蛋白质分子定向进化其他方法
蛋白质的体外定向进化
蛋白质的体外定向进化概述蛋白质是生物体中起着重要作用的大分子有机化合物，具有广泛的生物功能。
研究人员通过对蛋白质结构与功能的深入探索，不仅能够揭示生命的奥秘，还能够为药物设计和工业生产等领域提供重要的指导。
然而，天然界中存在的蛋白质种类有限，无法满足人们日益增长的需求。
因此，开发新型蛋白质成为现代生物科学的热点之一。
蛋白质的设计与进化是一项关键性的工作。
体外定向进化是一种重要的蛋白质工程技术，通过在体外模拟自然界的进化过程，使蛋白质的性质得以改良和优化，以满足特定的应用需求。
蛋白质的体外定向进化流程蛋白质的体外定向进化通常包括以下步骤：1.库构建：首先，需要构建一个包含大量变异蛋白质的基因库。
这可以通过人工合成DNA序列、使用随机突变或利用现有的蛋白质序列进行改造等方式实现。
2.库筛选：将基因库中的变异蛋白质表达出来，并通过适当的筛选方法对其进行选择。
常见的筛选方法包括亲和层析、抗体标记、酶活性测定等。
3.评估鉴定：对筛选出的蛋白质进行鉴定，包括测定其结构、功能和稳定性等性质，并与天然蛋白质进行比较分析。
需要特别注意的是，鉴定过程中需要采用一系列的生物化学和生物物理方法，如质谱、光谱和动力学分析等。
4.优化进化：基于初步筛选和评估鉴定的结果，对筛选出的蛋白质进行进一步的优化和进化。
这可以通过遗传算法、DNA重组技术、蛋白质工程等手段实现。
5.验证应用：最后，对优化后的蛋白质进行进一步的验证和应用，包括在生物医学研究、产业生产以及药物设计等领域的应用。
蛋白质的体外定向进化方法和技术蛋白质的体外定向进化涉及到多种方法和技术，以下是其中的一些常用手段：1.串联重组：将不同的蛋白质片段通过连接肽链的方式进行重组，生成具有新功能的蛋白质。
2.随机突变：利用化学方法或遗传方法对蛋白质的氨基酸序列进行随机改造，产生大量的变异蛋白质。
3.异源进化：将蛋白质序列从一个物种转移到另一个物种，通过适应新的环境条件，使其获得新的功能。
蛋白质工程定向进化
蛋白质工程定向进化一、前言蛋白质是生命体系中最基本的分子之一，也是生物学研究的重要对象。
随着现代生物技术的不断发展，蛋白质工程技术也得到了快速发展。
其中，蛋白质工程定向进化技术是一种重要的手段，可以用于改良蛋白质性质或者合成新的功能性蛋白质。
本文将对蛋白质工程定向进化技术进行详细介绍。
二、蛋白质工程定向进化技术概述1. 蛋白质工程简介蛋白质工程是指通过人为设计和改造来改变蛋白质的结构和功能，以满足特定需求的一种技术。
它主要包括两个方面：基因重组技术和突变策略。
基因重组技术主要通过DNA重组来改变目标基因序列从而实现目标蛋白表达；突变策略则主要通过引入突变来改变目标蛋白的结构和功能。
2. 定向进化简介定向进化（Directed Evolution）是一种利用自然选择原理加速分子优化的方法。
它通过在大量变异体中筛选出具有所需性质的分子，进而实现对分子性质的改良和优化。
定向进化可以应用于各种生物分子，如蛋白质、核酸等。
3. 蛋白质工程定向进化技术蛋白质工程定向进化技术是将蛋白质工程和定向进化结合起来的一种手段。
它通过引入随机突变和筛选来改变目标蛋白的结构和功能，从而实现对目标蛋白性质的改良和优化。
三、蛋白质工程定向进化技术原理1. 随机突变随机突变是指在目标基因序列中引入随机变异，使得产生大量具有不同性状的突变体。
随机突变可以通过多种方式实现，如自然突变、PCR扩增等。
2. 筛选筛选是指在大量随机突变体中选择具有所需性状的分子。
筛选方法包括：基于酶活性或者细胞生存能力等可测量特征进行筛选；利用选择压力诱导所需特征表达等。
3. 重复迭代重复迭代是指不断进行随机突变和筛选，以逐步优化分子性状。
这个过程需要进行多次，每一轮都会产生新的突变体，进而实现对分子性质的改良和优化。
四、蛋白质工程定向进化技术应用1. 蛋白质结构优化蛋白质工程定向进化技术可以用于优化蛋白质结构，从而提高其稳定性和活性。
例如，通过引入突变来改变酶的催化活性中心的位置和大小，从而提高酶的催化效率。
蛋白质分子体外定向进化研究进展
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实用医学杂志 !""# 年第 !! 卷第 $$ 期
性筛选、酶活性筛选、细胞活性筛选等。 &’( 的方法有：固相筛选、使用放射性染 料筛选、荧光筛选、闪烁接近化验、)*+(,、 利用细胞的功能筛选和利用小鼠显型的 表型遗传学筛选等。 ! 蛋白质分子体外定向进化的应用及 发展前景
定向进化成就主要在以下方面 -! .：生 物分子活性和稳定性的改善 -$# .、在非天然 环境下的活性和稳定性 -$/ .、抑制剂或抗生 素抗性 -$0 . 、抗体亲和力的提高、新型疫苗 和药物分子的发现、新功能的开发和底物 范围及底物特异性的改变、新的代谢途径 的开发，甚至预测自然进化中新突变的出 现等。
定向进化第一步是由一个靶基因或 一群相关的家族基因起始创建分子多样 性 * 突变和 ’ 或 ( 重组 + ；然后对该多样性文 库的基因产物进行筛选，那些编码改进功 能产物的基因被利用来继续下一轮进化； 重复这个过程直到达到目标。该进化策略 有以下 % 个显著特征：’ $ ( 进化的每一关 键步骤都受到严密控制。 ’! ( 除修饰改善 蛋白质已有特性和功能外，还可引入一个 全新的功能，来执行从不被生物体所要求 的反应；甚至为生物体策划一个新的代谢 途径 *$ < !+。 ’% ( 能从进化结果中探索蛋白 质结构和功能的基本特征。 " 体外定向进化常用方法 != $ 易 错 >?@ 易 错 >?@ ’ /22920A298/ >?@) /A>?@ ( 是指通过改变 >?@ 的反应 条件 *% < B +，如：调整反应体系中 B 种 1CD> 的浓度、增加 E7! F 的浓度、加入 E8! F 或使 用低保真度 D6G 酶等，使碱基在一定程度 上随机错配而引入多点突变，构建突变 库，筛选出所需的突变体。易错 >?@ 的关 键是控制 HCI 的突变频率。如果 HCI 的 突变频率太高，产生的绝大多数酶将失去 活性；如果突变频率太低，野生型的背景
分子定向进化
分子定向进化是指模仿自然进化过程的策略，通过人为操作实现分子的改造。
这种进化方法无需预先了解蛋白质的结构和作用机制，即可获得具有特定功能或全新功能的蛋白质或DNA。
定向进化通常从靶基因或一组相关家族基因或DNA 开始，通过突变或重组等手段创建分子的多样性，然后对多样性文库进行筛选，以获得具有新功能的基因或DNA。
定向进化可以在试管中模拟达尔文进化过程，按需施加选择压力，以筛选出具有期望特征的蛋白质，从而在分子层面上实现模拟进化。
这种方法已被广泛用于改善蛋白质性能，比如改进蛋白质药物的稳定性、半衰期、免疫原性，开发酶的新底物利用以及改进或拓展新的代谢途径等。
定向进化常用的策略包括易错PCR技术，这种方法对于建立任意核苷酸序列文库或在表达及筛选过程引入突变同样有用。
酶体外定向进化技术及其发展
酶体外定向进化技术及其发展酶的定向进化是20世纪90年代初兴起的一种蛋白质工程的新策略，近年来发展迅速。
酶能催化各种各样的化学反应，可使需要几天几个月甚至几年时间完成的转化在几分钟甚至几秒钟内完成，能催化化学方法难以完成的反应，如构象的改变等。
同时，它无毒无害，对环境没有污染，在环境问题日益严重的今天，酶的应用显得至关重要。
1 概述酶的体外定向进化又称蛋白质分子定向进化，是蛋白质工程的新策略。
简单来说，就是在事先不了解酶的空间结构和催化机制的情况下，在实验室中通过模拟达尔文自然进化过程，让目标酶分子在预先设计好的道路上快速进化，获得有价值的非天然酶。
定向进化是随机突变和选择的结合，随机突变是人为控制某些条件改变而引发的。
后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起选择预期方向的突变、排除其他方向突变的作用，整个进化过程是在人为控制下进行的。
定向突变使在自然选择条件下需几百万年乃至上亿年才能完成的进化过程，缩短到几年、几个月，甚至更短的时间，加速了酶的进化过程。
目前，该方法主要应用于提高酶的稳定性、酶活性、对有机溶剂的耐受性，扩大底物的选择性，改变光学异构体的选择性等方面。
在目前已发现的8 000多种酶中，真正能够进行大规模生产和应用的商品酶并不多，主要原因是天然酶的性质与生产环境，例如高温、高压、有机溶剂、极端pH等的要求相差甚远。
天然酶的底物选择性等性质难以满足对蛋白酶的需求。
酶的定向进化技术是酶工程学研究的有效工具，该技术的发展使酶应用于工业生产成为可能。
2 酶体外定向进化的常用方法2.1 易错（error-prone）PCR易错PCR技术是指采用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过调整反应条件，比如提高镁离子浓度、加入锰离子等方式改变体系中4种dNTP的浓度等，改变Taq酶的突变频率，从而向目的基因中引入随机突变构建出突变体库，并从中选择或筛选出所需要的突变体。
由于在实验中仅经过一次易错PCR扩增，所以往往很难得到所需的突变，由此而产生了连续易错PCR扩增技术，即一次PCR获得的扩增基因作为下一次的目的基因进行操作，连续多次进行上述PCR过程，直至获得突变显著的结果基因。
理性设计和非理性设计：蛋白质工程的两种方法
理性设计和非理性设计：蛋白质工程的两种方法蛋白质工程是指修改或创造具有期望功能或性质的蛋白质，如催化活性、结合亲和力、稳定性、溶解性、特异性或新颖性。
蛋白质工程在各个领域有许多应用，如生物技术、医学、农业和工业。
蛋白质工程的两种主要方法是理性设计和非理性设计（或定向进化）。
这两种方法有不同的优势和局限性，可以结合使用以达到最佳效果。
理性设计理性设计是指根据已有的关于蛋白质的结构、功能、催化机理等信息，有目的地选择要突变的氨基酸残基，以期望得到具有改善或新颖性能的蛋白质。
理性设计通常需要对蛋白质的三维结构和活性位点有较深入的了解，以便预测突变的效果。
理性设计的优点是可以减少突变体的数量，提高筛选的效率，以及针对特定目标进行优化。
然而，它也存在一些局限性，比如对蛋白质结构和功能的知识不足，以及突变之间的相互作用难以预测等。
理性设计可以采用以下几种技术：●手工设计：根据经验或直觉，选择合适的氨基酸进行替换或插入。
●生物信息学分析：利用数据库或软件，比较不同蛋白质的序列或结构，寻找保守或变异的区域，分析氨基酸残基之间的相互作用，预测突变对蛋白质稳定性和活性的影响。
●计算机模拟：利用计算机程序，对蛋白质结构进行建模或优化，模拟突变后的蛋白质与底物或配体的结合过程，计算突变对蛋白质能量和动力学的影响。
●从头设计：利用计算机程序，根据期望的功能或性质，设计出全新的蛋白质序列或结构。
非理性设计（或定向进化）非理性设计（或定向进化）是指通过引入随机突变和重组，产生大量的蛋白质突变体文库，然后通过筛选或选择来寻找具有期望特性的蛋白质。
非理性设计不需要对蛋白质的结构或催化机理有任何先验知识，只需要建立一个有效的筛选或选择系统，就可以模拟自然进化的过程，从而探索蛋白质功能的多样性。
非理性设计的优点是可以发现一些意想不到的突变效果，甚至可以创造出一些全新的功能，但是也存在一些挑战，比如如何产生高质量和高多样性的突变体文库，以及如何进行高通量和高灵敏度的筛选或选择等。
蛋白定向进化及应用进展
蛋白定向进化及应用进展袁 宁,胡又佳,朱春宝(上海医药工业研究院,上海200437)摘 要:目的作为对自然进化的体外模拟,定向进化是改进蛋白功能与活性的有效手段。
定向进化的成功与否取决于突变体库的多样性以及筛选方法的效率。
目前已发展出多种创造和筛选突变体的策略及手段,并将定向进化的对象从蛋白延伸到有机体,使定向进化在许多领域得到了广泛的应用。
关键词:定向进化;DNA 改组;全基因组改组;高通量筛选中图分类号:TQ931 文献标识码:A 文章编号:1005 1678(2008)01 0065 04Progress in directed evolution of protein and its applicationYUAN Ning,HU You jia,ZHU C hun bao(Shanghai Institute o f Pharmaceutical Industry ,Shanghai 200437,China)收稿日期:2007 05 22作者简介:袁宁(1977 ),男,江苏南京人,博士研究生,主要从事微生物与生化药学研究;朱春宝,通信作者,研究员,博士生导师,Tel:021 ******** 323,E mail:zhucb@ 。
随着现代生物科技的突飞猛进,以蛋白质为核心的产品或技术在科研、工农业生产、医药卫生、环保等领域中正发挥着越来越重要的作用。
为了使蛋白质产品能够更好地满足需求,人们一方面在不断发掘新的活性蛋白质,另一方面也开始将目光投向对现有蛋白质的改造。
在自然界,生命的进化和新功能的获得需要通过突变、重组和适者生存等过程来实现,而在实验室中进行的蛋白质改造正是对这一过程的模仿:首先创造突变文库,然后采用选择或筛选的方法从中挑选出满足特定要求的突变体。
由于目的蛋白质的特性是预先设定好的,因此这一改造过程被称为 定向进化(directed evolution) 。
按照创造突变的方式,定向进化可采取随机、半理性和理性等策略来进行。
蛋白质定向进化
蛋白质定向进化近几年，蛋白质定向进化技术正在快速发展，它能够改变蛋白质和其他生物分子的性能，从而实现有效的研究和应用。
本文将专注于蛋白质定向进化的基本原理，应用，以及其未来发展潜力。
蛋白质定向进化是什么？蛋白质定向进化（Protein Directed Evolution，简称PDE）是一种新型的生物技术，可以通过模拟自然选择和中和进化的过程，来改变蛋白质的性质，通过定向改变蛋白质的活性，稳定性等特性，以达到更高的性能。
蛋白质定向进化的原理蛋白质定向进化的基本原理是，通过对蛋白质的大量变异，然后根据突变后蛋白质的性质选择性保留最有价值的蛋白，然后再次进行变异，达到不断改善蛋白质性能的目的。
通常，变异过程通过分子生物学和其他实验手段实现，而在每一代变异后，将蛋白质通过筛选的方法从细菌中纯化出来，从而构建一个“定向进化的蛋白质系列”。
蛋白质定向进化的应用蛋白质定向进化技术可以用来改善蛋白质的活性、稳定性、过氧化物酶催化活性、受体特异性、抗性等特性。
此，PDE技术可用于制备药物靶点蛋白质，有助于开发新型抗生素、癌症药物及噬菌体。
此外，PDE技术也可用于蛋白质类催化剂的开发，以及蛋白质传感器、抗原、发酵食品等的改良。
未来的发展未来的发展趋势是，蛋白质定向进化技术将进一步改进，将细菌中的蛋白质进行大规模多维度突变，进一步提高突变后蛋白质的性能。
此外，人工智能（AI）也将成为PDE技术的重要组成部分，能够大大提高PDE技术的效率。
而在生物制药中，PDE技术也有望成为一种有效的工具，以改善传统药物开发中存在的问题，提高新药研发的有效性。
总结总之，蛋白质定向进化技术可以通过模拟大自然选择和中和进化的过程，对蛋白质进行大量变异，从而获得具有更完善性能的蛋白质，并可以改进传统药物开发中存在的问题，提高新药研发的有效性，因此未来的发展前景十分可观。
蛋白质异源表达及其稳定性的定向进化
➢ 操作手段：
（１）降低氯化镁的浓度；
（２）是添加氯化锰
（３）是降低其中某一种单核苷酸的浓度或者 用核
苷酸三磷酸盐类似物替代其中一种单核苷酸
➢ 关键：选择适当的突变频率
➢ 优点：快速、简便、操作方便
➢ 缺点：它比较费力耗时,一般适用于较小的基因片段( <
800bp） 3
4
2 error-prone PCR（易错PCR）
蛋白质异源表达及其稳定性的定向进化
0 内容
1 蛋白质的定向进化 2 定向进化的方法 3 定向进化的筛选 4 蛋白质定向进化的应用前景
1
2
2 蛋白质的定向进化方法
error-prone PCR（易错PCR） DNA shuffling (DNA改组) 体外随机引发重组
2
3
2 error-prone PCR（易错PCR）
a．用单链DNA为模板，对模板量要求少，大大降低了 亲本组分，便利筛选；
b．克服了DNA shuffling中片段重新组装前必须彻底 去除DNase I的缺点；
c．片段组装体系与片段合成体系缓冲系统可兼容，组 装前无需纯化操作；
d．随机引发DNA合成不受模板DNA长度的限制，便利了 小肽的改造。
3
9
error-prone PCR
3
5
2 DNA shuffling (DNA改组)
DNA改组 ( DNA shuffling )又称有性 PCR ，是将一群密切相关的序列 ( 小片段，这 些小片段之间有部分的碱基序列重叠，它 们通过自身引导 PCR延伸，并重新组装成 全长的基因。
3
15
3 噬菌体展示筛选技术
➢噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融 合蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面，利 于蛋白酶的催化或蛋白分离
蛋白质分子定向进化简介
蛋白质分子定向进化简介作者：赖福春来源：《文理导航》2014年第02期【摘要】定向进化是改进蛋白功能与活性的有效手段，主要是在实验室里模拟自然进化过程，由易错PCR、DNA改组、随机引导重组和交错延伸技术等方法进行诱变与突变基因体外重组，设计高通量筛选方法来选出需要的突变株。
其对研究蛋白质的结构与功能的关系具有重大意义。
本文综述了定向进化技术的发展及应用。
【关键词】定向进化；易错PCR；DNA改组；筛选在20世纪80年代建立起来的新兴学科——蛋白质工程使人类可以根据已掌握的信息按照自己的意愿和需要改进蛋白质。
蛋白质工程最初的目的是：通过对蛋白质分子结构的合理设计，再通过基因工程的手段，生产出具有更高生物活性或全新的、具有独特活性的蛋白质。
但是传统的蛋白质工程方法（即合理设计）无法满足对现有蛋白质进行分子改良的要求。
面对这种情况，定向进化法逐渐受到重视。
蛋白质分子定向进化，属于蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程的新策略，是在试管中模拟达尔文进化的过程，利用分子生物学手段在分子水平创造分子的多样性，结合灵敏的筛选技术，迅速得到理想的突变体。
与合理设计相比，蛋白质定向进化在不清楚蛋白质结构的情况下，可以得到具有预期特性的新蛋白质。
蛋白质定向进化是蛋白质工程的有效手段，其应用的领域逐渐扩大，遍及工、农、医、食品等各方面。
一、定向进化的思想、概念和原理1967年Spiegelman等最先提出分子水平上的体外定向进化思想，在随后几十年，通过各国生物学家和其他各界科学家的努力，这一思想转变为现实，并融入到人类生产的领域。
定向进化是近20年发展起来的一项新技术，是达尔文的进化思想在核、肽或蛋白质等分子水平上的延伸和应用。
蛋白质定向进化是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对蛋白质基因进行改造，产生基因多样性，在结合定向筛选（或选择）技术，获得所需性能大幅提高的突变体。
定向进化是利用Taq-DNA聚合酶不具有3′→5′校对功能的性质，并结合基因工程现有技术手段，在待进化蛋白的PCR扩增反应中，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，并构建突变库。
蛋白质工程定向进化
蛋白质工程定向进化概述蛋白质工程定向进化是一种通过改变蛋白质的氨基酸序列和结构，从而创造新的功能和性质的生物技术方法。
其在药物研发、酶工程和功能蛋白设计等领域具有广泛的应用。
蛋白质工程定向进化的基本原理蛋白质工程定向进化的基本原理是通过模拟自然界中的进化过程，从大量的蛋白质变异体中筛选出具有特定功能和性质的蛋白质。
1. 构建蛋白质变异库为了利用蛋白质工程定向进化的方法，首先需要构建一个包含大量蛋白质变异体的库。
这可以通过多种方法实现，如随机突变、DNA重组和基因片段替换等。
2. 筛选和筛选条件优化构建蛋白质变异库后，需要使用适当的筛选方法和筛选条件来筛选出具有所需功能和性质的蛋白质。
筛选方法可以是高通量筛选、酶活性测定、抗体结合等。
为了提高筛选效率，还可以通过筛选条件的优化来改进筛选系统。
例如，可调节温度、pH值、盐浓度等条件，以提高筛选的灵敏度和特异性。
3. 进一步优化和改良从筛选中获得的蛋白质变异体可能仍然存在改良的空间。
这时可以通过进一步的蛋白质优化和工程来改善其性能。
常见的优化方法包括有限制性水解、点突变、插入和删除氨基酸等。
优化的目标通常是提高蛋白质的稳定性、活性和选择性。
蛋白质工程定向进化在药物研发中的应用蛋白质工程定向进化在药物研发中具有重要的应用价值。
通过改变蛋白质的结构和功能，可以获得具有更好疗效和更低副作用的药物。
1. 抗体药物定向进化可以用于提高抗体药物的亲和力和特异性。
通过对抗体的变异和选择，可以获得更好的结合亲和力和更低的非特异性结合，从而提高药物的疗效和安全性。
2. 酶替代治疗定向进化也可以用于改进酶替代治疗的效果。
通过改变酶的催化效率、稳定性和特异性，可以获得更有效的酶替代治疗药物。
3. 蛋白质药物输送蛋白质工程定向进化还可以用于改进蛋白质药物的输送系统。
通过改变蛋白质的结构和亲和性，可以实现药物的准确输送和控制释放。
蛋白质工程定向进化在酶工程中的应用蛋白质工程定向进化在酶工程中也具有广泛的应用。
蛋白质定向进化的原理及流程
蛋白质定向进化的原理及流程Protein Directed Evolution: Principles and Process.1. Introduction.Protein directed evolution (PDE) is a powerfultechnique for engineering proteins with improved or novel functions. PDE involves the iterative cycles of mutagenesis, selection, and screening to generate a population ofproteins with desired properties.2. Principles of PDE.PDE exploits the principles of natural selection to improve proteins. By introducing genetic diversity into a population of proteins, PDE creates a pool of variants that can be screened for desired functions. The variants withthe best functions are then selected for further evolution, while the less effective variants are discarded.3. Process of PDE.The general process of PDE involves the following steps:Library Generation: A library of protein variants is generated through mutagenesis. This can be achieved through methods such as error-prone PCR, gene shuffling, or site-directed mutagenesis.Selection: The protein library is screened forvariants with the desired functions. Selection methods include functional assays, binding affinity assays, or enzymatic activity assays.Amplification: The selected variants are amplified to enrich their population. This can be done through cloning, PCR, or other methods.Iteration: The cycle of mutagenesis, selection, and amplification is repeated multiple times to generate a population of proteins with improved functions.4. Applications of PDE.PDE has wide applications in protein engineering, including:Improving protein stability and solubility.Modifying protein-protein interactions.Enhancing enzymatic activity.Developing new therapeutic agents.中文回答：蛋白质定向进化，原理及流程。
蛋白质定向进化技术
蛋白质定向进化技术
DE始于上世纪70年代，最早的一个例子是进化一 DE始于上世纪70年代，最早的一个例子是进化一 个来源于大肠杆菌的 E b g A蛋白， 这个酶几乎 A蛋白， 不具备 β-半乳糖苷酶的活性。通过以乳糖为单一 碳源的平板上筛选 L a c- 缺失的大肠菌株 ，野生 c型的 E b g A就进化成为了具有 β- 半乳糖苷酶活 A就进化成为了具有 性的酶。
蛋白质定向进化技术 （DE technology of Protein）
108032008105--108032008120 108032008105--108032008120
蛋白质定向进化技术
★定义（definition） 定义（definition） ★原理（theory） 原理（theory） ★显著特征（marked features） 显著特征（mar法（methods） ★筛选方法（screening technique） 选方法（ technique） ★应用及展望（application and prospects） 应用及展望（application prospects）
蛋白质定向进化技术
频率太高，产生的绝大多数酶将失去活性；太低 ， 野生型的背景太高，样品的多样性则较少。对于 每一 D N A序列来说，合理的碱基突变数是 1-3 。 A序列来说，合理的碱基突变数是 理想的碱基置换率和易错P R的最佳条件则依赖 理想的碱基置换率和易错P C R的最佳条件则依赖 于随机突变的目标 D N A片段的长度。 A片段的长度。
蛋白质定向进化技术
当 D N A s h u f f l i n g用来重组一套进化上相 g用来重组一套进化上相 关的基因时 ，又被称为 f ami l y s h u f f l i n g 。 N I 等用 family shuffling对同源性为 7 8 . 5 ％ shuffling对同源性为 -9 6 ％ 4种白蚁的 3 O--3 O 倍。
现代酶工程-11 蛋白质定向进化技术的发展和应用
如何利用相对简单的方法 以达到对天然酶的改造或构建 新的非天然酶就显得非常有研 究意义和应用前景。 究意义和应用前景。
解决办法:蛋白质定向进化 解决办法 蛋白质定向进化
20世纪 年代末，在PCR技术出现的 世纪80年代末 世纪 年代末， 技术出现的 初期，就有人着手利用Error-prone PCR 初期，就有人着手利用 技术改造蛋白质。 技术改造蛋白质。 1994年，美国科学家 年 美国科学家Stemmer 开创了 可以在分子水平上实现家族基金内部序列 重组的新技术——DNA Shuffling，可以在 重组的新技术 ， 一个基因及其PCR诱变产物，或一组家族 诱变产物， 一个基因及其 诱变产物 基因的基础上创造新基因。 基因的基础上创造新基因。
定点突变
定点突变（site-specific mutagenesis或sitedirected mutagenesis）是指在目的DNA片断（例如： 一个基因）的指定位点上引入特定的碱基对变化的 技术。 最早的通用性定点突变技术是由M. Smith的研究 小组于1982年发明的，这种基于M13噬菌体载体的 定点突变技术可以在任意一段DNA片断的特点位点 上引入点突变。这一技术在其发明后的一段时间曾 被世界各国的研究者广泛使用。Smith后来还因为此 项研究与PCR的发明者Mullis共享了1993年的诺贝尔 化学奖。
对酶进行改造的理论基础: 对酶进行改造的理论基础: 无数的研究工作已经表明， 无数的研究工作已经表明， 酶分子内某些氨基酸残基的微小 改变可使酶的催化能力和立体选 择性产生很大的改善。 择性产生很大的改善。
遗憾的是，由于技术的限制， 遗憾的是，由于技术的限制，酶 分子中氨基酸残基与它的空间结构以 及结构—功能之间相互关系等信息严 及结构 功能之间相互关系等信息严 重匮乏，加上这些关系又非常复杂， 重匮乏，加上这些关系又非常复杂， 迄今为止， 迄今为止，人们对它们的理解和认识 仍然非常肤浅
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蛋白质分子定向进化其他方法自然界在长期的进化过程中．产生了许多具有重要功能的符合人们需要的理想蛋白质，然而，当它们处于复杂的化学反应体系时，则往往不能满足人们的需要。
为此，必须不断推出新的方法来改造现有的蛋白质，以满足工业的需要。
自然进化是有机体在长期的进化过程中自发出现的非常缓慢的过程。
自然选择往往是朝着有利于机体的方向进行的。
大量定点基因突变实验表明，蛋白质功能和性质的改变来自于许多小的内部修饰的积累，这些小的修饰或突变分布于较大的序列空间内，人们试图利用已有的结构生物学信息对蛋白质进行合理设计（rational design），但蛋白质结构的复杂性极大地增加了合理设计的难度，更何况，对于大多数要改造的蛋白质来说，我们并不清楚其三维结构信息，不能进行合理设计，而近年来发展的分子定向进化（molecular directed evolution）策略属于蛋白质的非合理设计范畴，它不需要事先了解蛋白质的三维结构信息和作用机制，而是在体外模拟自然进化的过程（随机突变、重组和选择），使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能，从而在几天或几周内实现自然界需数百万年才能完成的事情。
定向进化第一步是由一个靶基因或一群相关的家族基因起始创建分子多样性（突变和／或重组）；然后对该多样性文库的基因产物进行筛选，那些编码改进功能产物的基因被利用来继续下一轮进化；重复这个过程直到达到目标。
该进化策略有以下三个显著特征：a.进化的每一关键步骤都受到严密控制；b.除修饰改善蛋白质已有特性和功能外，还可引入一个全新的功能，来执行从不被生物体所要求的反应；甚至为生物体策划一个新的代谢途径；c.能从进化结果中探索蛋白质结构和功能的基本特征。
蛋白质定向进化通常分三步进行：基因随机诱变、体外重组和筛选。
每一步都可以有多种方法。
常见的定向进化方法有：①易错PCR技术②DNA改组技术③外显子改组④交错延伸重组⑤随机引物体外重组法（RPR）。
当然还有其他的方法，下面就来给大家一一介绍。
一、随机诱变㈠化学诱变剂介导的随机诱变体外随机诱变也可在65℃下直接用羟胺处理带有目的基因片段的质粒，然后用限制性内切酶切下突变了的基因片段，再克隆到表达载体中进行功能的筛选。
㈡由致突变菌株(mutator strain)产生随机突变美国stratagene公司构建了一株DNA修复途径缺陷的大肠杆菌突变株XLl-Red，它体内的DNA突变率比野生型高五千倍。
将带有要突变基因的质粒转化到XLl-Red菌株内复制过夜，在此过程中会产生随机突变。
每两千个碱基中通常约有一个碱基置换。
将带有突变过的基因的质粒转化到表达系统中进行筛选。
连续几代的随机突变和筛选的方法是从每一代中挑选出一个最佳的突变体作为下一代的亲本。
通过积累氨基酸的正突变，可加快进化的进程。
㈢定点突变和定点饱和突变技术定点突变技术(Site—directed mutagenesis)一般用于对DNA分子特定位点的突变，所以需要预先知道野生型基因序列。
早在1978年Michael Smith 就运用寡核苷酸进行定点突变。
定点突变的基本原理是首先合成一段含有突变碱基的DNA引物，然后这段合成的引物可以杂交到包含有目的基因的单链DNA上，用DNA聚合酶将剩余片段进行延伸，得到的双链分子转入到宿主细胞并被克隆，最后用特定的筛选方法将突变子筛选出来。
定点突变技术有盒式诱变和多种基于PCR的突变方法，最常见的有重叠PCR等方法。
当靶位点氨基酸分别可被其它19种氨基酸代替而得到突变子的方法，称为定点饱和突变技术，此方法是要着重寻求靶位点的最适氨基酸。
定点突变和定点饱和突变技术的运用，能极大地丰富突变体库的多样性。
㈣组合活性中心饱和突变试验组合活性中心饱和试验(combinatorial active．site saturation test，CAST)的基本原理是：在酶的活性中心部位寻找一系列在空间位置上相互接近的氨基酸对作为突变位点，选择的氨基酸对必须是在侧链基团取向上具有潜在的协同作用。
因此，突变后才可能获得更具有潜力的突变体。
这是单点突变不能做到的。
如果选择的氨基酸对应的位置是n，则第2个氨基酸的选择遵循以下的原则：如果第n个氨基酸在环上，则另一个氨基酸选择第n+1位；若在β折叠上则选择第n+2位，若在310螺旋上，则选择第n+3位；若在α螺旋上，则选择第n+4位。
对于CAST突变体库容量的计算：每突变一对氨基酸要进行饱和随机突变，即这一对氨基酸要突变成20种氨基酸的任何一种。
以NNK(N代表任何一种核苷酸，K代表是G或T)作为突变的碱基形式，则有322=1 024种不同的组合，而氨基酸则可突变成202=400种不同的组合。
因此，要将每个库的所有突变的覆盖率达到95％，则每个库至少要挑3000个克隆子。
此外，近年来还发展出了更多的、新颖的无性突变技术。
例如，三核苷酸突变(TriNex)，随机插入-删除突变(RID)，序列饱和突变(SeSaM)以及它的改进方法SeSaM—Tv+。
这些方法都是为了能最大程度的增强突变体库的多样性，丰富并延伸无性突变的方法手段。
二、基因体外重组㈠限制性酶切-再连接介导的基因重组(recombining the genes by restriction and religation)利用限制性内切酶对欲重组的两个以上DNA序列进行酶切，然后在连接酶的作用下随机重新连接起来，可实现DNA分子问的重组。
实验证明，简单的酶切-再连接可进一步提高对硝基苯酯酶的活性。
但如果两个正突变处于同一段限制性酶切片段上，则无法将它们重组于同一序列中。
㈡基因家族改组在基因改组的基础上，1998年由Crameri等提出了基因家族改组技术(DNA family shuffling)，至此才是真正的有性重组的开始。
基因家族改组与单基因改组最大的区别在于出发序列的同源性。
利用基因家族同源序列进行DNA改组，实现同源重组。
由于同源序列是经过自然选择保留下来的相对有益或无害的片段，所以基因家族改组的突变机率和改组效率明显提高，体现了基因的多样性。
㈢过渡模板随机嵌合生长过渡模板随机嵌合生长（random chimeragenesis on transient templates，RACHITT）技术是与DNA shuffling概念上明显不同的、改进的基因家族重组技术。
它不包括热循环、链转移或交错延伸反应，而是将随机切割的基因片段杂交到一个临时DNA模板上进行排序、修剪、空隙填补和连接（图2）。
其中的悬垂切割步骤使短片段（比DNase消化片段还短）得以重组，明显提高了重组频率；如果在片段重组前后采用错误倾向PCR还可引入额外点突变。
CoCo等首次报道此法改造二苯并噻吩单加氧酶，产生的嵌合文库平均每个基因含14个交叉，重组水平比DNA shuffling类方法（1~4个交叉）高出几倍；并且可在短至5bp的序列同一区内产生交叉。
这种高频率、高密度的交叉水平是DNA shuffling所难以达到的。
㈣酵母增强组合文库酵母增强组合文库（combinatorial libraries enhanced by recombination in yeast，CLERY）是一个真核基因家族shuffling策略。
其原理是将体外DNA shuffling程序与接下来的酵母体内重组缔合起来，构建高丰度低亲本水平的重组文库：直接以含目的基因的质粒作为体外shuffling的模板；shuffling后基因产物与线性化的酵母表达载体共转化酵母细胞启动体内重组事件，同时表达功能性重组子直接用于筛选。
Truan等用该法重组人细胞色素P450 1A1和1A2，所得文库含86%的嵌合基因，大大提高了文库丰度；另外，用单链DNA做shuffling的模板可进一步降低文库中的亲本比率。
该法为蛋白质结构／功能研究、多组分真核复合酶活力的调控提供了一个新的有力工具。
㈤渐增切割法产生杂和酶尽管DNA shuffling介导的重组已成为定向进化创建高质量序列多样性的重要工具，但它们通常不能用于重组同源性低于70%~80%的序列。
而自然界大多数同源序列具有比这个数目低得多的相似性。
为了解决这个问题，Benkovic研究组建立了渐增切割法产生杂和酶（incremental truncation for the creation of hybrid enzymes，ITCHY）及Thio-ITCHY（α-硫代磷酸核苷酸介导的ITCHY）方法来产生不依赖于DNA序列同源性的重组文库。
ITCHY的基本原理是：控制核酸外切酶#的切割速度不大于10碱基／min，然后间隔很短时间连续取样终止反应，以获得一组依次有一个碱基缺失的片段库；然后将基因A的一组随机长度的5’端片段与基因B的一组随机长度的3’端片段随机融合产生杂合基因文库。
但由于该方案冗长繁琐，Lutz等又提出了Thio-ITCHY方法：首先将待PCR反应或单链模板引伸反应将α-硫代磷酸核苷酸随机引入产物中，由于其抗核酸外切酶Ⅲ的切割，接下来的切割反应会在此处随机终止，连接切割产物即产生随机交叉文库.该法操作便利，同时也可引入随机点突变。
此外，ITCHY/Thio-ITCHY不依赖DNA序列同源性，可在非序列同一区内产生活性融合子。
迭代ITCHY或对其文库进行shuffling还可以创造多个交叉。
㈥不依赖序列同源性的蛋白质重组尽管上述ITCHY可以进行不依赖于序列同源性的重组，但它是一个随机长度片段与另一个随机长度片段相融合，结果文库中基因长度不再保守，子代中功能杂合子的比率很低。
要想提高功能杂合子所占比例，须使交叉发生在具有相似结构环境的位置，但由于缺乏足够的序列相似性，同源重组不能发挥作用，因此Sieber等提出了不依赖序列同源性的蛋白质重组（sequencehomology-independent protein recombination，SHIPREC）方法：通过琼脂糖凝胶电泳回收单基因长度随机片段，保证了子代嵌合体长度的保守性，使交叉保持了适当的序列匹配，主要发生在结构上相关的位点，交叉点处的两个氨基酸仍处于它们在亲本蛋白质结构中的位置，从而提高了文库中阳性克隆的比例。
该法可以在低序列同一性甚至无序列同一性的同源蛋白质间创造具有单交叉的杂合蛋白质组合文库。
迭代SHIPREC可以产生多个交叉。
随着酶分子定向进化的发展，在常规的定向进化方法的基础上，又相继开发出另一些新方法，如设计的寡核苷酸装配(assembly of designed oligonucleotides，ADO)、诱变和单向重组(mutagenic and unidirectional reassembly，MURA)、随机插入-删除链交换突变(random insertional deletional strand exchange mutagenesis，RAISE)、基于Y连接的构件改组(Y-ligation-based block shuffling，YLBS)、合成改组(synthetic shuffling)等新方法都有改造蛋白的成功案例，也为更好的进行定向进化提供了强有力的工具和指导思想。