微生物诱变育种
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UV的剂量: 固定UV功率和照射距离,以照射时间长短来 确定剂量多少。
3. 诱变处理方法
单因素处理或多因素的复合处理： ①同一诱变剂的重复使用； ②两种或多种诱变剂的先后使用； ③两种或多种诱变剂的同时使用.
（四） 中间培养（CM，培养过夜）
目的：克服表型延迟
表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于基因型改变的 分现分象离离，性性多延延核迟迟细的：胞原突的因变核: 的也对基成数因倍生经现增长D象加N期.，A中复诱，制变单和对核细数细胞期胞分的常裂细出后胞现变时双成，核纯突 变通常发生在一合个状核态上，，表故型其才变能异表或现非出变来异。的细胞必须经过 一生生生代理理理或性性性几延延延代迟迟迟繁的：: 殖原由才因杂能: 合分当状离变态，异变这细为种胞纯纯由合种杂状变合态异状，细态突胞变变出为表现纯型的合仍推状不迟态能现 象时称,由为于分杂离合延期迟所表现合现象成出。的来非。变异的蛋白或酶仍然发挥作用,必 须经过细胞多代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉,最终 达到变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过程 。
常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲线）
最适剂量：在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度， 又能使变异向正突变范围移动的剂量。
突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提 高剂量, 反而会使突变率下降。
正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂 量中。
在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为70~75%, 甚至 30~70%的剂量。
第五节 微生物的诱变育种
一、诱变育种中的几个原则
指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变 率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。
2个主要环节： 诱变（随机）
选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀 、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞 致死的同时，使存活个体中的突变频率大大 提高。
– (1) 抗终代谢物结构类似物突变株的筛选 – (2) 抗药性突变株筛选
• 2. 营养缺陷型的筛选
1. 抗性突变株的筛选
（1）抗终代谢物结构类似物的突变株
用途：筛选相应代谢物的高产菌株
（所2）谓抗结药构性类突似变株物（又称代谢拮抗物）是指那些在结 筛构 似选上的a用的.和物高途方代 质于：法临谢 。筛: 界选终浓相产度应物的药（平物氨板(抗进基生行酸素分、)离的嘌；高呤产、菌维株或生遗素传等标）记相制作
如：b.异梯烟度平肼板（法“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物
，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变株，
可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。
加入不含异烟肼的底层
敏感
菌苔
为什么在筛选突变株抗时性 ,不能直接用代谢产物,而必 须用其加入结含异构烟类肼的似上层物? 菌落
2. 营养缺陷型突变株的筛选
（1）几个概念： 三类培养基： 基本培养基（MM, minimal medium）[-]：
诱变育种的基本原则：
• 选择简便有效的诱变剂； • 挑选优良的出发菌株； • 处理单细胞或单孢子悬液； • 选用最适的诱变剂量； • 充分利用复合处理的协同效应； • 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标； • 设计高效筛选方案； • 创造新型筛选方法。
二、几种重要突变株的筛选方法
• 1. 抗性突变株的筛选
原养型（prototroph） 营养缺陷型经回复突变或重组，回到原来野生型的营养要求
[A+B+], 可在[-]生长
（2）筛选步骤（5步）
诱变处理 中间培养 淘汰野生型 检出缺陷型 鉴定缺陷型
①中间培养 CM或SM培养基，培养过夜。克服表型延迟。
（二） 菌悬液的制备
1. 选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散）
目的：①使每个细胞能均匀接触诱变剂； ②减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）
2. 同步培养（生理状态一致）
3. 菌龄：对诱变剂最敏感时期 营养细胞：对数期 孢子或芽孢：萌发前期
4.菌悬液的制备方法
物理诱变：生理盐水配制 化学诱变：缓冲液配制
ห้องสมุดไป่ตู้
5. 菌悬液的浓度
酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL 细菌，放线菌孢子：108个/mL
（三）诱变剂的选择及处理方法
1. 诱变剂的选择（高效，简便）
物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且操作简便； 化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。
( NTG——超诱变剂）
UV是最常用的一种诱变剂
2. 剂量的选择
某野生型能生长的最低成分的组合培养基。
完全培养基（CM,complete medium）[+]： 各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基
补充培养基（SM, supplemental medium）[A]:[-]+A [B]:[-]+B
相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基
三种遗传型：
野生型（wild type） 从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株。
设计有效的筛选方法，将少量正变株中的 筛选（定向） 优良菌株挑选出来。
（一） 出发菌株（original strain）
出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。
出发菌株的选择标准： • 具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、
标记明显等）； • 对诱变剂敏感
出发菌株的来源： •野生型菌株； •从生产中选育的自发突变菌株； •诱变获得的高产菌株
[A+B+], 可在[-]生长。
营养缺陷型（auxotroph） 野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能
力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的 突变菌株（主要指合成维生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。
[A+B-]：能在[+]、[B]生长 [A-B+]：能在[+]、[A]生长 [A-B-]：能在[+]生长
（五）突变株的筛选
1. 初筛（以量为主） 方法需简便、快速
初筛 2步 复筛
（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性
（2）根据平板颜色反应直接挑选 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 抑菌圈法（抗生素）； 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）； 沉淀圈法（外毒素）
透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标） 2. 复筛（以质为主，定量测定） 摇瓶培养，直接检测所需产物
3. 诱变处理方法
单因素处理或多因素的复合处理： ①同一诱变剂的重复使用； ②两种或多种诱变剂的先后使用； ③两种或多种诱变剂的同时使用.
（四） 中间培养（CM，培养过夜）
目的：克服表型延迟
表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于基因型改变的 分现分象离离，性性多延延核迟迟细的：胞原突的因变核: 的也对基成数因倍生经现增长D象加N期.，A中复诱，制变单和对核细数细胞期胞分的常裂细出后胞现变时双成，核纯突 变通常发生在一合个状核态上，，表故型其才变能异表或现非出变来异。的细胞必须经过 一生生生代理理理或性性性几延延延代迟迟迟繁的：: 殖原由才因杂能: 合分当状离变态，异变这细为种胞纯纯由合种杂状变合态异状，细态突胞变变出为表现纯型的合仍推状不迟态能现 象时称,由为于分杂离合延期迟所表现合现象成出。的来非。变异的蛋白或酶仍然发挥作用,必 须经过细胞多代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉,最终 达到变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过程 。
常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲线）
最适剂量：在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度， 又能使变异向正突变范围移动的剂量。
突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提 高剂量, 反而会使突变率下降。
正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂 量中。
在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为70~75%, 甚至 30~70%的剂量。
第五节 微生物的诱变育种
一、诱变育种中的几个原则
指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变 率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。
2个主要环节： 诱变（随机）
选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀 、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞 致死的同时，使存活个体中的突变频率大大 提高。
– (1) 抗终代谢物结构类似物突变株的筛选 – (2) 抗药性突变株筛选
• 2. 营养缺陷型的筛选
1. 抗性突变株的筛选
（1）抗终代谢物结构类似物的突变株
用途：筛选相应代谢物的高产菌株
（所2）谓抗结药构性类突似变株物（又称代谢拮抗物）是指那些在结 筛构 似选上的a用的.和物高途方代 质于：法临谢 。筛: 界选终浓相产度应物的药（平物氨板(抗进基生行酸素分、)离的嘌；高呤产、菌维株或生遗素传等标）记相制作
如：b.异梯烟度平肼板（法“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物
，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变株，
可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。
加入不含异烟肼的底层
敏感
菌苔
为什么在筛选突变株抗时性 ,不能直接用代谢产物,而必 须用其加入结含异构烟类肼的似上层物? 菌落
2. 营养缺陷型突变株的筛选
（1）几个概念： 三类培养基： 基本培养基（MM, minimal medium）[-]：
诱变育种的基本原则：
• 选择简便有效的诱变剂； • 挑选优良的出发菌株； • 处理单细胞或单孢子悬液； • 选用最适的诱变剂量； • 充分利用复合处理的协同效应； • 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标； • 设计高效筛选方案； • 创造新型筛选方法。
二、几种重要突变株的筛选方法
• 1. 抗性突变株的筛选
原养型（prototroph） 营养缺陷型经回复突变或重组，回到原来野生型的营养要求
[A+B+], 可在[-]生长
（2）筛选步骤（5步）
诱变处理 中间培养 淘汰野生型 检出缺陷型 鉴定缺陷型
①中间培养 CM或SM培养基，培养过夜。克服表型延迟。
（二） 菌悬液的制备
1. 选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散）
目的：①使每个细胞能均匀接触诱变剂； ②减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）
2. 同步培养（生理状态一致）
3. 菌龄：对诱变剂最敏感时期 营养细胞：对数期 孢子或芽孢：萌发前期
4.菌悬液的制备方法
物理诱变：生理盐水配制 化学诱变：缓冲液配制
ห้องสมุดไป่ตู้
5. 菌悬液的浓度
酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL 细菌，放线菌孢子：108个/mL
（三）诱变剂的选择及处理方法
1. 诱变剂的选择（高效，简便）
物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且操作简便； 化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。
( NTG——超诱变剂）
UV是最常用的一种诱变剂
2. 剂量的选择
某野生型能生长的最低成分的组合培养基。
完全培养基（CM,complete medium）[+]： 各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基
补充培养基（SM, supplemental medium）[A]:[-]+A [B]:[-]+B
相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基
三种遗传型：
野生型（wild type） 从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株。
设计有效的筛选方法，将少量正变株中的 筛选（定向） 优良菌株挑选出来。
（一） 出发菌株（original strain）
出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。
出发菌株的选择标准： • 具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、
标记明显等）； • 对诱变剂敏感
出发菌株的来源： •野生型菌株； •从生产中选育的自发突变菌株； •诱变获得的高产菌株
[A+B+], 可在[-]生长。
营养缺陷型（auxotroph） 野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能
力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的 突变菌株（主要指合成维生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。
[A+B-]：能在[+]、[B]生长 [A-B+]：能在[+]、[A]生长 [A-B-]：能在[+]生长
（五）突变株的筛选
1. 初筛（以量为主） 方法需简便、快速
初筛 2步 复筛
（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性
（2）根据平板颜色反应直接挑选 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 抑菌圈法（抗生素）； 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）； 沉淀圈法（外毒素）
透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标） 2. 复筛（以质为主，定量测定） 摇瓶培养，直接检测所需产物