植物体内过氧化物酶活性的测定
过氧化物酶活性测定
过氧化物酶（POD）活性测定一、原理：过氧化物酶含铁，广泛存在于植物组织中，可催化过氧化氢氧化酚类，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。
本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，当有H2O2 存在时，过氧化物酶可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，其在470nm处有最大吸收峰，故可用分光光度计在470nm处测定其吸光值，即可求出该酶的活性。
二、实验准备：仪器：分光光度计、离心机、秒表、研钵、磁力搅拌器、移液管、电子天平、冰箱、100ml 容量瓶、试管、胶头滴管、试管架、烧杯、吸水纸、比色皿、剪子试剂：0.05 mol/L愈创木酚；2%H2O2； pH 6.0的磷酸缓冲液；75%酒精；蒸馏水试剂配制:○1pH 6.0的磷酸缓冲液:0.2mol/l NaH2PO4 (27.6g NaH2PO4•H2O 用蒸馏水配成1000ml）取87.7ml和0.2mol/l Na2HPO4 （71.7g Na2HPO4•12H2O 或53.65g Na2HPO4•7H2O 用蒸馏水配成1000ml）取12.3ml后混合，用蒸馏水稀释至200ml即可。
○22%H2O2：取6.7ml 30%H2O2于烧杯中，再加入93.3mL蒸馏水（或加蒸馏水稀释至100mL），搅拌均匀。
○30.05 mol/L愈创木酚：准确称取6.2g愈创木酚，再用95%的乙醇配制定容至100ml即可。
三、步骤：○1粗酶液的提取：称取一定质量的植物材料放入研钵中，加入提取液1 mL(pH 6.0的磷酸缓冲液)，研磨，再加入9 mL提取液，将匀浆全部转入离心管中，于4 000 r/min 4 ℃离心10 min，上清液即为酶的粗提取液，收集上清液于冷处（冰箱4℃保存）。
○2酶活性的测定：将4 mL反应混合液( pH 6.0的磷酸缓冲液2 mL,酶液1 mL,0.05 mol/L 愈创木酚1 mL)和1 mL 2% H202加入试管中立即摇匀并迅速倒入比色皿中，于470 nm波长下用U 2800型紫外可见分光光度计比色，立刻记录吸光度值，以后每15 s记录1次，记录2 min ，另外以缓冲液代替酶液作为较零对照组。
过氧化物酶活性的测定实验报告
一、实验目的了解过氧化物酶（POD）在植物生理学中的重要作用，掌握测定POD活性的方法，并分析不同因素对POD活性的影响。
二、实验原理过氧化物酶是一种广泛存在于植物组织中的酶，能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水（H2O）和氧气（O2）。
在实验中，通过测定在一定时间内POD分解H2O2产生氧气的量，来评价POD的活性。
反应方程式如下：2H2O2 → 2H2O + O2本实验采用愈创木酚法测定POD活性。
愈创木酚在POD催化下被氧化，生成对苯醌，进而与氯化铁形成紫色络合物，通过测定紫色络合物的吸光度变化来反映POD的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 植物叶片（如马铃薯、菠菜等）- 过氧化氢（H2O2）- 愈创木酚- 氯化铁- 磷酸氢二钠（Na2HPO4）- 磷酸氢钠（NaH2PO4）- pH计- 离心机- 分光光度计- 研钵- 试管- 移液器- 电子天平2. 实验试剂：- 0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）- 0.1 M H2O2溶液- 0.5 M愈创木酚溶液- 0.1 M氯化铁溶液四、实验步骤1. 酶液提取：将植物叶片洗净、剪碎，加入预冷的磷酸盐缓冲液，在研钵中研磨成匀浆。
将匀浆液转移至离心管中，4℃、12,000 rpm离心10分钟，取上清液即为酶液。
2. 测定酶活性：取5支试管，编号为1-5，分别加入以下试剂：- 空白组：0.1 M磷酸盐缓冲液1.0 mL、0.1 M H2O2溶液1.0 mL、0.5 M愈创木酚溶液1.0 mL- 实验组：0.1 M磷酸盐缓冲液1.0 mL、0.1 M H2O2溶液1.0 mL、0.5 M愈创木酚溶液1.0 mL、酶液0.1 mL将各试管混匀，置于37℃恒温水浴中保温5分钟。
取出试管，立即放入冰浴中终止反应。
使用分光光度计在波长560 nm处测定各试管吸光度。
3. 计算酶活性：以空白组吸光度为基准，计算各实验组吸光度变化值（ΔA）。
根据下列公式计算酶活性：酶活性（U/g·min）= ΔA × 0.05 × 10^3 / 酶液浓度五、结果与分析1. 不同植物叶片POD活性比较：实验结果显示，不同植物叶片的POD活性存在差异。
过氧化物酶活性的测定
过氧化物酶活性的测定（比色法）过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量470 nm 处的吸光度变化速率来测定过氧化物酶活性。
一、仪器、药品与材料（一）实验材料新鲜植物组织。
（二）仪器与用品分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100 mL 容量瓶，吸管，高速冷冻离心机，秒表，磁力搅拌器。
（三）试剂１．愈创木酚。
２．30％过氧化氢。
３．100 mmol/L 磷酸缓冲液pH 6.0。
４．反应混合液：取100 mmol/L 磷酸缓冲液（pH 6.0）50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚28 μL，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30 % 过氧化氢19 μL，混合均匀，保存于冰箱中备用。
二、实验步骤1．称取植物材料0.1 g ，剪碎，放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，残渣再用5 mL 磷酸缓冲液提取一次，以4000 rpm 低温离心15 min ，上清液即为粗酶液，定容至10 mL刻度，贮于低温下备用。
2．取2支试管，于1只中加入反应混合液3 mL 和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1支中加入反应混合液3 mL和上述酶液1mL（如酶活性过高可稀释之）。
迅速将两支试管中溶液混匀后，倒入比色杯，置于分光光度计样品室内，立即开启秒表记录时间，于470 nm 处测定吸光度（OD）值，每隔10S读数一次。
3．结果计算：以每分钟OD变化值（ΔA470 / gFW min）表示酶活性大小，。
也可以用每min OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活性单位（U）表示。
过氧化物酶活性（U/gFW·min）= ΔA470×VT/W×VS×0.01×t式中：ΔA470——反应时间内OD变化值。
植物组织内过氧化物酶(POD)活性的测定
实验七植物组织内过氧化物酶(POD)活性的测定
一、实验目的
掌握植物组织内过氧化物酶活性测定的原理和方法。
二、实验原理
过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。
在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在470nm处有最大吸收峰，可根据单位时间内A470的变化值，计算POD活性大小。
三、实验材料与设备
1．实验设备与仪器
电子天平、冰冻高速离心机、可见光分光光度计、电动玻璃匀浆剂等。
2．实验材料与试剂
20mM KH2PO4，
100mM PBS：取0.2M Na2HPO4，87.7ml与0.2MNaH2PO4，12.3ml混合。
反应液：取100mM PBS 50ml，加入愈创木酚28μl，搅拌溶解，待溶液冷却后加入30%的H2O219μl，混合均匀保存于冰箱中备用。
四、实验步骤
1．酶液制备
取1.0g植物叶片剪碎，置入玻璃匀浆杯中，加入预冷的20mM KH2PO45ml进行冰浴研磨提取。
匀浆液低温离心8500rpm 15min，上清液为酶粗提液，定容到50ml供测定。
2．酶活性测定
取光程为1cm的玻璃比色杯2只，一只加入反应液3ml，20mMKH2PO41ml作为调零管。
另一只加入反应液3ml，提取的酶液1ml，立即开始计时，在470nm波长处进行比色，开始记录数据，然后每隔一分钟记录一次吸光度值，共测3min。
3．计算
以每分钟A470的化变值0.01为一个相对酶活单位，计算植物组织内过氧化物酶酶活力的大小（单位：U/g鲜重）。
过氧化物酶活性的测定
实验六：过氧化物酶活性的测定左哥一、实验目的：过氧化物酶是植物体内重要的呼吸酶类，其活性高低与酶类物质代谢，植物抗性密切相关。
通过实验掌握提取POD和测定其活性方法和原理。
二、实验原理：过氧化物酶催化H2O2氧化酶类，生成醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其它分子缩合，产生颜色较深产物。
本实验以愈创木酚为底物，过氧化物酶催化H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物，次产物在470nm波长处有最大吸收峰，故可通过测定470nm波长下的吸收光度变化得知过氧化物酶的活性。
三、材料与试剂材料：马铃薯试剂：20m mol/L KH2PO4,反应混合液四、方法步骤：1、酶液制备：称取材料1.079g，加入20m mol/L KH2PO4 5ml,于研钵中研磨成匀浆，在3000r/min，下离心10min,上清液转入25ml,容量瓶，残渣再用5ml, KH2PO4,提取一次，定容，混匀，贮于冷凉处备用。
2、比色测定：光径1cm比色杯两只，1只先加1ml KH2PO4，再加3ml混合液作参比液；另一只加1ml,酶液，3ml混合液，立即计时并置于分光光度计中，在470nm下测定光密度，每隔1min读数一次，连续测8min，每次测定前重新对照校准。
五、实验结果酶活力（0.01 A470/L）=(A2-A1)/0.01(t2-t1)*(V2/V1)=328.2μ酶的比活力（μ/g）=酶活力/样品重=304.2μ/g实验七：种子生活力快速测定一、实验目的：种子生活力即种子发芽潜力，是鉴定种子力量研究种子储藏生理的重要指标，本实验运用TTC，红墨水发快速测定种子生活力。
二、实验原理：1、TTC法：有生活力的种子呼吸作用产生的NADH能还原TTC，生产的红色的TPE，将胚染成红色，无生活力的种子，无呼吸代谢活动，不能还原TTC，肧不着色。
2、红墨水法：植物活细胞的原生质膜有选择透性，某些染料分子不能透过。
如红墨水，因而不能将种肧染色，而死的种肧，其细胞膜结果破坏，选择透性丧失，因而染料分子能透过膜进入细胞将种肧染色。
植物组织中过氧化物酶活性的测定
实验四植物组织中过氧化物酶活性的测定一、实验目的：1、学习测定植物组织中过氧化物酶活性的方法。
二、实验原理：过氧化物酶（POD）广泛存在于植物体中，该酶催化氧化，以清除H OHO2222对细胞生物功能分子的破坏作用。
在有存在的条件下，过氧化物酶使愈创OH22木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测定470nm处茶褐色物质的生成量以检测POD活性。
三、实验仪器及材料：1、仪器：研钵、剪刀、天平、量筒、试管、分光光度计、移液管、比色皿、离心机、秒表2、材料与试剂：苹果、经逆境处理的绿豆幼苗、反应混合液、20mmol/LKHPO 42四、实验步骤：1、POD的提取分别称取绿豆幼苗、苹果果肉各2g,分别加入预冷的10ml 20mmol/LKHPO，42于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min离心10min，收集上清液，待用。
2、POD活性的测定取分光光度计比色杯2只，在其中一只加入3ml反应混合液和1ml KHPO42作为对照；另一只加入3ml反应混合液，1ml苹果上清液，立即开启秒表计时，测定470nm处OD值，每隔30s读数一次。
取1ml绿豆幼苗上清液重复上述操作。
五、实验结果：1、在酶液中加入3ml反应混合液后，苹果酶液立即呈茶褐色，而绿豆幼苗酶液的茶褐色深至黑褐色。
2、苹果酶液以及绿豆幼苗酶液在470nm处OD值如下：以每分钟光密度（OD）变化0.01为一个过氧化物酶活力单位，即：470nm苹果POD活性=[ΔOD/(0.01×wt)] ×D470=[（0.28－0.249）/（0.01×3×2）] ×D=0.52D（此值忽略稀释倍数）其中w为样品鲜重，t为反应时间，D为稀释倍数绿豆幼苗POD活性=[ΔOD/(0.01×wt)] ×D470=[（0.940－1.56）/（0.01×3·2）] ×D =6.3 D（此值忽略与苹果酶液相同的稀释倍数）由于绿豆幼苗酶液浓度较大，测OD值前稀释了两倍，所以绿豆幼苗酶液POD 活性为12.67D六、结果分析：1、由苹果酶液OD值与时间的关系曲线图中，OD值与时间的关系基本呈线性关系，故任取变化较均匀的一段数据均可计算出POD活性。
实验五_过氧化物酶酶活性的测定
实验五_过氧化物酶酶活性的测定一、实验原理1. 过氧化物酶（POD）在植物生长过程中发挥重要作用。
在压力、紫外线辐射、微生物侵入和病原体感染等外界刺激下，植物组织中的过氧化物酶活性会显著增加，以保护植物免遭伤害。
2. 过氧化物酶是一种氧化酶，催化产生氧气的反应（如下）：ROOR′+ 酶———> R′OH + O23. 过氧化物酶活性的测定实验基于上述反应，利用巴尔的显色方法测定过氧化物酶催化下的氧化反应速率。
二、实验步骤1. 将100mL的3% H2O2（v/v）制成浓度为60mmol/L的过氧化氢溶液。
2. 按0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL 5个等份，取出浓度分别为6、12、18、24、30mmol/L的H2O2溶液，放入5个试管中。
4. 将1mL的20mg/mL酶溶液加入中等浓度（12mmol/L）的H2O2溶液中，混合均匀。
缓慢倾斜试管，使溶液彻底混合。
5. 取出一根手指，将其浸泡于硫酸铁铵溶液中。
将试管倾斜，瓶口与硫酸铁铵溶液接触，放入深100°C的水浴中加热2min。
将溶液混合均匀。
6. 将试管移出水浴，冷却到室温后，再加入1mL的硼酸缓冲液，混合均匀。
7. 测定吸收值（深紫色的铁化合物阴离子形成）。
利用光度计在546nm处测量。
8. 按照如上步骤分别测定不同浓度下的H2O2溶液。
三、结果分析1. 计算各试管中产生的氧气量，并绘制曲线（以5mmol/L，10mmol/L，15mmol/L，20mmol/L，25mmol/L的浓度为横坐标）。
2. 计算过氧化物酶活性（OD/min/mg）。
四、实验注意事项1. 检查瓶塞和试管，确保没有损坏。
2. 操作过程中，需严格按照试剂用量来添加试剂。
3. 热水浴器的温度应为100°C。
4. 硫酸铁铵溶液应略微加热一会儿，以充分溶解。
5. 实验过程中避免强光照射。
过氧化物酶活性的测定
实验29 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。
一、原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。
即可求出消耗的H2O2的量。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小麦叶片（二）仪器设备：1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。
（三）试剂：1. 10%H2SO4；2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液；3. 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4（A R）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定；4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5. 0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。
三、实验步骤（一）酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm 离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
（二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。
植物体内过氧化物酶活性的测定
以每分钟光密度（OD470nm）变化0.01为1个过氧化 物酶活力单位，即：
w:大麦苗鲜重 t：反应时间 D：稀释倍数，即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数
附注������ 酶的提取纯化需在低温下进行。 思考题 测定酶的活力要注意控制哪些条件？
（1）保持待测材料的酶活； （2）测定时注意控制反应时间；
操作步骤
1．酶液提取：称取0.5g白菜叶片于研钵中 →加入2ml磷酸缓冲溶液→研成匀浆→转入 10ml刻度试管中→再加3ml磷酸缓冲溶液冲 洗研钵→转入10ml刻度试管中→以KH2PO4 溶液定容 →再转入离心管中→4000r/min 4℃下离心15min →倾出上清液至刻度试管 中→4℃下保存。
实验二
植物体内过氧化物酶活性的测定
实验目的
学习和掌握过氧化物酶(POD)活性测定 的原理及方法。
背景知识
线粒体通过呼吸作用，一方面为细胞各项活动提 供能量，另一方面也可通过呼吸链电子传递途径 产生超氧阴离子，并通过链式反应形成对机体有 损伤作用的活性氧。 活性氧（reactive oxygen species，ROS）是超氧阴 –）、过氧化氢（H O ）、羟自由基 离子（O2· 2 2 （· OH）和单线态氧（1O2）等几种分子的总称， –和H O 是所有活性氧的源头。 其中O2· 2 2 生物体内产生的活性氧若得不到及时清除，就会 在细胞中积累，引起细胞凋亡。
操作步骤
2. 取试管2只、1只加入3ml反应混合液， 1m120mmol/lKH2PO4液作为对照；另1中加入3ml 反应混合液，1ml酶液(若活性高则稀释之)，混匀 后倒入比色皿中，于分光光度计上测定吸光度值， 每隔30s读数一次，波长为470nm，至吸光值变化 极微小后停止。
植物体内过氧化物酶活性的测定
植物体内过氧化物酶活性的测定一、目的过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控 IAA 水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的 H2O2的毒害作用。
故在科研上常加以测定。
二、原理在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色 4 －邻甲氧基苯酚，在470nm 波长处测定生成物的吸光度（ A ）值，即可求出该酶活性。
三、材料、仪器设备及试剂1. 材料：植物叶片2. 仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。
3. 试剂及配制：0.1mol·L－1磷酸缓冲液（ pH7 ）。
反应液（100ml 0.1mol · L－1磷酸缓冲液（ pH6 ）中加入 0.5ml 愈创木酚、 1ml 30 ﹪ H 2 O 2，充分摇匀）。
四、实验步骤1. 酶液提取称取植物叶片 1g ，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为 10mlpH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在 8000 r / min 离心 15min ，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。
2. 酶活性测定吸取反应液 3ml 于试管中，加入酶提取液 0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径 1cm 的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在 470nm 波长处，以时间扫描方式，测定 3min 内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度变化值（△ A 470 ）。
五、酶活性计算按下式计算酶的相对活性△ A 470 ×酶提取液总量（ml）酶活性（△A470·g－1Fw·min－1） = ————————————————————样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml）。
实验过氧化物酶活性的测
按照实验要求配制过氧化物酶试剂和磷酸盐缓冲液。
配制试剂
将比色皿、滴定管等仪器在实验前放置在冰箱中冷却。
预冷仪器
实验准备
实验操作流程
采集待测样本，如植物组织或细胞提取物。
样本准备
将样本与过氧化物酶试剂混合，在适宜的温度和pH条件下反应一段时间，记录反应过程中的吸光度变化。
酶活性测定
记录每个样本的吸光度变化，并计算过氧化物酶活性。
研究过氧化物酶活性有助于了解植物的抗病机制和筛选抗病品种
实验原理
02
实验材料
实验仪器
分光光度计：用于检测样品中的吸光度，从而计算过氧化物酶的活性。
磁力搅拌器：保持反应液的均匀混合。
酶标仪：可以同时检测多个样品，提高实验效率。
低温冰箱和超净工作台：储存和处理实验样品。
实验试剂
过氧化物酶标准品：用于制作标准曲线。
xx年xx月xx日
实验过氧化物酶活性的测
CATALOGUE
目录
实验简介实验材料实验步骤实验结果实验总结
01
实验简介
探究不同植物中过氧化物酶的活性差异
验证过氧化物酶活性与植物抗病性的关系
实验目的
1
实验背景
2
3
过氧化物酶是一种广泛存在于植物中的氧化还原酶
过氧化物酶在植物体内具有抗氧化、清除自由基的作用，有助于提高植物的抗病能力
数据记录
根据实验数据计算过氧化物酶活性的平均值、标准差等统计指标，并绘制相应的图表。
数据分析
03
结果展示
将实验结果以图表的形式展示，如柱状图、饼图等，以便更好地观察和分析实验结果。
数据记录与分析
01
数据记录表格
植物生理指标测定
(6)标准曲线的绘制:先求出吸光度值(y)依脯氨酸浓度(x)而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2 mL测定液中脯氨酸的含量(ug/mL)。
2.样品的测定
(1)脯氨酸的提取:准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g,分别置大管中，然后向各管分别加人5mL3%的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10 min(提取过程中要经常播动),冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。
B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.205mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）
(二)过氧化物酶活性测定
酶活性测定的反应体系包括:2.9 mL.0.05 mol/L磷酸缓冲液; 1.0ml.2%H2O2；1.0mL.0.05mol/L愈创木面和0.1mL酶液。用加热煮沸5min的酶成为对照，反应体系加人酶液后，立即于37C水浴中保温15min.然后迅速转人冰浴中，并加人2.0ml.20%三氯乙酸终止反应，然后，过虑(或5000xg离心10min),适当稀释.470mm波长下测定吸光度。
显色反应取试管（要求透明度好）4，2为样品测定管，2为对照管，按表39-1加入各溶液。
混匀后将1支对照管置于暗处其他管于4000lx日光反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。
实验十一植物体内过氧化物酶活性的测定
三、实验步骤
1. 提取酶液：
2. 3. 4. 叶片2片（w gFW）+pH7.0磷酸缓冲液 5mL
研磨，离心（4000rpm*10min），上清 液即为粗酶液。
2、配制反应液
1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0） 50ml +28uL愈创木酚+19uLH2O2(30%)
一般临用前配制，冰箱内短期保存。
酶活力=
活力单位(U) w(g FW)
W=W总（g FW)* V(mL)/V总
3、POD的主要生理功能
参与活性氧代谢过程； 参与木质素和木栓质的合成； 参与生长素的降解。
注：除了与植物正常代谢和生长发育相关的 结构型POD 外, 很大部分POD的合成属于诱导 表达型。
二、实验材料与试剂
实验材料： 不同浓度Cd处理7d的菱叶片； 试剂 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0） 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0） 愈创木酚； H2O2。
实验十一 植物体内过氧化物酶 活性的测定
——愈创木酚比色法
一、原理
过氧化物酶 过氧化物酶[perox idase, POD] 广泛存 在于各种动物、植物和微生物体内。催 化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化 反应: RH2+ H2O2→2H2O + R
•2 POD 分成的血 红素蛋白, 脱辅基蛋白分子须与血红素结 合才构成全酶。
2、酶反应
3mL反应液+0.2mL粗酶液，震荡混匀后 立刻记时，以3mL反应液+ 0.2mL磷酸缓 冲液调零，测OD470，30’’内读第一次数， 之后每10S读数一次，至OD值>1.000。
3、计算酶活性
选取OD值变化较均匀的一段数据，代入公式 计算； 以每分钟OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活 力单位（U）。
实验过氧化物酶活性的测定
测定吸光值
将反应体系放入分光光度计中， 在特定波长下测定吸光值。
01
02
试剂准备
按照实验要求，准备试剂，如磷 酸盐缓冲液、过氧化氢等。
03
04
反应体系构建
在另一个试管中加入适量底物溶 液，加入酶液，构建反应体系。
实验结果记录
记录数据
01
记录每个时间点的吸光值，以及反应体系的温度、
pH等参数。
数据处理
2
过氧化物酶广泛存在于各种动植物组织中，其最 典型的底物是过氧化氢。
3
实验通过检测过氧化物酶分解底物过氧化氢生成 氧的速率，来测定过氧化物酶的活性。
实验步骤
2. 配置反应液
将过氧化氢、磷酸盐缓冲 液和酶提取液按比例混合
。
4. 记录数据
记录不同时间点吸光度的 变化值，并计算反应速率
。
01
02
03
04
实验组过氧化物酶活性升高，可能是由于植 物体受到胁迫或处于逆境条件下，需要增加 过氧化物酶的合成以应对外界环境压力。
对照组过氧化物酶活性较低，可能是由于植 物处于正常生长条件下，不需要过多的过氧 化物酶合成。
实验结论与讨论
01
本实验通过测定过氧化物酶活性，初步探讨了植物在
不同环境条件下的生理反应。
实验结果分析
01
根据实验数据绘制反应曲线， 判断酶活性与底物浓度之间的 关系。
02
比较不同样品之间过氧化物酶 活性的差异，分析其原因。
03
对实验结果进行统计学分析， 得出结论并讨论。
感谢您的观看
THANKS
02 根据记录的数据，计算过氧化物酶活性，包括单位时
间内底物消耗量、酶活性等指标。
植物过氧化物酶活性测定方法优化
� � � � O D M P A P
� � � � � � � W A NG W ， W A NG Z ， W A NG J ( No r thea st Fo r est r Univer sit ，H a rbin 15 0 040 ，C hina) � A : The pe roida se is o ne o f the inde o f plant str ess ph sio lo g . On t h e ba sis，this a rticle r ese ar che d the ef f ects o f dif f e re nt de ter m inatio n me tho ds � and de ter m inatio n tim e and pH o f bu f f e r and H 2 O 2 co nce nt ra tio no n the per o idas e ac� � � � � � � � � � � tivit � � � � in F � � � � � � � � � � � � � � � � ，P P. ，B ，and S . The a ppro pria � te m e asu r e co nditio � ns a re as f o llo s: The ra nge o f m e asu r ing t im e o f per o idase is f ro m 0 60 s and the co ncent ra � tio n o fH 2 O 2 is f ro m 0.5 % 2 % and pH is 5 .7 7.0 . The m e tho do f ben ieine is m o r e sensit ive tha n tha to f gu aiaco l. C � o nclu sio � ns o bta � ined pr o vide a basis � f o r dete rm inat io no f se ver al kinds o f ph sio lo g ite m s b u sing the sa m e e tr act and ha ve ce rt ain r ef er entia l valu e f o r pla nts ph sio lo gical e pe rim ent al t eaching a nd re sea rch . K : pe roida se; a ctivit o fen m e ; gu a iaco l; be n idine
愈创木酚法测定过氧化物酶活性（准确,无误）
愈创木酚法测定过氧化物酶活性一、实验目的过氧化物酶它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握愈创木酚法测定过氧化物酶。
二、实验原理在过氧化物酶（POD）催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。
此产物在470 nm处有最大光吸收值，故可通过测470 nm 下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。
三、实验材料马铃薯块茎。
四、设备与试剂分光光度计，离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。
0.05 mol·L的磷酸缓冲液（pH 5.5）；0.05 mol·L愈创木酚溶液；2％H2O2；20％三氯乙酸五、实验步骤（一）酶液的制备取1.0～5.0 g 洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。
将匀浆液全部转入离心管中，于3000×g离心10 min，上清液转入25 mL容量瓶中。
沉淀用5 mL 磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。
（二）过氧化物酶活性测定酶活性测定的反应体系：依次加入2.9 mL 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液；1.0 mL 2％H2O2；1.0 mL 0.05 mol·L-1愈创木酚和0.1 mL 酶液。
用加热煮沸5 min 的酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即于34℃水浴中保温3 min，然后迅速稀释1 倍，470 nm 波长下比色，每隔1 min 记录1次吸光度A470，共记录5次，然后以每分钟内A470变化0.01 为1 个酶活性单位（U）。
六、实验结果以每分钟内A470变化0.01 为1 个过氧化物酶活性单位（U）。
△A470 ×VT过氧化物酶活性(U·g-1·min-1)=──────W×VS×0.01×t式中：△A470——反应时间内吸光度的变化；W——马铃薯鲜重（g）；t——反应时间（min）；VT——提取酶液总体积（mL）；VS——测定时取用酶液体积（mL）。
植物组织中超氧化物歧化酶活性测定
植物组织中超氧化物歧化酶活性测定植物组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定是一项重要的生物化学实验，它有助于了解植物体内抗氧化系统的运行机制及其在应对环境压力中的作用。
以下是测定植物组织中超氧化物歧化酶活性的实验步骤和注意事项。
一、实验材料1.实验植物：选择新鲜、健康的植物组织，如叶片、根或茎。
2.实验试剂：包括磷酸缓冲液（pH 7.8）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氮蓝四唑（NBT）、核黄素、酶提取液等。
3.实验设备：包括分光光度计、离心机、研钵、试管、滴定管等。
二、实验步骤1.酶提取：将植物组织研碎，加入适量的酶提取液，充分研磨并混合均匀，然后置于离心机中以3000-4000 r/min的速度离心10-15分钟，得到清亮的上清液。
2.酶活性测定：取3毫升磷酸缓冲液、0.1毫升的EDTA、0.1毫升的氮蓝四唑（NBT）、0.1毫升的核黄素和0.002毫升的酶提取液，混合均匀后用分光光度计在560纳米处测定吸光度。
3.空白对照：取3毫升磷酸缓冲液、0.1毫升的EDTA、0.1毫升的氮蓝四唑（NBT）和0.1毫升的核黄素，混合均匀后用分光光度计在560纳米处测定吸光度。
4.数据记录：记录酶活性测定和空白对照的吸光度值，并计算超氧化物歧化酶活性。
三、注意事项1.实验过程中要保证所用试剂的纯度和新鲜度，避免影响实验结果。
2.离心机使用前应预热，保证离心的效果和效率。
3.在酶活性测定中，加入酶提取液时应十分小心，避免产生气泡，影响吸光度的测定。
4.在整个实验过程中要保证温度、光照等环境因素的一致性，以减小误差。
5.在数据处理时，应按照公式计算超氧化物歧化酶活性，并进行统计分析和比较。
四、结果分析通过对实验数据的分析，可以得出不同植物组织中超氧化物歧化酶活性的大小及其变化规律。
这些数据可以帮助我们了解植物体内抗氧化系统的运行机制及其在应对环境压力中的作用。
例如，当植物受到逆境条件的影响时，超氧化物歧化酶的活性可能会发生变化，通过比较不同植物组织的超氧化物歧化酶活性，可以筛选出抗逆性较强的植物品种，为农业生产提供参考。
第二章实验十一植物中过氧化物酶活性的测定
酶活力测定：
• 打开光度计，预热15分钟左右，并做好比色前的 准备工作。
• 在光径为1cm的比色杯内，依次加入2mL 0.1mol/L 的醋酸缓冲液和1ml 0.25%愈创木酚溶 液（以上溶液可预先放在25~30℃的水浴中）， 0.2 mL（根据反应情况调整）酶液（用加热煮沸 5 min 的酶液为对照），最后加入 0.1mL 0.75% 的过氧化氢溶液（开始计时）。
• 迅速颠倒混匀并立即把比色杯插入比色架，盖上 盖子，每隔 1 min 记录一次在470nm处的吸光度 值，共记录5次。
四、计算
以每分钟光密度变化（以每分钟 OD 470 nm变化 0.01 为 1 个 活力单位）表示酶活性大小
五、注意事项
酶提取需要在低温下进行； 测定酶活力时要保持待测酶液的酶活； 测定酶活力时时注意控制反应时间。
➢ 线粒体：超氧阴离子O·-2，是体内O·-2的主要来 源； O·-2在线粒体中再生成H2O2和·OH。
➢ 过氧化酶体：FAD将从脂肪酸等底物获得的电 子交给O2生成H2O2和羟自由基·OH。
➢ 胞浆需氧脱氢酶（如黄嘌呤氧化酶等）也可催 化生成O·-2。
➢ 细菌感染、组织缺氧等病理过程，环境、药物 等外源因素也可导致细胞产生活性氧类。
红棕色的物质可用分光光度计在 470nm处测定其消光值，即可求出该 酶的活性。
二、实验材料、主要仪器和试剂
酶提取缓冲液：20 mmol/L硼酸缓冲液 （pH 8.8），内含5mmol/L亚硫酸氢钠 （临用前加）
0.1 mol/L 醋酸缓冲液（pH 5.4） 0.25% 愈创木酚（溶于50%乙醇中）溶液
（临用前配） 0.75% 过氧化氢溶液（临用前配）
三、操作步骤
酶液提取：取植物样品0.5 g（表面水分 吸干），剪碎置于研钵中，加入5mL预冷 的酶提取液，研磨成匀浆（冰浴），转入 离心管，再用2mL提取液冲洗研钵，一并 转入10mL离心管，平衡后于10000转/ 分钟离心20分钟（低温）。将上清液倒 入刻度试管或量筒，定容至10mL，插入 冰浴待测。
过氧化物酶活性的测定
实验六 过氧化物酶活性的测定 (比色法)
实验六过氧化物酶活性的测定（比色法）过氧化物酶（peroxidase）是广泛存在于植物、动物和微生物体内的一种酶类。
它可以光催化、热催化或金属离子诱导形式存在。
过氧化物酶具有良好的实用性，因为它可以用于许多领域的生物学研究，例如生物化学、分子生物学和环境科学等领域。
本实验采用比色法测定过氧化物酶的活性，其原理是利用二氧化氢和过氧化氢作为试剂，测量其光吸光度能力。
其中，一种常用的受体是酚类化合物，如4-氨基联苯酚，其产生的有色化合物可以通过反应过程的光谱特性来检测光学密度变化。
实验原理当过氧化物酶在存在过氧化氢的情况下催化苯酚型受体的氧化反应时，产生的产物可在可见光区域吸收电磁能，并产生有色化合物。
比色法即是利用这种能力来检测催化作用在反应中的过氧化氢的活性。
该实验中，使用4-氨基联苯酚作为受体，在pH为6.0的琼脂糖基质中，在340nm处测量反应混合物的吸光度变化。
反应的一侧为过氧化氢，另一侧为受体，过氧化氢在过氧化物酶的催化下，氧化受体，产生的有色产物吸收可见光，从而形成比色反应。
过氧化氢的亲电性较大，能够与生物的活性系数发生相互作用。
因此，过氧化物酶的测量能力可以作为生物活性系数的一个指标。
实验材料1. 4-氨基联苯酚2. 过氧化氢4. 磷酸盐缓冲液（pH6.0）5. 琼脂糖实验步骤1. 将500μL的催化过程反应液与250μL的4-氨基联苯酚、250μL的磷酸盐缓冲液和50μL的琼脂糖混合，制备琼脂糖基质。
2. 分别添加20μL、40μL、60μL、80μL和100μL的过氧化物酶，混合后立即测量其吸光度。
3. 测量样品的吸光度变化，记录5次实验结果。
实验结果分析计算出反应液的吸光度，并绘制反应液中过氧化物酶催化下4-氨基联苯酚氧化反应过程的浓度关系曲线。
因为过氧化物酶的催化效率与其浓度成正比，所以可以用这种曲线来确定反应液中的过氧化物酶浓度。
实验注意事项1. 实验中的4-氨基联苯酚是有毒的，应严格遵守安全操作规程。
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植物体内过氧化物酶活性的测定
一、目的
过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控IAA水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的H2O2的毒害作用。
故在科研上常加以测定。
二、原理
在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色4－邻甲氧基苯酚，在470nm波长处测定生成物的吸光度（A）值，即可求出该酶活性。
三、材料、仪器设备及试剂
1. 材料：植物叶片
2. 仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。
3. 试剂及配制：
0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH7）。
反应液（100ml 0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH6）中加入0.5ml 愈创木酚、1ml 30﹪H2O2，充分摇匀）。
四、实验步骤
1. 酶液提取
称取植物叶片1g，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为1 0ml
pH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在8000 r / min离心15min，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。
2. 酶活性测定
吸取反应液3ml 于试管中，加入酶提取液0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径1cm的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在470nm波长处，以时间扫描方式，测定3min内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度变化值（△A47 0）。
五、酶活性计算
按下式计算酶的相对活性
△A470 ×酶提取液总量（ml）酶活性（△A470·g－1Fw·min－1）= ———————————————————
样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml）。