微生物诱变育种
微生物菌种的选育和保藏--诱变育种
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢诱变处理： ➢诱变剂的处理方式： ✔单因子处理：采用单一诱变剂处理出发菌株； ✔复合因子处理：两种以上诱变因子共同诱发菌体突变，包括①两种或多种 诱变剂先后使用；②同一种诱变剂的重复使用；③两种或多种诱变剂的同时使用。 ➢诱变剂的处理方法： ✔直接处理方法：将菌悬液用物理、化学因子处理，然后涂平板分离突变株； ✔生长过程处理法：适用于诱变作用强而杀菌率较低的诱变剂，或在分裂过 程中只对DNA起作用的诱变剂，如NTG、LiCl、 秋水仙碱等；方法：可将诱变剂 加入培养基后涂平板；或先把培养基制成平板，将一定浓度的诱变剂和菌体加入平 板； 或摇瓶振荡培养处理；
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 制备单孢子(或单细胞)悬液： ➢ 目的：获得单孢子(或单细胞)均匀的悬液；
➢ 原因: 分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落；
➢ 方法:✔菌龄:对数期细胞、刚成熟的孢子母菌细胞悬浮液的浓度为106个/mL、
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 突变株的分离与筛选： ➢ 筛选方案:
➢ 筛选方法： ✔初筛：a.随机筛选：也称摇瓶筛选；随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛选； b.平板菌落预筛：在培养皿上诱变后从试样检出突变体的一种
琼脂平板筛选法,有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等; ✔复筛:对突变株的生产性能作比较精确的定量测定工作，代表方法：琼脂
放线 菌或细菌的浓度为108个/ mL左右;
✔菌悬液配制方法:离心洗涤前培养物，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬 液，放在盛有玻璃珠的三角瓶内振荡10min,令其分散，用无菌脱脂棉或滤纸过滤。 通过菌体计数，调整菌悬液的浓度供诱变处理。
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 诱变处理： ➢ 诱变剂种类的选择：物理诱变剂和化学诱变剂 ✔物理诱变剂：紫外线、χ射线、γ射线、等离子、快中子、ɑ射线、β射线、 超声波等； ✔化学诱变剂: 碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等； ➢ 最适诱变剂量选择： ✔诱变剂剂量表示方式：a.UV的剂量指强度与作用时间的乘积； b.化学诱变剂剂量：诱变剂的浓度和作用 时间的乘 积来表示； c.在育种实践中，常以杀菌率来作诱变剂 的相对剂量； ✔最适诱变剂量确定：a.依据：最适剂量应该使所希望得到的突变株在存活 群体中占有最大的比例； b.方法：通过比较剂量--存活率曲线和剂量-
第五章 工业微生物诱变育种
株时，应选择多种遗传类型的菌株作为出发菌株比较
稳妥，容易在较短时期内达到育种目的。
8. 菌种代谢特点
了解菌种代谢特点有助于选择有效的出发菌株。 有人曾研究过肌苷酸产生菌的代谢特性，发现肌苷 酸的生物合成过程与肌苷、肌苷酸及核苷酸、磷酸 化酶的活性有关，如果从产生肌苷酸野生型的枯草 杆菌中筛选到降解酶活性低而磷酸化酶活性强的作 为诱变出发菌株，一般都能得到良好的诱变效果。
6. 药品和原材料质量
药品规格和原材料来源不同，都会影响菌种的质量。
四、了解菌种有效产物中的 各种组分在代谢 合成过程中与培养条件的关系
由棘孢小单孢菌(Micromonospora echinopora) 产生的庆大霉素，其中C1是有效的组分； C2是无效
的。在发酵过程中加入适量的磷或蛋白胨以及加大 通 风量都有利于C1的合成；反之，C2的比例就上升。
菌悬液由出发菌株的孢子或菌体细胞与生理盐水或 缓冲液制备而成。对菌悬液的制备有如下的要求：
1、供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮。
细胞要新培养的，细胞生理活性方面既要同步， 又要处在最旺盛的对数期，这样突变率高，重现性也 好。 霉菌孢子浓度约为：106ml-1，放线菌孢子浓度约 为：106~107ml-1。菌悬液通常采用生理盐水制备。如 果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制， 以防处理过程中pH变化而影响诱变效果。
1. 对一般出发菌株的要求
（1）从自然界样品中分离筛选出来的野生菌株，虽 然产量较低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，
正突变率高；
（2）在生产中使用的，具有一定生产能力，并且在 生产过程经过自然选育的菌株； （3）采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营 养要求低以及产生孢子早而多的菌株；
微生物诱变育种的基本过程
微生物诱变育种的基本过程
一、筛选目的菌株
在开始微生物诱变育种之前，首先要确定育种的目标，并从中筛选出具有潜在优良性状的目的菌株。
这一步通常需要利用各种生理生化实验和分子生物学技术，对大量菌株进行初步的筛选和鉴定。
二、诱变处理
在确定了目的菌株之后，接下来需要进行诱变处理。
诱变处理通常包括化学诱变和物理诱变两种方式。
化学诱变使用化学诱变剂处理菌株，而物理诱变则利用物理因素（如紫外线、X射线、中子等）处理菌株。
这些诱变因素可以引起菌株基因的突变，进而产生新的性状。
三、突变体的筛选
经过诱变处理后，大量菌株中会存在各种突变体。
为了获得具有优良性状的目标突变体，需要进行筛选。
这一步通常采用各种筛选方法，如单菌落挑取法、稀释涂布平板法等，将突变体从大量菌株中分离出来。
同时，需要通过各种生理生化实验和分子生物学技术，对突变体的性状进行鉴定和筛选。
四、遗传稳定性检测
在筛选出目标突变体后，需要对其遗传稳定性进行检测。
遗传稳定性是指突变体在繁殖过程中，是否能够保持其优良性状的稳定性。
这一步通常采用连续繁殖法和稳定性测定法等方法进行检测，以保证突变体的优良性状能够在后代中得到保留。
五、生产能力测定
最后一步是测定突变体的生产能力。
生产能力是指突变体在实际生产过程中，能否产生足够的产物并保持稳定的产量。
这一步通常采用发酵实验和产物分离纯化等方法进行测定，以保证突变体在实际生产中具有实用价值。
食品微生物诱变育种的步骤
食品微生物诱变育种的步骤引言：食品微生物诱变育种是一种利用诱变技术改良食品微生物的方法，通过诱发微生物的遗传变异，以获得具有理想特性的菌株。
本文将介绍食品微生物诱变育种的步骤，包括诱变剂的选择、诱变条件的优化、筛选和鉴定等。
一、诱变剂的选择诱变剂是诱发微生物遗传变异的关键因素，不同的诱变剂对微生物的诱变效果有所差异。
在选择诱变剂时，需要考虑到其毒性、稳定性和诱变效果等因素。
常用的诱变剂包括化学诱变剂（如亚硝酸盐、亚硝酸钠）、物理诱变剂（如紫外线、γ射线）和基因工程诱变剂（如转座子）等。
根据具体的需求和实验条件，选择适合的诱变剂进行实验。
二、诱变条件的优化诱变条件的优化对于提高诱变效果至关重要。
诱变条件包括诱变剂的浓度、处理时间和处理温度等。
在进行诱变实验时，需要通过一系列的试验确定最佳的诱变条件。
例如，可以通过改变诱变剂的浓度和处理时间，观察微生物的生长情况和遗传变异率，以确定最佳的诱变条件。
三、诱变实验的进行在确定了诱变剂和诱变条件后，可以进行诱变实验。
诱变实验的步骤包括：将待诱变的微生物培养物接种到含有诱变剂的培养基中，经过一定的处理时间后，将处理后的培养物进行稀释和分装，接种到含有适宜营养物和选择压力的培养基中，培养一定时间后进行筛选。
四、筛选和鉴定筛选是诱变育种中非常重要的一步，通过筛选可以从大量的诱变菌株中筛选出具有理想特性的菌株。
筛选的方法多种多样，可以根据具体的需求选择合适的筛选方法。
常用的筛选方法包括抗性筛选、代谢产物筛选和遗传标记筛选等。
通过筛选后，还需要对筛选出的菌株进行鉴定，确认其遗传变异的性质和稳定性。
结论：食品微生物诱变育种是一种有效的改良微生物的方法，通过诱发微生物的遗传变异，可以获得具有理想特性的菌株。
在进行食品微生物诱变育种时，需要选择适合的诱变剂，优化诱变条件，进行诱变实验，并通过筛选和鉴定确认诱变菌株的特性。
这些步骤的合理操作和科学设计，将为食品微生物的改良和应用提供有力支持。
第七章工业微生物诱变育种
丝状菌孢子壁较厚，表面蜡质也会阻碍诱变剂渗入。 或需用洗衣粉、脂肪酶、表面活性剂等处理去除蜡质。
（三）环境条件的影响
1、诱变前预培养和诱变后培养
预培养：培养基中加入咖啡因、蛋白胨、酵母膏、
吖啶黄、b－重氮尿嘧啶、嘌呤等物质能提高突变率。
后培养：诱变后的菌悬液不直接分离于平板，而是
立即转移到营养丰富的培养基中培养数代。作用是 让突变体重新调节代谢平衡，避免突变体表型延迟 现象。
五、快速准确的检测方法
建立一个适应于大规模筛选的有效检测方法是减少 诱变选育工作量的关键。
分光光度法 液相色谱法 气相色谱法
化学滴定法 薄层层析法
六、最佳的菌种保藏方法
事先要建立一个最佳的培养基、培养条件和适 宜的保藏方法，否则将前功尽弃。
第二节 诱变育种的步骤与方法
诱变育种的优缺点 优点：方法简单、投资少、收获大； 缺点：缺乏定向性。
4、浓度梯度法
合成抗生素的水平与其耐自身产物能力相关。
5、应用复印技术快速筛选变株
产脂野生株、具有高脂含量的突变株。 方法：筛选培养基→ 复印→ 苏丹黑染色→洗去 多余染料→酒精脱色→干燥显色→选择深蓝色或紫 色的菌落。
6、琼脂块大通量筛选变株
适用对象：抗生素、酶类产物。 优点：效率提高15-20倍。 缺点：产物浓度高时易漏筛，培养条件与发酵条件
细菌：生长指数期，最好在诱变处理前进行摇瓶 振荡预培养，尽可能获得同步培养物。
某些不产孢子的真菌：菌丝体，最好采用年幼的 菌丝体进行诱变处理。获得的方法：菌丝尖端法、 处理单菌落周围尖端菌丝法和混合处理法。
菌丝尖端法
枯草杆菌黑色变种芽孢菌悬液：试验菌液用2%蛋 白胨配成3-4×105个/mL浓度共50ml。
微生物的诱变育种
（五）突变株的筛选
1. 初筛（以量为主） 初筛（以量为主） 方法需简便、快速
2步 步
初筛 复筛
（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性 利用形态变异： （2）根据平板颜色反应直接挑选 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 抑菌圈法（抗生素）； 抑菌圈法（抗生素）； 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）； ）、显色圈 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）； 沉淀圈法（外毒素） 沉淀圈法（外毒素） 透明圈直径（ 透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标） 菌落直径（ ）：产量高低（初筛指标） 产量高低 2. 复筛（以质为主，定量测定） 摇瓶培养，直接检测所需产物 复筛（以质为主，定量测定） 摇瓶培养，
诱变育种的基本原则： 诱变育种的基本原则：
选择简便有效的诱变剂； 选择简便有效的诱变剂； 挑选优良的出发菌株； 挑选优良的出发菌株； 处理单细胞或单孢子悬液； 处理单细胞或单孢子悬液； 选用最适的诱变剂量； 选用最适的诱变剂量； 充分利用复合处理的协同效应； 充分利用复合处理的协同效应； 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标； 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标； 设计高效筛选方案； 设计高效筛选方案； 创造新型筛选方法。 创造新型筛选方法。
（2）筛选步骤（5步） ）筛选步骤（ 步
诱变处理 中间培养 淘汰野生型 检出缺陷型 鉴定缺陷型
①中间培养 ②淘汰野生型
CM或SM培养基，培养过夜 克服表型延迟 克服表型延迟。 CM或SM培养基，培养过夜。克服表型延迟。 培养基 即浓缩缺陷型， 即浓缩缺陷型，以提高检出率
抗生素法（ 细菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素） 方法 抗生素法（G+细菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素） 菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌） 菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌） 饥饿培养（ 饥饿培养（无N）MM 6~12 h 12 2N培养(2N)MM 2N培养(2N)MM 培养(2 1~2 h 2 加抗生素(或菌丝过滤) 加抗生素(或菌丝过滤)，培养过夜
微生物遗传育种名词解释（二）
微⽣物遗传育种名词解释（⼆）1、⾃然选育：从⾃然界直接分离和筛选菌种或在⽣产中利⽤⾃发突变选育优良菌株。
2、诱变育种：对出发菌株进⾏诱变，然后运⽤合理的程序与⽅法筛选符合要求的优良菌株。
3、代谢调控育种：利⽤现有的代谢调控知识，筛选特定突变型，改变代谢流量或流向，从⽽提⾼⽬的产物产量的⼀种育种技术。
4、重组育种；利⽤微⽣物间的遗传重组来改变其遗传物质组成及结构的⼯业微⽣物育种技术。
5、原⽣质体融合育种；通过⼈为⽅法，使遗传性状不同的两细胞的原⽣质体发⽣融合，从⽽实现遗传重组的⼯业微⽣物育种技术。
6、基因⼯程育种技术：在体外构建重组DNA分⼦并导⼊宿主内⾼效表达，从⽽获得重组微⽣物的育种技术。
7、突变：遗传物质核酸中的核苷酸序列发⽣了稳定的可遗传的变化。
8、突变体：带有突变基因的细胞或个体9、突变型：突变体的基因型或表型称为突变型，和其相对的原存在状态称为野⽣型。
10、⾃发突变（spontaneous mutagenesis）：未经任何⼈为处理⽽⾃然发⽣的突变；11、诱发突变（induced mutagenesis）：由⼈们有意识地利⽤物理或化学⼿段对⽣物体进⾏处理⽽引起的突变。
12、整倍体：含有完整的染⾊体组。
13、⾮整倍体：含有不完整状态的染⾊体组，⼀般是指⼆倍体中成对染⾊体成员的增加或减少。
14、部分⼆倍体：原核⽣物中由⼀整条染⾊体和外来染⾊体⽚段所构成的不完整⼆倍体。
增变基因（mutator gene）：其基因突变会导致整个基因组的突变频率明显上升的⼀些基因。
15、前突变：诱变剂所造成的DNA分⼦某⼀位置的损伤16、光复活：指细菌在紫外线照射后⽴即⽤可见光照射，可以显著地增加细菌的存活率，降低突变率。
17、表型延迟phenotype lag：突变体表型改变落后于其基因型改变的现象。
18、分离性延迟segregational lag ：突变基因由杂合状态到纯合状态所造成的表型迟延19、⽣理性延迟physiological lag ：由于基因产物的“稀释”过程所造成的表型迟延野⽣型（wild type）：从⾃然界分离到的任何微⽣物在其发⽣营养缺陷突变前的原始菌株；基因重组：由于不同DNA链的断裂和连接⽽产⽣DNA⽚段的交换和重新组合，形成新的DNA分⼦，进⽽形成新遗传个体的⽅式称为基因重组。
微生物 诱变育种
紫外损伤的光复活作用
DNA损伤的修复
切补修复 切补修复是在内切核酸酶、
外切核酸酶、DNA聚合酶以及 连接酶的协同作用下将嘧啶 二聚体酶切除去，继而重新 合成一段正常的DNA链以填补 酶切所留下的缺口，使损伤 的DNA分子恢复正常的修复方 式。由于整个过程不依赖于 可见光，所以切补修复也称 暗修复。切补修复几乎存在 于所有的微生物中。
也可用长了菌落的平板直接照射。 一般照射剂量4~10万伦琴。
此外还能引起染色体畸变，即因 染色体断裂引起染色体的倒位、 缺损和重组等。但发生了染色体
断裂的细胞常常不稳定。
化学诱变因素
化学诱变剂用量很少，诱变时设
备简单，只要一般实验室的玻璃 器皿就行，所以其应用发展较快。
碱基类似物
碱基类似物是指与DNA结构中的四种碱基 A、T、G、C在化学结构上相似的一类物 质。如5-溴尿嘧啶（BU）和5-溴脱氧尿
紫外损伤的切补修复
紫外线照射的操作方法
在暗室中安装的15瓦紫外线灯管最 好装有稳压装置，以求剂量稳定。
处理时，可将5毫升菌悬液放在直径 5厘米的培养皿中，置磁力搅拌器上， 使培养皿底部离灯管30厘米左右， 培养皿底要放平，处理前应先开灯 20~30分钟预热稳定。照射时启动磁 力搅拌器，以求照射均匀。
诱变育种
第一节基因突变
突变泛指细胞内（或病毒颗粒 内）的遗传物质的分子结构或 数量突然发生的可遗传的变化。
突变往往导致产生新的等位基 因及新的表现型。狭义的突变 专指基因突变，也称点突变， 而广义的突变则包括基因突变 和染色体畸变。
突变的几率一般很低，约为106~10-9。
突变是工业微生物产生变种 的根源，是育种的基础，但 也是菌种发生退化的主要原 因。
微生物诱变育种的方法
微生物诱变育种的方法微生物，这小小的生物世界里的居民，有着大大的能量。
而诱变育种呢，就像是给微生物来一场奇妙的变身之旅。
物理诱变是一种常见的法子。
紫外线就像是微生物世界的严厉教官。
微生物们在紫外线的照射下，就如同小士兵接受艰苦的训练。
紫外线那强烈的能量，会打乱微生物内部的基因结构。
比如说一些细菌，原本规规矩矩地按照自己的基因蓝图进行生长繁殖，紫外线一照，就像打乱了建筑图纸一样，基因里的一些部分发生了错乱。
有的微生物在这错乱中就产生了新的特性，也许原本不会产生某种特殊酶的，经过紫外线照射后就有了这种能力。
还有X射线，这可是更厉害的家伙。
如果把微生物比作是一个精密的小机器，X射线就像一把强力的干扰器。
它能深深钻进微生物的内部，对基因进行破坏和重组。
就像把小机器里的一些零件拆下来又重新组装，只不过这里是在基因层面。
有的微生物经X射线诱变后，抗逆性变强了。
原本在稍微恶劣一点的环境里就奄奄一息的，现在能坚强地活下去，而且还活得挺好。
化学诱变也不甘示弱。
化学诱变剂就像是给微生物的基因施魔法的小巫师。
像亚硝酸，它悄悄地接近微生物的基因，把基因里的一些碱基偷偷换掉。
这就好比在密码锁上换了几个密码数字，整个密码锁的开锁方式就可能完全变了。
微生物的基因表达也就随之改变。
一些霉菌经过亚硝酸诱变后，产孢子的能力可能大大增强，原本产一点点孢子的，现在像开了挂一样大量产孢子。
再说说碱基类似物，它们是伪装高手。
它们混入微生物的基因大厦里，伪装成正常的碱基。
可是一旦到了基因复制的时候，就开始捣乱了。
就像一个假零件混进了真零件堆里，在机器组装的时候就会出问题。
这种捣乱会导致基因复制出错，从而产生突变。
有的酵母菌经过碱基类似物的诱变后，发酵能力变得超强，能产生更多的酒精或者其他有用的代谢产物。
复合诱变就像是给微生物来一套组合拳。
先给微生物来点物理诱变，就像先给它一个下马威，打乱它的基因阵脚。
然后再用化学诱变，进一步在混乱的基因里搞点新花样。
微生物紫外线诱变育种的一般流程
微生物紫外线诱变育种的一般流程微生物紫外线诱变育种啊，这可挺有趣的呢。
一、出发菌株的选择。
这就像是选种子一样，咱们得挑个好的出发菌株。
这个菌株得是那种本身就有点潜力的，比如说它在某些方面已经表现得还不错了，像是生长速度还行啦，或者对环境有一定的适应能力之类的。
要是一开始就选个病恹恹的菌株，那后面再怎么诱变可能都白搭。
就好比你要培养一个运动员，你得先找个身体素质有点基础的人，不能找个整天生病的呀。
二、菌悬液的制备。
把选好的菌株弄成菌悬液，这就像是把种子泡在水里，让它们能均匀地分布。
这个菌悬液的浓度可不能太浓也不能太稀哦。
太浓了呢，紫外线可能照不均匀，就像一群人挤在一起，有些地方晒得到太阳，有些地方晒不到。
太稀了呢，那最后得到的突变体可能就太少了。
一般来说，咱们得根据经验或者查一些资料来确定这个合适的浓度。
在制备菌悬液的时候，还得注意保持菌株的活性，就像照顾小宝贝一样，环境得适宜，营养也不能少，可不能让它们在这个时候就挂掉了。
三、紫外线照射。
这可是关键的一步呢。
就像是给这些微生物来一场刺激的阳光浴，不过这个阳光可是紫外线。
咱们得把菌悬液放在紫外线灯下照射。
这个照射的时间和距离都很有讲究哦。
照射时间太短，可能诱变效果不明显，微生物还是老样子。
照射时间太长呢，那微生物可能就被紫外线给“晒死”啦，就像人在太阳下晒太久会中暑一样。
距离也很重要，离得太近，紫外线强度太大，离得太远，强度又不够。
而且在照射的时候啊，最好能让菌悬液不断地晃动，这样能保证每个微生物都能比较均匀地接受紫外线的洗礼。
四、后培养。
经过紫外线照射后的微生物可都是“受过伤”的小宝贝啦。
这时候要把它们放到合适的培养基里进行后培养。
这个培养基就像是一个温馨的小窝，给它们提供营养，让它们慢慢恢复，并且在这个过程中表现出那些因为诱变而产生的新特性。
在这个阶段，咱们得密切观察微生物的生长情况，看看有没有出现一些特别的变化，比如说生长速度突然变快了，或者对某种物质的代谢能力变强了之类的。
现代工业微生物育种
现代工业微生物育种一、诱变育种诱变育种是通过使用物理或化学方法，如紫外线、X射线、化学诱变剂等，诱导微生物发生基因突变，从而产生具有新性状的菌株。
这种方法可以大幅度提高微生物的变异频率，为育种工作提供了丰富的材料。
二、基因工程育种基因工程育种是通过人工构建基因表达载体，将其导入到微生物中，从而实现基因的转移和表达。
这种方法可以定向地改造微生物的遗传物质，使其表达出所需的性状。
基因工程育种具有高度定向性和可预测性，是现代工业微生物育种的重要手段之一。
三、代谢工程育种代谢工程育种是通过改变微生物的代谢途径，提高其代谢产物的产量或改变代谢产物的性质，从而获得所需的菌株。
这种方法需要对微生物的代谢过程有深入的了解，并能够精确地调控其代谢网络。
代谢工程育种在现代工业微生物育种中具有重要的应用价值。
四、组合生物合成育种组合生物合成育种是通过构建多个基因的组合文库，并筛选出具有所需性状的菌株。
这种方法类似于基因工程育种，但具有更高的遗传复杂性，可以创造出更丰富的变异类型。
组合生物合成育种在现代工业微生物育种中已经成为一种重要的策略。
五、定向进化育种定向进化育种是一种模拟自然进化过程的育种方法。
它通过对大量随机突变体进行筛选和选择，以实现所需性状的定向进化和优化。
定向进化育种可以在短时间内获得高度适应特定条件的优良菌株，具有很高的应用价值。
六、菌种保藏与复壮菌种保藏与复壮是工业微生物育种的重要环节。
通过科学的保藏方法，可以保持菌种的活力和遗传稳定性；而复壮则是通过一定的手段使保藏的菌种恢复活力，以保证其用于生产的性能。
七、基因组编辑育种基因组编辑育种是利用基因编辑技术对微生物基因组进行精确的编辑和改造，以实现定向改良和创造新品种的目的。
目前常用的基因组编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、ZFNs和TALENs等。
基因组编辑育种具有高度精确性和可控性，为现代工业微生物育种提供了强有力的工具。
请说明微生物诱变育种的一般流程
请说明微生物诱变育种的一般流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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第六章微生物诱变育种
复合处理的方式
• 复合处理有几类：
• 一类是两种或多种诱变剂的先后使用；
• 第二类是同一种诱变剂的重复使用；
• 第三类是两种或多种诱变剂的同时使用。
诱变因子的复合处理及其协同效应
单独处理 菌种 诱变剂 紫外线 X射线 氮芥 (0.1%) 紫外线 紫外线 γ射线 突变率(%) 21.3 19.7 复合处理 诱变剂 X射线+紫外线 突变率(%) 42.8
因此，应让变异处理后细胞在液体培养基中培养 几小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖几代，以 得到纯的变异细胞。这样，稳定的变异就会显现 出来。 若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分 离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌 落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果 的不稳定和将来的菌株退化。
3、诱变处理方法
（１）、紫外线和光照复活的交替处理
• 应用光照复活现象能使紫外线诱变作用得 到显著增强。 • 一次紫外线处理后，光照复活一次，突变 率降低；但是，增加剂量再次用紫外线照 射处理，光照复活后，突变率提高了。若 多次进行该处理，则突变率增加更大。
（２）诱变剂复合处理
• 诱变育种中还常常采取诱变剂的复合处理。 因为每种诱变剂有各自的作用方式，引起 的变异有局限性，复合处理则可扩大突变 的位点范围，使它们产生协同效应，获得 正突变菌株的可能性增大，因此，诱变剂 复合处理的效果往往好于单独处理.
32
突变株的筛选：
（1）产量突变株的筛选：琼脂块培养法 （2）抗药性突变株的筛选：梯度平板法 （3）营养缺陷型突变株的筛选：影印平板 法等 （4）形态、色素、酶活性和拮抗性等变异 菌株的筛选
诱变
春 日 霉 素 高 产 菌 种 琼 脂 块 培 养 法 筛 选
微生物诱变育种
灰黄霉素高产菌D-756诱变系谱菌株表型变异与产量递增的关系
菌号 诱变代数
菌落大小 /cm
4541 1
1.3
71046 10
0.8
B-53 11
第四章 微生物诱变育种
诱变育种：是以人工手段诱发微生物基因突变，改变其遗传 结构和功能，从多种多样的突变体中筛选出产量高、性状优 良的突变株， 并设计出适合该突变株最佳的培养基和条件， 使其在最适的工艺条件下最有效地合成产物。
分三个阶段：菌种基因型改变， 突变体筛选，产量评估
基因突变是微生物变异的主要源泉，人工诱变是加速基因突 变的重要手段。诱变育种有以下几个优点：速度快、收效大、 方法简单。
一、出发菌株
对出发菌株的要求： 1. 对诱变因素敏感，变异幅度大，正突变率高 2. 具有一定生产能力 3. 具有有利性状，如生长速度快、营养要求低以及产孢子
早而多的菌株
4. 有时可考虑选择已发生其他异的菌株作为出发菌株。
5. 采用一类被称为“增变菌株”的变异菌株，它们对诱变 剂的敏感性比原始菌株大为提高，更适宜作为出发菌株。
1. 抗生素法 常用于细菌和酵母菌营养缺陷型菌株的富集，前者用青
霉素法，后者用制霉菌素法。
青霉素法的原理为：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖类， 而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完 整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感， 因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处于休止状态的细 菌。 制霉菌素法原理：制霉菌素作用于真菌细胞膜上的甾醇， 引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集 营养缺陷型菌株的作用。
微生物诱变育种
微生物诱变育种：生命的奇妙微生物是我们身边最小的生命体，很多时候我们并不能直接感知它们的存在。
然而，它们却能通过一种特殊的方式——诱变（Mutation）——影响着我们生活中的各种生物群体，包括人类、动植物等等。
今天，我们就来谈谈这个新颖而神秘的话题。
什么是？简单来说，指的就是利用微生物对某种生物进行诱变，从而改变它的基因表达，产生新品种、新性状的一种育种方法。
这个方法的基本原理是：用化学或其他手段让微生物基因发生突变，再通过微生物对某种有用的基因进行筛选，最终通过繁殖来获得新生物种。
诱变是什么？这里我们需要先了解诱变的概念。
诱变是指基因发生变异，导致基因型和表型的改变，是一种与遗传和进化有关的生物现象。
地球上存在着各种各样的微生物，它们在不同的环境和生长条件下会产生大量的基因突变。
这些基因突变可能是随机的或者是特定的，在这个过程中，新的基因型可能获得某些新的性状，这样的性状可能比它们的亲代更有生存优势。
为什么是一种前景广阔的育种方法？之所以前途广阔，是因为它具有以下几个优点：首先，基因突变是自然而然的，而方法则是针对性地诱导微生物进行突变。
这一方法大大缩短了新品种的选育时间和成本。
其次，这种方法不涉及基因编辑技术和转基因技术。
这一点非常重要，因为基因编辑技术和转基因技术可能会对人类和环境造成潜在的风险。
最后，方法具有高效、广泛适用性等诸多优点。
由于微生物的数量庞大，不同的微生物可以用于诱变不同的生物，且微生物在实验中具有高容错性。
在实践中有哪些成功案例？在实践中已经有了很多成功案例。
比如，在植物育种方面，通过微生物诱变，我们可以获得既耐旱又耐病的新品种；在饲料育种方面，我们可以获得既营养丰富又易于消化的新饲料等等。
的应用还不止于此，例如医疗领域，我们可以通过微生物诱变来研制更加安全、有效的药物；在水产养殖中，通过微生物诱变可以获得更加健康和肥壮的水生动物。
结语是生命科学领域的一种创新、前沿的研究方向。
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最适剂量：在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度， 又能使变异向正突变范围移动的剂量。
突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提 高剂量, 反而会使突变率下降。
正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂 量中。
在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为70~75%, 甚至 30~70%的剂量。
诱变育种的基本原则：
• 选择简便有效的诱变剂； • 挑选优良的出发菌株； • 处理单细胞或单孢子悬液； • 选用最适的诱变剂量； • 充分利用复合处理的协同效应； • 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标； • 设计高效筛选方案； • 创造新型筛选方法。
二、几种重要突变株的筛选方法
• 1. 抗性突变株的筛选
设计有效的筛选方法，将少量正变株中的 筛选（定向） 优良菌株挑选出来。
（一） 出发菌株（original strain）
出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。
出发菌株的选择标准： • 具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、
标记明显等）； • 对诱变剂敏感
出发菌株的来源： •野生型菌株； •从生产中选育的自发突变菌株； •诱变获得的高产菌株
5. 菌悬液的浓度
酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL 细菌，放线菌孢子：108个/mL
（三）诱变剂的选择及处理方法
1. 诱变剂的选择（高效，简便）
物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且操作简便； 化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。
( NTG——超诱变剂）
UV是最常用的一种诱变剂
2. 剂量的选择
[A+B+], 可在[-]生长。
营养缺陷型（auxotroph） 野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能
力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的 突变菌株（主要指合成维生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。
[A+B-]：能在[+]、[B]生长 [A-B+]：能在[+]、[A]生长 [A-B-]：能在[+]生长
某野生型能生长的最低成分的组合培养基。
完全培养基（CM,complete medium）[+]： 各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基
补充培养基（SM, supplemental medium）[A]:[-]+A [B]:[-]+B
相应营养缺陷型能生长的组合或半ld type） 从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株。
（二） 菌悬液的制备
1. 选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散）
目的：①使每个细胞能均匀接触诱变剂； ②减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）
2. 同步培养（生理状态一致）
3. 菌龄：对诱变剂最敏感时期 营养细胞：对数期 孢子或芽孢：萌发前期
4.菌悬液的制备方法
物理诱变：生理盐水配制 化学诱变：缓冲液配制
UV的剂量: 固定UV功率和照射距离,以照射时间长短来 确定剂量多少。
3. 诱变处理方法
单因素处理或多因素的复合处理： ①同一诱变剂的重复使用； ②两种或多种诱变剂的先后使用； ③两种或多种诱变剂的同时使用.
（四） 中间培养（CM，培养过夜）
目的：克服表型延迟
表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于基因型改变的 分现分象离离，性性多延延核迟迟细的：胞原突的因变核: 的也对基成数因倍生经现增长D象加N期.，A中复诱，制变单和对核细数细胞期胞分的常裂细出后胞现变时双成，核纯突 变通常发生在一合个状核态上，，表故型其才变能异表或现非出变来异。的细胞必须经过 一生生生代理理理或性性性几延延延代迟迟迟繁的：: 殖原由才因杂能: 合分当状离变态，异变这细为种胞纯纯由合种杂状变合态异状，细态突胞变变出为表现纯型的合仍推状不迟态能现 象时称,由为于分杂离合延期迟所表现合现象成出。的来非。变异的蛋白或酶仍然发挥作用,必 须经过细胞多代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉,最终 达到变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过程 。
（五）突变株的筛选
1. 初筛（以量为主） 方法需简便、快速
初筛 2步 复筛
（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性
（2）根据平板颜色反应直接挑选 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 抑菌圈法（抗生素）； 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）； 沉淀圈法（外毒素）
透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标） 2. 复筛（以质为主，定量测定） 摇瓶培养，直接检测所需产物
原养型（prototroph） 营养缺陷型经回复突变或重组，回到原来野生型的营养要求
[A+B+], 可在[-]生长
（2）筛选步骤（5步）
诱变处理 中间培养 淘汰野生型 检出缺陷型 鉴定缺陷型
①中间培养 CM或SM培养基，培养过夜。克服表型延迟。
第五节 微生物的诱变育种
一、诱变育种中的几个原则
指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变 率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。
2个主要环节： 诱变（随机）
选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀 、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞 致死的同时，使存活个体中的突变频率大大 提高。
– (1) 抗终代谢物结构类似物突变株的筛选 – (2) 抗药性突变株筛选
• 2. 营养缺陷型的筛选
1. 抗性突变株的筛选
（1）抗终代谢物结构类似物的突变株
用途：筛选相应代谢物的高产菌株
（所2）谓抗结药构性类突似变株物（又称代谢拮抗物）是指那些在结 筛构 似选上的a用的.和物高途方代 质于：法临谢 。筛: 界选终浓相产度应物的药（平物氨板(抗进基生行酸素分、)离的嘌；高呤产、菌维株或生遗素传等标）记相制作
如：b.异梯烟度平肼板（法“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物
，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变株，
可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。
加入不含异烟肼的底层
敏感
菌苔
为什么在筛选突变株抗时性 ,不能直接用代谢产物,而必 须用其加入结含异构烟类肼的似上层物? 菌落
2. 营养缺陷型突变株的筛选
（1）几个概念： 三类培养基： 基本培养基（MM, minimal medium）[-]：