WB操作步骤-自己整理

Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法）

人工肝实验室学习姚瑶

（一）目的蛋白提取：

（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：

1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。

2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。

共洗三次，每次十分钟。

3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。

4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做）

5、4℃，12000转离心10min。

6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。

（2）组织中总蛋白的提取：

1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。

2、配平后，4℃，14000转离心10min。

3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定：

1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。

2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。

3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。

4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。

5、37℃水浴30min。

6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。

7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。

（三）SDS-PAGE电泳：

（1）清洗玻璃板

（2）灌胶与上样：

1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。

以5ml 10%分离胶、3ml 5%浓缩胶为例：

10%分离胶5%浓缩胶

去离子水 1.9ml 2.1ml

30%聚丙烯酰胺 1.7ml

0.5ml

1.5M Tris-HCl（Ph8.8） 1.3ml ------

1.0M Tris-HCl（Ph6.8）------- 380ul

10%SDS 50ul 30ul

10%AP 50ul 30ul

TEMED 2ul 3ul

2、处理蛋白：计算含20-50ug蛋白的溶液体积即为上样量，

加入上样量等体积的2×上样缓冲液Buffer，再加入上述总体积1/10的β-巯基乙醇，混匀后，放入PCR仪内，95℃反应10min。

3、加样：加入1×Tris-甘氨酸电泳液，电泳液至少要漫过内侧小玻璃板，取下梳子，安装好电泳槽，倒入缓冲液，微量加样器加样。需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染。

（3）电泳：100V，20min，待溴酚蓝成一直线后，150V，电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳(一般1.5h)，取出跑好的凝胶，切胶至适合大小。进行转膜。也可在转膜前验证是否有目的条带，使用考马斯亮蓝液置于摇床染色12h。染完后观察，用脱色液脱色，20min/次，直至透明。再进行转膜。

（四）转膜：

配制1×转膜缓冲液（现配）。一般配制成10×转膜缓冲液储存。需要时配制成1×现用。PVDF膜需用甲醇激活(15s)，注意戴手套、赶走气泡、胶与膜的位置、膜的正反面。

放置顺序为：海绵--滤纸2层—PVDF膜—凝胶--滤纸2层—海绵。（大小：凝胶>滤纸>PVDF膜）

（五）免疫反应：

1、5%脱脂奶粉封闭，4℃过夜。

2、一抗孵育。

3、洗膜：PBST/TBST洗膜3次，10min/次。

4、二抗孵育。

5、洗膜：PBST/TBST洗膜3次，10min/次。

（六）显色：

将HyGLO试剂A 750ul与试剂B 750ul混合后，均匀地滴于膜正面，约1min后，抖掉膜上液体，并吸干后显色。

在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：

一、超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。

二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。

三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。

丽春红染色剂是一种阴离子重氮染料，由重氮氨基偶氮苯二磺酸（diazotized 4-amino-1,1’-azobenzene-3,4’-disulfonic acid）和萘酚二磺酸（2-naphthol- 3,6-disulfonic acid）耦合到四钠盐上。其分子式C22H12N4Na4O13S4，分子量为760.6。最大吸收光谱为520nm波长。带负电荷的丽春红分子与正电荷的蛋白质氨基基团结合，也可以非共价键形式与蛋白质非极性区域结合。

丽春红染色溶液是染料丽春红与蛋白质氨基基团的结合并显示红色蛋白条带，快速、敏感、可逆地检测PVDF膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜上的蛋白成分。丽春红染色溶液性能长期稳定，着色清晰灵敏，可检测250ng以上的蛋白。

丽春红对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用蒸馏水，PBS或其它适当溶液漂洗去除。

使用方法：

1．取适量丽春红染色液，用去离子水10X稀释备用，染色液的用量，依膜的大小而定，浸没膜即可；

2．将PVDF膜、硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜浸没在丽春红染色液中，振荡5-10分钟或更长时间；

3．取出印迹膜，用蒸馏水，PBS或其它适当溶液漂洗2-3次，可出现清晰条带，记录结果；

4．用蒸馏水，PBS或其它适当溶液漂洗2-3次，每次3-5分钟，去除丽春红，进行后续的Western检测。

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