农杆菌转化法基本操作与理论PPT课件
农杆菌转化法的操作步骤
农杆菌转化法的操作步骤农杆菌转化法呀，这可是个很有意思的技术呢！咱就来说说它的那些步骤。
先得准备好你的受体材料，就像厨师要准备好食材一样。
这受体材料可以是植物的各种部位，比如叶片啦、茎段啦等等。
你得把它们弄得干干净净、健健康康的，这样农杆菌才愿意和它们亲近呀！然后呢，就是要培养出厉害的农杆菌啦。
这些小家伙们可是转化的关键呢！把它们放在合适的培养基里，让它们茁壮成长，就像养孩子一样精心照料。
等农杆菌长得壮壮的了，就该让它们和受体材料来个亲密接触啦。
把受体材料泡在农杆菌的培养液里，就好像让它们一起洗个澡。
这时候啊，农杆菌就会悄悄地把它们的遗传物质传递给受体材料啦，是不是很神奇？就好像是在偷偷地传递秘密一样。
接下来可不能大意哦！要给它们创造一个合适的环境，让转化能够顺利进行。
温度呀、湿度呀都要控制好，可不能让它们受委屈了。
经过一段时间后，就得检查检查转化的效果啦。
看看受体材料有没有成功地接受了农杆菌带来的新遗传信息。
这就像是考试看成绩一样，紧张又期待呢！要是转化成功了，那可真是太棒啦，就好像中了大奖一样开心。
要是没成功呢？别灰心呀，咱再来一次！就像走路摔倒了，爬起来继续走一样。
多试几次，总会成功的嘛！你说这农杆菌转化法像不像一场奇妙的冒险？每一步都充满了未知和惊喜。
它能让我们把一些好的基因导入到植物里，让植物变得更优秀、更强大。
这多有意思呀！就好像我们是植物的魔法师，能赋予它们神奇的力量。
而且哦，通过农杆菌转化法，我们可以培育出各种各样有特殊功能的植物呢！比如抗病虫害的呀，或者能生产特殊物质的呀。
这对农业、对我们的生活都有着很大的意义呢！所以呀，大家可别小看了农杆菌转化法，它可是个很厉害的技术呢！好好掌握它，就能为我们的生活带来很多的好处和惊喜哟！。
农杆菌介导转化法
它是利用根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌的Ri 质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染植物形成 肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并 插入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的 遗传转化特性,可将外源基因置换T-DNA中的非 必需序列即可使外源基因整合到受体染色体而获 得稳定的表达。
T-DNA区含选择标记基因＋报告基因
农杆菌介导转化法
转基因植物
一、植物转基因技术
• 植物转基因技术是生命科学前沿的重要领域之一。 它是指用人工分离和修饰过的外源基因通过载体、 媒体或其他物理、化学方法导入植物细胞中并得
到整合和表达，并通过对转化植株的鉴定选择，
从而使其遗传性状发生改变的技术。创造出人类
所需要的新品种或新物种。
目的基因的分离和克隆 克隆基因的鉴定与分析
报告基因 选择标记基因
遗传转化预备实验使用载体的T-DNA区
选择标记基因（npt－Ⅱ，hpt）确定选择用抗生素类型，报告基
因（gfp,gus)可以通过快速鉴定，迅速确定材料是否能够表达外源报 告基因，及其统计转化效率，获得最佳诱导因素的梯度，从而优化 目的基因的转化条件，之后进行目的基因转化。 gus基因的表达产物可以与化学试剂发生蓝色反应；gfp基因产物 直接在蓝光下或紫外光下发出绿色荧光。
待改良植物的预处理 受体细胞系统建立
目的基因载体构建
植物细胞的遗传转化 目的基因在受体细胞的整合与表达 转化细胞克隆的筛选 转基因植株的获得与分子鉴定
田间性状鉴定
育成转基因植物新品种
二、植物基因转化方法
（一）外源基因的间接转化法（载体介导法） 农杆菌介导法（双、单子叶植物） （二）外源基因的直接转化法 物理法诱导DNA直接转化： 基因枪法(单子叶植物 )、显微注射 化学诱导DNA直接转化： PEG(原生质体） （三）花粉管通道法介导基因转化（种质系统介导法）
实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥课件
05
CATALOGUE
实验总结
实验收获与体会
掌握了农杆菌转化法的基本 原理和操作流程。
了解了烟草和拟南芥作为实 验材料的优缺点。
02
01
03
学会了如何进行抗性筛选和 分子检测验证转基因植株。
培养了实验操作技能和团队 合作精神。
04
05
等方法进行评估。
表型分析对于筛选具有优良性状的转基 因植株具有重要意义。
转化细胞的遗传稳定性分析
转化细胞的遗传稳定性分析是评估转 基因植物遗传物质稳定性的重要步骤 。
一般情况下，经过多次繁殖后，转化 细胞或转基因植株仍能保持稳定的遗 传特性，则认为遗传稳定性较好。
通过连续繁殖转化细胞或转基因植株 ，并定期进行PCR检测和表型分析， 可以观察遗传物质的变化情况。
其他试剂
如抗生素、质粒 DNA等。
农杆菌转化烟草和拟南芥
01
02
03
04
将外源基因克隆到农杆菌的质 粒载体上。
将重组质粒转化到农杆菌中。
将农杆菌接种到植物受体材料 上。
在培养条件下培养植物受体材 料，使农杆菌与植物细胞相互
作用并导入外源基因。
基因枪法转化植物细胞
胞，促 进其再生和表达外源 基因。
实验原理
植物基因工程简介
植物基因工程是通过改变植物 的遗传物质来改良植物性状的 一门科学。
它利用基因工程技术将外源基 因导入植物细胞，并在植物细 胞内表达，从而获得具有优良 性状的转基因植物。
植物基因工程的应用范围广泛 ，包括抗虫、抗病、抗除草剂 、提高产量、改良品质等。
农杆菌的特性
农杆菌是一种土壤细菌，属于根瘤菌科。
根癌农杆菌
根瘤菌科，农杆菌属
（Agrobacterium）：
——革兰氏阴性菌，侵染植物伤口进 入细胞后，将T-DNA插入植物基因 组中，导致植物产生冠瘿瘤或毛状 不定根，干扰植物的正常生长
－根癌农杆菌（A. tumefaciens）
Ti质粒(tumor-inducing plasmid) （广泛使用）
纯化和稳定遗传 －不需要特殊的专用设备
缺点： －只能以T-DNA插入的方式导入寄主细胞，没
有方向性
33
也称微弹轰击法：将外源DNA包 被在微小的金粒或钨粒表面，然后 在高压的作用下微粒被高速射入受 体细胞或组织。微粒上的外源 DNA进入细胞后，整合到植物染 色体上，从而实现基因的转化。
可将基因枪分为三种类型： 第一类是以火药作为动力； 第二类是以高压气体作为动力； 第三类是以高压放电作为动力。
14
杀虫晶体蛋白的杀虫作用机理
当昆虫吞食后，ICP在昆虫中肠的碱性消化液和胰蛋 白酶作用下，变成有活性的毒蛋白，并与昆虫中肠 上皮细胞上的特异性受体结合，全部或部分嵌合于 细胞膜中形成离子通道，造成膜穿孔，细胞渗透平 衡受到破坏，代谢终止，昆虫停止进食，最后脱水 死亡。
由于ICP要形成有活性的毒蛋白，必须同时具备碱性 条件和特定的蛋白酶才能产生，因此人畜不受影响。
34
基因枪
35
1) 提高植物的农业价值（产量、品质、抗性）和园艺 价值（花色、花形、花期），eg. 抗虫棉、转基因 矮牵牛等；
2) 作为生物反应器生产某些重要蛋白质和次生代谢物 质，eg. 生长激素、干扰素、白介素-2、 乙肝疫苗、表皮 生长因子等；
3) 研究基因在发育及其他生理生化过程与代谢途径中 的作用
13
Bt能杀死宿主昆虫主要靠其芽孢和毒素（杀虫晶体蛋白， Bt）。
农杆菌转化法基本操作与理论ppt课件
二、原理
农杆菌主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌。
根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶 植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤 的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内 表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化 细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增 生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质 粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可 将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植 物遗传转化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”。可以 通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感 染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组 织培养技术，得到转基因植物。
农杆菌介导转化法
生物技术08-1 梁荣洪
1
一、简介
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌， 它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤 部位，并诱导产生冠痪瘤或发状根。根想农杆菌和发根农 杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T—DNA， 农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T—DNA插入 到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转 化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T—DNA区， 借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合， 然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆 菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介 导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应 用。
4
谢谢观看！
5Байду номын сангаас
3
三、操作方法
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大多 数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组 质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/分 子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学 几种方法 进行检验（根据要求选取不同方法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体 进行个体生物学水平鉴定。
农杆菌转化法
DNA 用限制酶剪 去多余部分
素基因、人干扰素基因、
种子贮藏蛋白基因、植
物抗病基因等。
限制酶
目的基因
（一）获取目的基因
——“鸟枪法” （4的不同基因的许多片 段，导入受体菌（如大肠杆菌质不能交换的重重壁
垒，开创了 基因工程。
一.基因工程的发展历程
1.理论与技术的发展
• DNA是遗传物质的证明 • DNA双螺旋结构和中心法则的确立 • 遗传密码的破译 • 基因转移载体的发现 • 工具酶的发明 • DNA合成和测序技术的发明 • DNA体外重组的实现 • 重组DNA表达实验的成功 • 第一例转基因动物问世 • PCR技术的发明
这些定向改造基因 的设想能实现吗？
经过多年的努力，科学家终于在20世 纪70年代创立了可以定向改造生物的 新技术
——基因工程
第一章基因工程 第一节基因工程的概述
一、基因工程的发展历程 1．理论与技术基础的发展 1953 年：沃森和克里克建立了DNA分子双螺结旋构模型。
↓
1957 年：科恩伯格等首次发现 DNA聚合。酶
↓ 1977 年：桑格首次完整基因组的测序工作。
2．重组DNA技术的发展 (1)1972年科学家伯格等实验。 ①过程：
猿猴病毒SV40的DNA
↑
同一种限制性核酸内切酶DN―A―连→接酶重组的杂种DNA分子
↓
λ噬菌体的DNA
②成就：世界上首次DNA分子 体外重组 。
(2)1973年科学家科恩等实验。
思考2：
1.如果要想获得某个特定性状的基因必须要 用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？
要切两个切口，产生四个黏性末端。
2. 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制 酶来切割，会怎样呢？
农杆菌转化法介绍
农杆菌感受态制备与转化普通农杆菌感受态制备与转化：方案一1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。
2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。
3. 5k rpm离心5分钟。
4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。
5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。
如不是马上使用，可以将之按200ul分裝储存于-80℃待用。
6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。
7. 液氮中冷冻1分钟。
8. 37℃水浴溶化细胞。
9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。
10.离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。
11.涂板，28℃培养2-3天。
电转农杆菌感受态细胞制备与转化方案二1. 挑取单克隆接种于2mlYEP（含50mg/l链霉素）液体培养基，28℃，250rpm，振荡培养过夜。
（如用5mlYEP，需培养36h）2. 将菌液按1:100转移至200mlYEP（含50mg/l链霉素）培养液中，28℃，250rpm，振荡培养至OD=0.3(约4~5h)。
3. 转入50ml的无菌离心管，4℃，4000rpm离心10min，弃上清。
4. 用20ml冰浴的HEPES(1mM，PH-7.0)重悬。
5. 4℃，4000rpm离心10min，弃上清。
6. 重复4、5步骤2~3次。
7. 用2ml冰浴的10％甘油重悬。
8. 每管100ul1.5ml无菌的Eppendorf管中，-70℃保存。
1mM HEPES的配制：称取0.119gHEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500ml，用NaOH调pH至7.0，灭菌后待用。
注：HEPES需现用现配。
电击法转化农杆菌感受态细胞1. 取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融。
2. 加2μl质粒DNA于100μl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀。
水稻农杆菌转化方法
方法1NB基本培养基(右边的为N6,大量相同,加glycine甘氨酸2 mg/L)KNO3 2830 mg/L(NH4)2SO4 463 mg/LKH2PO4 400 mg/LMgSO4.7H2O 185 mg/LCaCl2.2H2O166 mg/LFeSO4.7H2O 27.8mg/L 5.6Na2EDTA 37. 5 mg/L 7.5MnSO4.4H2O 10 mg/L 27.8H3BO3 3 mg/L 1.6ZnSO4.7H2O 2 mg/L 1.5Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L 0.25CuSO4.5H2O 0.025 mg/L 0.025CoCl2.6H2O 0.025 mg/L 0.025KI 0.75 mg/L 0.8盐酸硫胺素thiamine CHL VB1 10 mg/L 0.1盐酸吡哆醇pyridoxine-CHL VB6 1 mg/L 0.5烟酸nicotinic acid 1 mg/L 0.5肌醇myo-inositol 100 mg/L 100水解酪蛋白300 mg/L谷氨酰胺500 mg/L脯氨酸500 mg/L蔗糖30,000 mg/LPHytagel 2.6 mg/LpH 5.8Basic培养基B N6（大量）50ml （20倍）A Ms-Fe盐10-20ml（100倍）CH 0.3g/LS B5 macro 10ml （100倍）phytogel 4g/L或agar 8g/L I B5 vita 10ml （100倍）sucrose 30g/LC proline 0.5g/L glutamine 0.5g/LN6 (大量梗稻种子) 终浓度母液(20倍) 终浓度母液(20倍)培KNO32830mg/L56.6g/L Mg SO4.7H2O185 mg/L 3.7 g/L养(NH4)2SO4463 mg/L9.26 g/L CaCl2.2H2O 166 mg/L 3.32 g/L基KH2PO4400 mg/L8.00 g/L制备1 KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌, 使之完全溶解.2 Mg SO4.7H2O 先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅, 不能有沉淀.3 CaCl2.2H2O的配制同Mg SO4.7H2O4 配好后放于棕色瓶4℃保存MS(大量籼稻种子)终浓度母液(20倍) 终浓度母液(20倍)培KNO31900 mg/L38g/L Mg SO4.7H2O 370 mg/L7.4 g/L养NH4NO3 1650 mg/L33 g/L CaCl2.2H2O 440 mg/L8.8 g/L基KH2PO4170 mg/L 3.4 g/L制备1 KNO3, NH4NO3, Mg SO4.7H2O同时倒入烧杯,加水搅拌2 KH2PO4先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅,3 CaCl2.2H2O同KH2PO44 配好后放于棕色瓶4℃保存Ms(大量花药用)终浓度母液(20倍) 终浓度母液元素KNO32830mg/L56.6g/L Mg SO4.7H2O 370 mg/L7.4 g/L培养(NH4)2SO4 231 mg/L 4.62 g/L CaCl2.2H2O 160 mg/L3.2 g/L基KH2PO4641 mg/L12.82 g/L制备1 KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌2 Mg SO4.7H2O 先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅,不能有沉淀.CaCl2.2H2O的配制同Mg SO4.7H2O3 配好后放于棕色瓶4℃保存YM脓杆菌培养基KH2PO4 0.5g/L Mannitol 10g/L L-Glutamine2g/LNaCl 0.2g/L M g SO40.2g/L Yeast extract0.3g/LAgar 15g/L PH=7.0诱导愈伤、继代培养基basic+2,4-D(2mg/L) PH=5.8共培养培养基液体:N6(大)+Fe+B5(micro)+B5(vita)+ sucrose(前四项与basic相同)+ 肌醇2g/L+ CH500mg/L+phytogel+0.1%AS固体:N6(大)+Fe+B5(micro)+B5(vita)+ sucrose(前四项与basic相同) + 肌醇2g/L+ CH500mg/L+2,4-D (2mg/L)+ phytogel +0.1%ASPH=5.5 加2,4-D前后都要调PH值.灭完菌,温度降下来后加AS筛选培养基诱导愈伤+cef(300mg/L)+hyg(50mg/ml) PH=5.5一筛,二筛的cef,hyg的浓度依次逐渐下降分化1: basic+KT(4mg/L)+NAA(0.25mg/L)+cef(300mg/L)+hyg(50mg/L)培养2: basic+KT(0.5mg/L)+NAA(0.25mg/L)+6-BA(2mg/L)+cef(300mg/L)+hyg(50mg/L)基PH=5.8分化培养基NB培养基：6-BA,2.5mg,NAA,0.25mg,KT,0.5mg壮苗培养基(生根)sucrose 30g/L N6 25ml/L MS-Fe盐10ml/LB5vita 10ml/L agar 7g/LMS-Fe盐(必须单独配制,否则会沉淀,用鳌合铁)终浓度母液(100倍)FeSO4.7H2O 27.8mg/L 2.78g/LNa-EDTA 37.5mg/L 3.75g/L制备1 FeSO4.7H2O溶解于水, Na-EDTA溶解于热水,将两者混合定容,于微波炉中加热,煮沸,颜色变深,冷却到室温,补水, 棕色瓶4℃保存2,4-D母液(1g/ml) 用无水乙醇溶解2,4-D后缓慢加入到H2O中,搅拌,如产生沉淀,则重配.配好后4℃保存NAA母液(1g/ml) 用1N KOH 溶解NAA,用水稀释定容, 4℃保存PAA母液(1g/ml) 用无水乙醇溶解加H2O搅拌,定容,4℃保存6-BA母液(1g/ml) 用HCl溶解, 加少量HCl后,用玻棒研磨成糊状,再加HCl使之完全溶解AS（乙酰丁香酮）用DMSO直接溶解定容19.62mg/ml,分装到无菌小管KT 母液(5mg/ml)用1NKOH溶解，用水稀释定容到10ml，过滤灭菌后分装到EP管中，冰冻保存B5 vitamin终浓度母液(100倍) 终浓度母液(100倍)肌醇100mg/L 10g/l Nico-acid 1mg/l0.1g/lpyrido(B6) 1 mg/L 0.1 g/l thiamin(B1) 10 mg/L1 g/l棕色瓶4℃保存(每次配100ml为好), 肌醇在配培养基时,加入到培养基中B5(micro)KI 0.75mg/L H3BO3 3.0mg/L MnSO4 10mg/L ZnSO4 2.0mg/LNa2MnO4.2H2O 0.25mg/LCuSO40.025mg/L CoCl20.025mg/L程序1.种子去皮，挑成熟完整健康的种子2.用70%乙醇清洗浸泡2-3分钟，洗3-4次，用0.1%升汞浸泡20-40分钟3.无菌水洗3至4次4.置于虑纸上吹干,吹3小时以上5.摆放到诱导愈伤培养基上，黑暗中培养15-20天，直到长出黄色较大的愈伤6.剥下愈伤，转至继代培养基上，黑暗培养2周7.共培养。
农杆菌介导转化法
Table1 Summary of vir Gene Products
Locus
Size(kb)
ORFsa
Proteins Size(kDa) Locationb
Function
virA
2.0
1
90
M
plant signal sensor, protein kinase
VirG
1.0
1
30
VirD
冠瘿碱分解区
冠瘿也是在冠 瘿碱胞内合并 成分泌出来的, 被冠瘿碱分解 基因分解成根 癌农杆菌生长 所须的碳源和 氮源。
Agrobacterium-mediated transformation
Advantages: 1. Cleaner inserts 2. Higher co-expression 3. More flexible in tissue types(in planta transformation)
缺失研究也表明：右边界重复序列缺失后，T-DNA不能转移， 而左边界重复序列的缺失会稍稍降低T-DNA转移频率 (Timmerman B．1988)，这进一步说明T-DNA单链是在从右 边界到左边界5’向3‘替换合成中释放出来的。
右边界的缺失，使得DNA合成不能起始，因而T-DNA不 能释放，所以T-DNA不能转移到植物细胞。而左边界的 缺失，仅会影响DNA合成过程的终止，可能会降低导致 T-DNA单链释放，而不会明显影响T-DNA单链的形成。
长度：160-250 kb 6大功能区： 1)致癌区，这个区主要合成植物
生长素和细胞分裂素； 2)冠瘿碱合成区； 3)冠瘿碱分解区； 4)Ti质粒接合转移区(tra)； 5)毒性区（Vir）； 6)DNA复制区（Re侧 存在着一个24 bp直接重复序列， 由这三部分所构成的DNA区域叫 做T-DNA， 插入植物染色体中的Ti质粒片段 只有T-DNA。 由于T-DNA插入植物细胞染色体 中的位置不相同的，因此植物染 色体上可能并没有可供T-DNA插 入的专一性DNA序列。
农杆菌介导的转化方法PPT学习教案
农杆菌介导的转化方法
会计学
1
① Ti质粒
存在于能引起植物形成冠瘿瘤的农杆菌中，诱导双 子叶冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）。
第9页/共10页
④农杆菌转化的方法
1、共培养法
包括原生质体共培养、悬浮细胞共培养和愈伤组织共培养。
2、叶圆盘法 3、活体接种法
第6页/共10页
1.共培养法
The co-integration method
第7页/共10页
2.叶盘转化法
农杆菌共培养侵染 愈伤组 织 分化生 芽
生根
第8页/共10页
3 . 活 体 接 种 法
第三步 毒性基因（vir）表达 virA、virG、virD、virB…
第四步 T-DNA转移 T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞 核里，整合到植物基因组中。
第五步 诱导冠瘿瘤
T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和 细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。
第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。
第5页/共10页
根瘤
第1页/共10页
第2页/共10页改造后的Ti质粒载体模式Fra bibliotekori
第3页/共10页
4
② 农杆菌的感染和生存
第一步:植物受伤
植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁 香酮、羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上 的毒性基因表达。
第二步 感染植物
农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎 的基部）。
第4页/共10页
农杆菌直接转化法：冻融法
Ⅲ、农杆菌直接转化法：冻融法一旦预期的分子在大肠杆菌中被构建，该分子可通过冻融法直接转化入土壤农杆菌中。
尽管与三亲杂交法相比，冻融法转化的效率仅为103个转化子/mgDNA，但该法是可靠快速的。
该法也可以去除三亲杂交法造成的质粒重排现象。
1、含有辅助Ti质粒的农杆菌单菌落（2-3mm）接种于5mlYEP培养基中，28℃过夜培养；2、取1ml过夜培养物于含有100mlYEP的250ml三角瓶中，并在28℃下，剧烈振荡（250rpm）培养至OD值为0.5-0.6；3、取50ml培养物置于冰上冷却5min，4℃，5000rpm，离心5min；4、A、弃去上清液，用1ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬沉淀菌体，分装重悬物于Eppendorf小试管内（0.1ml/管），用于后续试验；B、弃去上清液，用1ml冰冷的0.1MCaCl2溶液重悬沉淀菌体，分装重悬物于Eppendorf小试管内（0.1ml/管），并添加15%的甘油，液氮速冻后，-80℃保存；5、A、直接取分装后的感受态农杆菌（0.1ml/管），加入1-2μg的质粒，轻轻混匀；B、取-80℃保存含感受态菌株的Eppendorf小试管一支，在冰上融解后，加入1-2μg的质粒，轻轻混匀；6、冰上放置30min，再用液氮速冻5min；7、将小管放于37℃水浴中5min，融解细胞；8、加入1mlYEP培养基于试管内，28℃，200rpm，振荡培养2-4h。
该过程使得菌体表达抗生素抗性基因；9、4℃，5000rpm，离心30s，弃去上清液，再用0.1mlYEP培养基重悬沉淀细胞；10、涂布重悬物于含有20μg/mlRif和50μg/mlKanamycin的YEP平板上，28℃共育。
2-3d后转化克隆出现。
农杆菌转化法原理
农杆菌转化法原理
农杆菌转化法是一种基因工程技术，旨在将外源DNA导入到细胞中。
该技术依赖于一种常见的土壤细菌——农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）。
通常，科学家会将感兴趣的基因片段插入到受体细胞的DNA序列中，以改变或增强某种特定的细胞功能。
然后在农杆菌的生长环境中，将感兴趣的细胞处理并浸泡其中，使细胞与农杆菌之间发生交互作用。
细胞的表面会释放出一种称为癌腔菌毒素（virulence toxin）的物质，该物质可将农杆菌的DNA序列整合到受体细胞的DNA 序列中。
当细胞分裂和繁殖时，克隆DNA序列也会被复制并遗传到下一代细胞中。
通过这种方式，农杆菌转化法可以修改生物细胞的DNA
序列，从而实现特定的性状改变和功能增强。
农杆菌转化原理及技术PPT课件
精选ppt课件最新
9
根癌农杆菌通过基因转化把T-DNA上的基 因导入植物细胞并整合到核DNA上。
精选ppt课件最新
10
Biology of A. tumefaciens
Well known to induce crown gall tumor
A.tumefaciens lives around root surfaces (in rhizosphere) where it using nutrients that leak from the root tissues
精选ppt课件最新
11
Produce callus transform callus stimulate shooting by cytokinin addition
+ cytokinin
This procedure is easy for dicotyledone plants
(legumes etc)
C ell division
精选ppt课件最新
13
农杆菌介导转化水稻的方法
精选ppt课件最新
14
水稻（籼稻）根癌农杆菌转化技术流程
愈伤诱导
NB培养基为基 本培养基加入相 应植物生长调节
剂
共培养
整个操作过 程约需8天
第一天（预培养） 第三天（划菌） 第五天（侵染、共培养) 第八天（脱菌、筛选）
抗性愈伤的筛选与 再生成完整植株
精选ppt课件最新
12
Agrobacterium tum efaciens
Ti plasm id w ith the new gene
+
cell’s DNA
A g ro b a cteriu m
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
三、操作方法
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大多 数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组 质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/分 子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学 几种方法 进行检验（根据要求选取不同方法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体 进行个体生物学容来源于网络， 如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！
农杆菌介导转化法
生物技术08-1 梁荣洪
一、简介
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌， 它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤 部位，并诱导产生冠痪瘤或发状根。根想农杆菌和发根农 杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T—DNA， 农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T—DNA插入 到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转 化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T—DNA区， 借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合， 然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆 菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介 导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应 用。
二、原理
农杆菌主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌。
根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶 植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤 的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内 表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化 细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增 生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质 粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可 将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植 物遗传转化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”。可以 通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感 染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组 织培养技术，得到转基因植物。