第四章植物组织培养技术

• 移栽小植株还应注意光、温控制。
• 移栽初期光照强度应较弱，经过一段时间适应后，增 加光照强度（漫射），如1 500～4 000 lx，甚至10000 lx。
• 移栽小植株生长所需的适宜温度与植物种类有关，喜 温性植物以25℃左右为宜，喜凉性植物则以18～20℃ 为好。温度过高导致蒸腾作用加强，水分失衡，微生 物滋生等；温度过低则使幼苗生长迟缓或不易存活。 如使基质温度高于空气温度2～3℃，则有利于生根和 促进根系发育，提高存活率。
•（一）短枝发生型（不定芽型）
短枝发生型是指外植体携带的带叶茎段，在适 宜的培养环境中萌发，形成完整植株，再将其剪成 带叶茎段，继代再成苗的繁殖方法。
•特点： •①繁殖率高，利用外植体的 芽特别是原受到抑制的腋芽 和大量形成不定芽。 •②能保持该种植物遗传稳定 性。 •③可使繁殖周期长的林木缩 短其童年期
•特点： •①繁殖率非常 高，但繁殖速 度较慢。 •②遗传性稳定。
（三）器官发生型（已讲过）
是指外植体在适宜培养基和培养条件下，经过脱分化形成愈 伤组织，然后经过再分化诱导愈伤组织产生不定芽，或外植 体不形成愈伤组织而直接从其表面形成不定芽，将芽苗转移 到生根培养基中，经培养获得完整植株的繁殖方法。
3.产品质量监控
•
如接种状况、污染率、生长情况、
生根苗数量、出瓶苗质量等，并建立试
管苗出瓶标准。
4.商业化生产效益分析 通过成本核算可以了解：①生产过程中的
各种消耗；②管理工作的质量；③各项技术措 施的效果；④产品价格的制定标准。
•
试管苗商业化的生产成本应包括：
• ①人工费用。
• ②生产物资费用。
一、无菌培养的建立
这个阶段的任务是母株和外植体的选取、 无菌培养物的获得及外植体的启动生长，以利于 离体材料在适宜培养环境中以某种器官发生类型 进行增殖。
二、增殖培养
1.培养材料的增殖方式 五种方式。(取决于培养目的和材料自身的可
能性。) 一般大多数植物采用无菌短枝或腋芽萌发或诱
导不定芽产生，再以芽繁殖芽的方式进行增殖；兰 科植物、百合等则采用原球茎增殖途径，以保障繁 殖材料的遗传稳定性。
• 表现嵌合性状的植株通过此方式再生时，往往导致嵌合性 状发生分离而失去原有价值。如观赏植物色彩镶嵌的叶子、 带金边或者银边等性状的植物，通过器官发生性途径再生 植株时，可能导致这些观赏性状消失。这类植株快繁时， 应通过丛生芽途径进行。
•A
•B
•C
•E
•花烛叶片离体培养及植株再生
•（四）胚状体发生型
2.增殖培养基
增殖率是植株快速繁殖特别是商业性繁殖的重要 指标。外植体在每次继代培养中，应能产生最大数量 的有效繁殖体。
基本培养基一般与启动生长培养基相同，而细胞 分裂素和矿物元素的浓度水平则高于启动生长培养基。 一般MS+BA 1~3 mg/ml+NAA0.1~1 mg/ml。
3.增殖体的大小和切割方法 一般携带一个茎节，但第一次增殖的茎段一般
IV 植物快繁的商业化应用
植物快繁最重要的用途是进行植物的商业化生产。 世界上快繁商业化开始于上个世纪美国的兰花工 业。我国的香蕉快繁苗占全国组培苗的2/3。其次 有甘蔗、兰花、马铃薯、甘薯等。
•园艺植物种苗工厂化生产
一、商业化生产规模及工艺流程
1.试管苗生产规模的确定 商业化生产规模的确定应以市场需求为标准。 试管苗生产规模的确• 定是以无菌工作台和培养
液体培养要求振荡培养，促进氧气交换。
四、继代培养
• 主要指对阶段Ⅱ增殖形成的芽丛、胚状体或原球 茎等进行转接继代。继代间隔时间一般为20天左 右。
五、移栽
• 根系结构不完善的试管苗移栽后不易存活。要求根 系结构完整，具根毛，再生根的吸收能力强。 • 叶表皮组织不发达的试管苗也不易移栽存活。移栽 要求打开瓶口驯化2-3天；或在瓶内添加一些生长延 缓剂如PP333、CCC等培育壮苗。
•菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观 察
（五）原球茎发生型
原球茎发生型是兰科植物的一种快繁方式， 它是指茎尖或腋芽外植体经培养产生原球茎（即 扁球状体、基部生假根）的繁殖类型。
• 原球茎是兰花种子发芽过程中的一种形态学构造。种子萌发初期并不出 现胚根，只是胚逐渐膨大，以后种皮的一端破裂，肿胀的胚呈小圆锥状， 故称为原球茎。
胚状体发生型是指外植体在适宜培养环境中，经 诱导产生体细胞胚的繁殖方法 ，从而形成小植株的繁 殖方法。
分为间接途径（经愈伤途径）和直接途径两种。 胚状体发生途径具有成苗数量大、速度快、结构 完整的特点，因而是外植体增殖系数最大的途径。
胚状体发生型 特点：①胚状体发生数量多、速度快、结构完整、 繁殖系数高。②遗传性稳定
• （2）增殖率的实际值是指接种一个芽或一个苗，经过实际 繁殖周期，得到的实际芽或苗数。
• 实际增殖数与理论增殖数出现很大差异的原因是： • ①污染淘汰；②出售、转让和实验所用； • ③移栽死亡；④培养容器等设备的限制。
2.生产计划的制定和实施
（1）生产计划的制定
商业化生产计划制定的依据是市场对试管 苗的种类、品种及数量的需求及趋势，实验室 具备的生产条件和规模。首先应提出全年销售 目标，再根据实际生产中各个环节的消耗，制 定出相应的全年生产计划，一般生产数量应比 计划销售的数量增加20％～30％。
• 此外，在移栽小植株的驯化管理阶段，还应防止菌 类滋生，适当喷一定浓度的杀菌剂（杀菌灵）可有 效保护移栽小植株的正常生长。
III 影响植物快繁的因素
植物快繁的目的是以尽可能高的效率生 产试管苗，获得最大的经济效益。因此， 在快繁时应使各种影响因素处于最适合快 繁的状态。
一、外植体
• 外植体的来源：最适的为茎尖、带芽茎段，也可 以利用叶片、子叶、根段、花器官组织等。
（2）生产计划的实施 生产计划实施的步骤为：①准备繁殖材料。②合
格繁殖材料的快速增殖。 存瓶增殖总瓶数＝月计划生产苗数／每个增殖瓶月
可产苗数 月计划生产苗数＝每个操作人员每天可接苗数×月
工作日×人员数 控制试管苗生产中的增殖总瓶数，便于在一个周
期内全部更新一次培养基，使增殖材料处于不同生长 阶段的最佳状态，提高其质量。
• 培养基的物理特性：以固体培养较为普遍，也有采 用液体培养，如兰花原球茎的增殖。
三、培养条件
• 光照：1000-3000lx，后期可增强。14-16h/d。 • 温度：与植物的原产地相应。一般为25±2℃。有时可
进行高温或低温的预处理。 • 湿度：要求环境相对湿度不能太低，一般在70-80%。 • 气体：要求培养基及培养瓶通气良好，同时及时转接。
四、移栽驯化
试管小植株的移栽驯化是试管苗从异养到自 养的转变，有一个逐渐适应过程。移栽前需对试 管植株进行高光强炼苗，使植株生长粗壮，并打 开瓶口，降低湿度，使其逐渐适应外界环境。 • 1.移栽 • 2.驯化管理
１.移栽
• 首先应洗去小植株根部附着的培养基，避免微生物 的繁殖污染，造成小苗死亡。
3.商业化生产的配套设施
相应配套设施包括过渡培养室和露地炼苗场。
4.商业化生产的工艺流程
试管苗商业化生产的工艺流程是以其快繁程 序为基础建立起来的，如最成熟的草莓脱毒苗生产 流程和葡萄试管快繁流程。通过茎尖脱毒建立起来 的草莓商业化试管苗生产，除必须配备的培养和驯 化等条件外，还应增加病毒鉴定室。
都有2~4个茎节。 茎段可以垂直插入培养基中，但插入的深度不
应淹没茎节；或水平放入培养基表面，以刺激侧芽 的萌动。
•
青花菜增殖
•
枇杷增殖
三、芽苗生根
将单个芽苗转移到生根培养基或适宜环境中诱导生根。
1.离体生根（试管内生根）
降低无机盐浓度（1/2MS或者1/4MS），减少或不需 要细胞分裂素，增加生长素的浓度。
04第四章植物组织培养 技术
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2020/11/28
第四章植物组织培养技术
•I概述 •一、概念和特点
•（一）概念
• 植物离体繁殖（propagation in vitro）又称植 物快繁或微繁，是指利用植物组织培养技术对外植 体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大 量再生植株的方法。
架的数量来衡量的。年产100万株，接种室40~50m2， 超净工作台8~10台，培养室100-120m2 。
2.商业化实验室的设计 根据已确定的生产规模和组织培养的生产程
序，试管苗生产的实验室应尽量布局合理，使生产 程序能连续、有效地进行。
•（1）环境要求远离污染源 （2）水电、交通 （3） 工艺流程 （4）节能（5）无菌
二、商业化生产及效益分析
1.试管苗增殖率的估算
试管苗的增殖率多数以芽或苗为单位，但原球茎或胚状 体多以瓶为单位。 （1）增殖率的理论值是指接种一个芽或一块增殖培养物，经 过一段时间培养后得到的芽或苗数。
•Y=mXn （Y—年繁殖数，m—无菌母株苗数，X—每个培 养周期增殖的倍数，n—全年可增殖的周期数）
• 原球茎是短缩的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官， 它可以增殖，形成原球茎丛。由茎尖或腋芽外植体诱导产生原球茎，切 割原球茎进行增殖，或停止切割使其继续培养而转绿，产生毛状假根， 叶原基发育成幼叶，将其转移培养生根，形成完整植株。
II植物快繁程序
植物快繁的程序包括四个阶段： –无菌（或初代）培养的建立 –繁殖体增殖 –芽苗生根 –小植株的移栽驯化
• 外植体生理年龄：幼嫩组织分化能力更强。 • 外植体大小：不能太小，否则影响成活率。除非
是用于脱毒苗的生产。
二、培养基
• 基本培养基：MS培养基应用最为广泛。对于某些 植物及生根阶段，以1/4或1/2MS较好。蔗糖和葡 萄糖浓度为2-4%。生根时稍低。
• 植物生长调节剂：主要以细胞分裂素和生长素的配 合使用，调节外植体的生长和分化。另外ABA、 GA、CCC等也具有不同的作用。
对有些植物，如果芽苗在含有生长素的培养基中生长 1～2d，再转移至无生长素的培养基中，或芽苗在含生长素 的生根溶液中浸蘸后直接插入无生长素的培养基中，湿度 85%以上，温度25℃，弱光或黑暗条件。
2.活体生根（试管外生根）
芽苗先在生长素中快速浸蘸或在含有相对高浓 度生长素的培养基中培养5~10天，然后在温室中栽 入培养基质，经常喷雾，给予高湿度环境，几天后 便可自行生根。
• ③设备折旧费用。
•（二）特点
• 1、繁殖效率高。 • 2、培养条件可控性强。 • 3、占用空间小。 • 4、管理方便，利于自动化控制。 • 5、便于种质保存和交换。
•二、植物快繁器官形成方式（再分化形成植 株的方式）
•根据器官形成方式的不同，将植物器官的 再生分为五种类型，即短枝发生型（不定 芽型）、丛生芽发生型（器官型）、器官 发生性、胚状体发生型和原球茎发生型。
（二）丛生芽发生型(器官型)
丛生芽发生型是指使外植体携带的顶芽或 腋芽在适宜培养环境中不断发生腋芽而呈丛生状 芽，或者直接从外植体上长出多个从芽，将单个 芽转入生根培养基中，诱导生根成苗的繁殖方法。
丛生芽发生型是大多数植物快繁的主要途 径，它不经过愈伤组织，能使无性系后代保持原 品种的特性，在生产中普遍应用。
①繁殖速度较快。②遗传性不稳定，已产生变异。③愈伤组织 是遗传转化、细胞培养或原生质体培养的良好材料
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第四章植物组织培养技术
• 器官发生型也是许多植物快繁的主要方式。由于不 定芽形成的数量与腋芽数目无关，其增殖率高于丛 生芽发生型。
• 但经过愈伤组织途径或者多次继代培养后，容易导 致细胞分裂不正常，增加变异植株发生频率。如香 蕉继代次数控制在8代之内，再生植株的变异率则 可控制在3%左右。
• 然后将小植株栽入人工配制的混合培养基质中，基 质用保湿又透气的材料，如蛭石、珍珠岩、粗沙、 泥炭等按比例混合，以利小植株生长。几天后小植 株可形成新的功能根系。
2.驯化管理
• 移栽的试管小植株和活体生根的小植株，其湿度的 控制十分重要。因试管苗在高湿（90％～10பைடு நூலகம்％的 相对湿度）环境中生长，茎叶表面防止水分散失的 角质层等几乎全无，根系又不发达，移栽后难以保 证水分平衡，即使根系周围有足够的水分也不行。 所以，应采用加覆塑料薄膜、经常喷雾的方法，提 高小植株周围的空气湿度，减少叶面蒸腾。同时， 逐渐降低空气相对湿度，使其适应自然环境条件。