心后收集上清液，残渣用IMNaOH溶液10mL在60oC下抽提20mill,旋转离心并收集上清液，将这两部分上清液合并然后用水定容至25mL得HCI/IMNa0H可溶性组分；剩余不溶物为残渣组分。

2细胞壁物质成分的分离和测定

乙醇不溶物(AIS),水溶性组分与1MNaoH可溶性组分中的可溶性蛋白含量参照

Bradford(1976)的方法进行测定，以牛血清白蛋白制作标准曲线。吸取提取液一lmL于试管中，然后加入smL考玛斯亮蓝G一250试剂，混合均匀，放置5min后在595nm下比色测定吸光度，计算可溶性蛋白含量。

乙醇不溶物(A工S)与所有组分中的可溶性糖含量测定采用葱酮比色法(曹建康等,2007),以蔗糖制作标准曲线。吸取提取的上清液lmL于试管中，加lmL蒸馏水，O.smL葱

酮乙酸乙醋和smL浓流酸,充分振荡后立即放入沸水浴中保温lmin,取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在63Onm波长下测其吸光度，计算可溶性糖含量。

乙醇不溶物(AIS)与所有组分中的几丁质的测定方法参照傅海舰等(2003),以D 一氨基葡萄糖盐酸盐制作标准曲线。吸取水解液lmL于10mL的容量瓶中，加2涮苯二酚水溶液lmL, 然后加入75%勺浓硫酸溶液7.smL混匀，沸水浴中加热3omin,凉水冲至室温，定容,以空白作参比,在soonm波长下测其吸光度，计算几丁质含量。

乙醇不溶物(AIS)中的纤维素含量参照UPdegraff(1969)的方法进行测定，以纯纤维素制作标准曲线。吸取提取液ZmL于试管中，加入O.smLZB葱酉同试剂，并沿管壁加smL浓HZSO4, 塞上塞子，摇匀，静置12min,然后在62Onm波长下测其吸光度，计算纤维素含量。