PCR、载体构建及转化

合集下载

引物设计和载体构建知识点

引物设计和载体构建知识点引物设计和载体构建是分子生物学中重要且基础的实验技术，它们在基因克隆、基因组编辑等方面起到了不可替代的作用。

本文将对引物设计和载体构建的相关知识点进行介绍。

一、引物设计引物是指在PCR等实验中用于扩增特定DNA片段的短寡核苷酸序列。

一个好的引物设计能够确保PCR扩增的特异性和高效性。

1. 引物长度引物的长度通常在18-30个碱基对之间，过短的引物可能导致扩增非特异性产物，而过长的引物则可能降低扩增效率。

2. 引物序列引物序列应该与目标DNA片段的序列互补，并且避免二聚体和头部稳定性等问题。

同时，还要注意避免引物内部和引物之间的序列相互互补。

3. 引物的Tm值引物的Tm值是指引物与目标DNA片段结合的解离温度。

引物的Tm值应该在50-65摄氏度之间，以确保引物的特异性和高效性。

4. 引物的GC含量引物的GC含量直接影响引物的稳定性和特异性。

过高或过低的GC含量可能导致非特异性扩增产物的生成。

通常情况下，GC含量在40-60%之间较为理想。

二、载体构建载体是指在基因工程中用于携带外源DNA片段并将其导入到宿主细胞中的分子。

载体构建是基因克隆和基因组编辑等实验的基础。

1. 选择合适的载体选择合适的载体是载体构建的第一步。

常用的载体包括质粒、病毒和噬菌体等。

根据实验需要选择合适的载体，例如质粒常用于DNA片段的克隆和表达，而病毒则常用于基因传递和基因治疗。

2. 载体的线性化和限制酶切线性化载体有助于DNA片段的插入和连接。

通过使用适当的限制酶对载体进行切割，生成具有完整黏性末端的线性载体。

3. DNA片段的连接将目标DNA片段与线性载体进行连接，一般采用DNA连接酶或者DNA ligation kit。

连接后的载体能够稳定地携带外源DNA片段。

4. 载体的转化和筛选将构建好的载体导入到宿主细胞中，通过培养基中的选择性抗生素或者其他筛选方法选择具有外源DNA片段的转化子。

总结：引物设计和载体构建是分子生物学实验中的重要环节，它们对于基因克隆、基因组编辑等研究具有重要意义。

构建真核表达载体和融合载体经验pcr

此方法可能很多师兄师姐们都在用，只是当时的确没有找到相关的详细说明，学弟再次把自己摸索出来的一点心得写出来，高手就多多指正，没做过的就相互学习下，见笑）由于课题组所需，我需要构建数量可观的真核表达载体和融合载体起初我也查到相关菌落PCR的文献，和导师商量，导师一口回绝了他的理由和我所搜集到的理由一样：假阳性我们实验室一博士师姐需要做一个真核表达载体挑选了60个菌落，运用目的基因的上下游引物做PCR，出来条带的有有52个按照经验选取比较亮的14个提取质粒，酶切和PCR双鉴定结果仅有一个为阳性克隆，其余均为假阳性（假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片段）也难怪老板一口回绝只是我需要做的基因太多，最凶猛的时候我一个星期要用两个200次的TianGen的质粒小提，累死人不偿命后来我自己对着图谱研究了一下（我所使用的是pCDNA3.0载体、pCDNA3.1 myc his C载体和pEGFP载体）.0的MCS两端有T7和SP6如果我用T7和SP6作为引物，则1.P出大小约150bp的片段，则为MCS序列，无插入片段2,若有插入片段，则应该为目的大小+152bp如下图所示：后再改进为T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6 因为即使用T7+SP6证明有插入但也不能确定为目的片段这样既解决了假阳性也解决了基因的特异性问题如下图：总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-RpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合2.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中37°C 200rpm摇床摇2-4小时以上（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3.菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4.pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度5.模板的量：1-2ul未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）6.退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C 或者58°C完成T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P出目的条带7.循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来8.预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步以上就是学弟的一点个人经验，绝大部分经过自己的验证，如有觉得不妥的地方还请大家多多指正！再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇！！！P.S. 通过长时间的魔鬼试验进程，我现在基本可以做到用肉眼高精度的识别菌落，一般挑取的菌落90%以上均为阳性菌落，所以这篇文章暂时定位于小鸟级别的分生试验者，老鸟。

载体构建流程

载体构建SOP流程:GenBank查询目的基因序列→根据ORF序列利用引物设计软件设计引物→表达目的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取目的基因→酶切目的基因和载体→分别纯化酶切的目的基因和载体并建立连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒I.获取目的基因/序列片段一.获取序列信息通过GENBANK数据和生物信息的方法设计目的基因或目的片段引物（shRNA、miRNA）。

PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

②产物不能形成二级结构。

③引物长度一般在15~30碱基之间。

④ G+C含量在40%~60%之间。

⑤碱基要随机分布。

-⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。

⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。

⑧引物5′端可以修饰。

⑨引物3′端不可修饰。

⑩避免在引物的3’端使用碱基A。

在实际设计引物中由于ORF两末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。

过长的引物不容易打开其二级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物二聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。

过短的引物特异性差，扩出其它不相关片段，最终很难得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。

要将目的基因定向克隆至相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能力大大降低，需依据NEB目录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。

二.制备模板1.分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。

高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。

RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。

现在实验室通常使用Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。

Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。

载体构建基本步骤

载体构建基本步骤
载体构建基本步骤
1.选定目的基因，设计特异性引物，利用高保真酶进行PCR扩增
2.对扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测（1%）,若检测结果正确，测
序结果之后进行胶回收目的片段
3.通过平末端连接将目的基因连接到克隆载体（PMD-18T）
4.转化DH5α，根据载体抗性涂板37度过夜培养
5.挑取阳性克隆进行PCR验证，PCR验证后挑取阳性克隆进行大摇并
提取质粒、双酶切，同时取500微升菌液送测序
6.测序结果正确后对提取的质粒进行双酶切回收目的片段
7.对表达载体用同样的限制性内切酶双酶切之后回收大片段
8.将目的片段与表达载体的大片段用T4DNA连接酶连接后转化DH5
α，涂板37度过夜
9.挑取阳性克隆大摇酶切验证，若结果正确，则载体构建完毕。

PCR、载体构建及转化

挑菌
准备工作: 1、提前打开37℃摇床，开紫外灯杀菌。 2、灭菌的带盖的刻度试管，试管架，消毒的黄枪头，镊子，Amp抗性的LB液体培养基。步骤： 1、将Amp抗性的LB液体培养基分装入试管，每管46ml。 2、用黄色的枪头挑白色的单克隆，连带枪头放入试管中。 3、盖上试管盖，置摇床中，37℃，170转摇培过夜（16-18小时）。
1在超净台内将试管中的菌液移入15ml离心管中21000rpm离心10min其间取si和rnase3弃上清留沉淀4每管加入100lsi和rnase04lrnasea浓度为100mgml可提前算好总的si和rnasea用量混匀后分装于离心管中5充分涡旋均匀6计算好sii用量临时将04nnaoh2sds等体积混合于灭菌的三角7每管加入混合好的sii200l轻轻上下颠倒几次dna8插入冰盒中静置5min此时菌液变的清亮粘稠9每管加入siii150l上下颠倒数次此时有白色絮状沉淀出现
引物设计常用软件： DNAstar：序列分析
Primer5.0：引物设计
DNAman：序列比对在线引物设计： http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/
2. 载体构建
T-Vector连接
反应体系： • 2×Ligation Buffer 2.5µl • Inset fraction 1.5µl • T-easy vector 0.5µl • T4-ligase 0.5µl 混匀后置16℃连接0.5- 小时。
蓝白斑筛选：
• 野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。
•设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株，无法作用于X-gal产生蓝色物质。 •操作中，添加IPTG以激活lacz‘中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色（空载）。 •当外源DNA与含lacz‘的载体连接时，会插入进MCS，这种重组质粒不再表达α 肽链，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。

酵母菌表面展示载体构建与转形

酵母菌表面展示载体构建与转形酵母菌表面展示载体构建与转化酵母菌是一种常见的真核生物，被广泛应用于生物研究和工业生产中。

酵母菌的表面展示技术使得我们能够将感兴趣的蛋白质或多肽在酵母菌表面表达和展示，从而实现对其功能和结构的研究。

本文将介绍酵母菌表面展示载体的构建和转化方法。

一、酵母菌表面展示载体构建1. 载体选择与设计在构建酵母菌表面展示载体时，需要选择合适的载体。

常用的载体包括质粒载体和整合载体。

质粒载体多用于表达较小的蛋白质或多肽，整合载体适用于表达较大的蛋白质或多肽。

同时，考虑到表达效率和稳定性，可以选择带有适当启动子和选择标记的载体。

2. 基因插入与融合将目标基因插入到酵母菌表面展示载体的适当位点上，通常采用重组DNA技术。

可以通过PCR扩增目标基因，利用合适的限制酶将其与载体进行连接。

此外，还可以利用基因重组技术将目标基因与适当的表达和分泌信号序列融合，以实现正确的定位和展示。

3. 确定融合表达蛋白的适当域为了实现酵母菌表面展示，需要将融合表达蛋白的适当域与酵母表面展示的域进行连接。

常见的连接方式包括蛋白质N端和C端连接融合，通过引入适当的连接子或限制酶切位点，实现融合蛋白的正确定位和展示。

二、酵母菌表面展示载体转化1. 转化方法选择将构建好的酵母菌表面展示载体转化到酵母菌中，通常采用化学转化或电转化的方法。

化学转化方法适用于体积较小的转化；而电转化方法则适用于大规模转化。

2. 细胞预处理与转化在进行酵母菌转化前，需要对酵母菌细胞进行适当的预处理。

常见的预处理方法包括酵母菌培养、减少细胞数量、调整细胞浓度等。

转化过程中可以加入适当的缓冲液和转化试剂，以提高转化效率。

3. 选择和筛选酵母菌表面展示载体转化后，需要进行选择和筛选从而获得表达目标蛋白质的菌落。

通常可以通过反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)或免疫组织化学技术进行筛选。

同时，还可以利用适当的培养基和选择标记，如抗生素抗性基因，进行选择和筛选。

酵母菌表面展示载体构建及转化

酵母菌表面展示载体构建及转化酵母菌表面展示系统是一种重要的生物学工具，可用于表面展示重要的蛋白质、肽段等分子，以扩大其在不同研究领域的应用。

酵母菌表面展示系统具有许多优势，如易于操作、高效表达、易于纯化等。

因此，构建和转化酵母菌表面展示载体是实施这种系统的关键步骤。

1. 酵母菌表面展示载体构建酵母菌表面展示载体通常由两个核心组成部分构成：酵母表面蛋白的扩大子和目标蛋白的插入序列。

以下是构建酵母菌表面展示载体的一般步骤：1.1 提取酵母菌基因组DNA：使用适当的方法从酵母菌中提取基因组DNA。

可以选择一种高质量的DNA提取试剂盒来确保DNA的纯度和完整性。

1.2 扩增酵母菌表面蛋白的扩大子：根据需要选择具体的表面蛋白扩大子，并使用聚合酶链式反应（PCR）扩增其序列。

需要使用具有相应限制性内切酶切位点的引物。

1.3 准备载体：选择合适的酵母菌表面展示载体，并使用同样的限制性内切酶切位点将其线性化。

线性化的载体将提供插入序列的位点。

1.4 进行反应与连接：将扩增的酵母菌表面蛋白扩大子与线性化的载体进行连接。

这一步可以在体外进行，使用DNA连接酶（例如T4 DNA连接酶）。

1.5 转化大肠杆菌：将连接好的载体导入大肠杆菌，并培养在含有适当抗生素的培养基上，以筛选带有目标载体的菌落。

1.6 纯化载体：从培养的重组大肠杆菌中提取目标载体，并使用DNA纯化试剂盒纯化。

2. 酵母菌表面展示载体转化转化是将目标载体导入酵母菌的过程。

以下是酵母菌表面展示载体转化的常见方法：2.1 胞壁酶处理酵母菌细胞：使用蛋白酶K等酶处理酵母菌细胞，使细胞壁变薄，提高载体的导入效率。

2.2 制备酵母菌细胞的质粒DNA：通过将酵母菌细胞进一步培养扩增，提取质粒DNA，并确保其质量和纯度。

2.3 酵母菌细胞的化学转化：通过将质粒DNA与聚乙二醇（PEG）或锌盐等化学物质一起处理酵母菌细胞，使质粒DNA进入细胞内。

2.4 酵母菌细胞的电转化：使用高压电脉冲将质粒DNA导入酵母菌细胞，通过瞬时破坏细胞壁和细胞膜，使DNA进入细胞。

基因表达载体构建的具体操作流程

基因表达载体构建的具体操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor.I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!基因表达载体构建的操作流程详解基因表达载体的构建是分子生物学研究中的重要步骤，它在基因克隆、蛋白质表达以及基因功能研究等领域发挥着关键作用。

载体构建

载体构建主要步骤:目的片段扩增(PCR) 片段和载体的酶切连接克隆的鉴定一、目的片段的扩增（PCR）PCR体系：（50ul）10×PCR Buffer for KOD –plus- 5ul2mM dNTPs 5ul25mM MgSO4 2ul10mM Primer-R 1.5ul10mM Primer-F 1.5ul模板DNA基因组DNA10-200ng （1-2ul）质粒DNA1-50ng（0.5-2ul）ddH2O up to 50ulPCR程序：（TOYOBO KOD-plus-）一般用三步法：94℃2-10min94℃30s58℃（根据引物具体确定）30s 25-35c68℃1min/kb68℃5-10min10℃forever如果没有条带，可以降低退火温度，如果条带比较多，没有特异条带，或者是弥散的拖带，则可以提高退火温度，退火温度到65℃以上可以尝试梯度PCR，如果还是没特异条带，可以尝试两步法两步法：94℃2-10min94℃30s 25-35c68℃（略延长）1min/kb68℃5-10min10℃forever梯度PCR：94℃2-10min94℃30s65℃（高温）30s 5c68℃1min/kb94℃30s56℃（低温）30s 20-30c68℃1min/kb68℃5-10min10℃foreverPCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，用鼎国生物DNA快速回收/纯化试剂盒回收DNA快速回收/纯化试剂盒回收：1、切取含DNA片段的琼脂糖凝胶块，尽量将空琼脂糖凝胶切去，按重量比1:3加入溶液A（约500ul）2、55℃-60℃溶解10min左右，胶块完全融化即可，其间可以震荡助溶2-3次（干浴锅55℃震荡）3、加入50ul溶液B，混匀（直至颜色变成橙黄色或无色）4、将溶液加入离心柱中，静置2min（溶液冷却至室温即可），6000rpm离心1min（溶液完全过柱即可），若一次加不完，可以分多次过柱5、倒掉收集管中的溶液，向离心柱中加入500ul溶液C（使用前确定已经加入100ml无水乙醇），6000rpm离心30s（溶液完全过柱即可），6、重复步骤57、12000rpm离心1min，甩掉柱子上残余液体8、敞开离心柱放置，使乙醇完全挥发掉（没有酒精味）9、加入适量ddH2O或者溶液D（30ul左右），静置2min，将下面的收集管换成干净的1.5mlDorf管10、12000rpm离心2min，管底溶液即回收的DNA溶液，-20℃储层备用如果需要回收的片段比较小（小于500bp），过柱不易回收到，可以取少量（约2-5ul）电泳确定条带单一后，将剩余PCR产物做酒精沉淀回收酒精沉淀回收：1、扩大沉淀体系，即将剩下的PCR产物加水，例如，剩下48ul左右的PCR产物，可以加452ul水，扩大到500ul2、加入2-2.5倍体积的无水乙醇，混匀3、-20℃放置10-20min4、12000rpm 离心15-30min（回收的DNA较少时，可以延长-20℃放置和离心时间，以及在4℃离心，以提高回收效率）5、倒掉上清液，加入70-75%乙醇，12000rpm离心30s6、重复步骤57、倒掉上清液，真空抽干或者晾干8、加入适量水（30ul左右）溶解DNA，-20℃储层备用二、酶切用NEB公司限制性内切酶酶切切片段和载体，形成黏性末端。

pcr扩增后t载体

pcr扩增后t载体PCR扩增后的T载体是一种常用的分子生物学工具，用于在实验室中进行DNA片段的克隆和基因的表达研究。

本文将详细介绍PCR扩增后T载体的概念、构建方法以及在科研中的应用。

一、PCR扩增后T载体的概念PCR扩增后T载体是一种用于克隆PCR产物的载体，它通过连接PCR扩增产物的末端与T载体的末端序列相互匹配，实现PCR产物的快速克隆。

PCR扩增后的T载体通常包含T载体的启动子和选择标记，方便后续对克隆产物的筛选和表达。

二、PCR扩增后T载体的构建方法PCR扩增后T载体的构建通常包括以下几个步骤：1.设计引物首先根据需要克隆的PCR产物设计引物，使其在扩增产物的末端含有T载体的末端序列。

T载体的末端序列通常为5'-AATTGGGAAAA-3'。

2.进行PCR扩增使用设计好的引物进行PCR扩增，获取所需的DNA片段。

在PCR反应中，可以根据需要添加引物的Pfu酶切位点，便于后续的克隆步骤。

3.准备PCR产物将PCR产物进行电泳检测，确认目标片段的大小和纯度。

如有必要，可进行片段纯化和测序验证。

4.连接T载体序列将PCR产物与线性化的T载体进行连接。

连接反应中，需将PCR产物和T载体按一定比例混合，加入连接酶和缓冲液，进行高效连接。

5.转化宿主细胞将连接产物与宿主细胞（如大肠杆菌）进行转化。

转化后，将转化产物接种到含有选择抗生素的琼脂平板上，筛选并培养阳性克隆。

6.验证克隆基因通过PCR或限制酶切等方法验证克隆基因的存在，并进行测序分析。

确保克隆基因的准确性和完整性。

三、PCR扩增后T载体的应用PCR扩增后的T载体在科研中有着广泛的应用，主要包括以下几个方面：1.基因克隆通过PCR扩增后T载体的使用，可以高效地克隆和表达目标基因。

这为基因功能研究和蛋白质表达提供了方便和快捷的工具。

2.基因组库构建PCR扩增后T载体可以用于构建基因组文库，提供了大规模筛选和鉴定目标基因的手段。

载体构建的基本步骤

载体构建的基本步骤Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT载体构建一、原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒 10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1H2O 7将加好的EP管置于37℃保温1-2h。

（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。

回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。

切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。

5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。

置于温箱，12-16℃，保温8-16h6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。

7、单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。

载体构建的基本步骤

载体构建的基本步骤载体构建是分子生物学研究中不可或缺的过程，它涉及到将目标基因或蛋白质序列移植到不同的载体中，以便扩大其表达量、纯化和研究。

本文将介绍载体构建的基本步骤，包括质粒的选择、PCR扩增、连接和转化等过程。

质粒的选择质粒是最常用的载体类型之一，具有很多优点，如易于扩增、转化和操纵等。

在选择质粒时，需要考虑以下几个方面：1. 质粒大小和拷贝数质粒的大小和拷贝数会影响其扩增和表达，选择适当大小和拷贝数的质粒可以提高表达效率。

2. 基因水平选择标记质粒中常含有基因水平选择标记，如抗生素耐药基因等。

在构建载体时需要选择合适的标记，以便快速筛选到表达了目标基因的细胞。

3. 表达宿主质粒可以在不同的宿主中表达，选择合适的表达宿主可以提高表达效率和纯度。

常见的表达宿主包括大肠杆菌、酵母等。

PCR扩增PCR扩增是将目标序列扩增为质粒中适当长度的过程。

在进行PCR扩增之前，需要准备以下试剂和设备：•Taq DNA聚合酶•原始模板DNA•引物•正向引物和反向引物•dNTP混合物•PCR缓冲溶液在PCR扩增中，需要设置合适的反应体系和程序。

常见的PCR反应条件为：•94℃，5 min：初始变性•94℃，30 s：变性•50-60℃，30 s：退火•72℃，1 min/kb：延伸•72℃，7 min：最终延伸连接连接是将PCR扩增产物与质粒DNA连接的过程。

连接反应需要用到T4 DNA连接酶和DNA PCR产品凝胶提取试剂盒等试剂，具体操作步骤如下：1.将PCR扩增产物切割至合适长度。

2.提取PCR产物，并使用DNA PCR产品凝胶提取试剂盒纯化。

3.连接酶在37℃下反应数小时。

4.连接反应后，在大肠杆菌中进行转化。

转化转化是将连接成功的PCR产物转化为大肠杆菌的过程。

转化需要用到大肠杆菌、新鲜的LB培养基和适当的抗生素等试剂。

常见的转化条件为：80-90秒高温热冲击，加入细胞后在37℃，250rpm振荡培养1小时后添加适宜浓度的抗生素进行筛选。

基因工程步骤

转化受体细胞：将重组DN导入受体细胞
筛选和鉴定：使用分子生物学技术筛选和鉴定克隆成功的细胞
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
CRISPR/Cs9技术：一种高效的基因编辑技术通过引导RN和Cs9蛋白对目标基因进行
切割和编辑
基因敲除：通过CRISPR/Cs9 技术将目标基因敲除研究基
因功能
基因敲入：通过CRISPR/Cs9 技术将目标基因敲入研究基
因功能
基因突变：通过CRISPR/Cs9 技术对目标基因进行突变研
究基因功能
基因沉默：通过CRISPR/Cs9 技术对目标基因进行沉默研
究基因功能
基因过表达：通过CRISPR/Cs9技术对目标基因进行过表达研究基
因功能
选择合适的载体：根据实验目的选择合适的载体如质粒、病毒等构建目的基因：将目的基因插入到载体中形成重组载体
转化宿主细胞：将重组载体导入到宿主细胞中使目的基因在宿主细胞中表达
筛选和鉴定：通过筛选和鉴定确定目的基因是否成功表达以及表达的效果如何
目的基因：需要转入到受体细胞中的基因载体：用于携带目的基因进入受体细胞的工具连接方式：常用的有DN重组技术、基因编辑技术等连接结果：形成重组DN分子用于转化受体细胞
步骤：设计siRN序列合成siRN转染到细胞中观察沉默效果
应用：研究基因功能治疗遗传性疾病农业生产等
注意事项：选择合适的siRN序列避免脱靶效应确保实验结果的准确性
基因突变：可能导致生物体出现异常现象
伦理问题：可能引发伦理争议如基因编辑婴儿等
添加标题
添加标题
添加标题

基因工程基本操作的四个步骤

通过一定的筛选方法，从中选取所需的基因。
利用PCR技术扩增
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
在PCR反应中，模板DNA、引物、四种脱氧核糖核苷酸、DNA聚合酶以及适宜的缓冲液系统被置于“热循环”的反应环境中，通过精确控制温度，在DNA聚合酶作用下高特异性、高灵敏度地扩增目的基因。
受体细胞的选择
01
02
03
原核细胞
适用于细菌等原核生物作为受体细胞，如大肠杆菌。
真核细胞
适用于动物和植物细胞作为受体细胞，如CHO细胞、动物胚胎细胞、植物愈伤组织等。
受精卵
适用于动物基因工程，直接将目的基因导入受精卵，实现基因的长期稳定表达。
转化或转染方法
01
02
03
04
化学转化法
利用CaCl2、MgCl2等化学试剂诱导细菌感受态细胞的产生，吸收外源 DNA。
载体的构建过程
目的基因的获取和修饰
从供体细胞中获取目的基因，并进行必要的修饰，如限制性酶切、连接等。
载体的获取和修饰
从宿主细胞中获取载体，并进行必要的修饰，如限制性酶切、连接等。
目的基因与载体的连接
将目的基因与载体进行连接，形成重组DNA分子。
重组DNA分子的转化
将重组DNA分子导入到宿主细胞中，并使其在宿主细胞中复制和表达。
03 目的基因与载体的连接
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶是一类能识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸
之间的磷酸二酯键进行切割的酶。
限制性核酸内切酶的识别位点通常是DNA双链上的特异序列，这种序列通常由4-6个核苷酸组成。

构建表达载体的一般流程

构建表达载体的一般流程
构建表达载体的一般流程如下：
1. 选择合适的载体：根据需要表达的基因或蛋白质，选择一个合适的表达载体。

常用的载体有质粒、病毒、合成RNA等。

2. 插入目标基因：将需要表达的基因插入到载体的多克隆位点中。

可以通过PCR 扩增目标基因并使用限制性内切酶切割载体和基因，然后进行连接。

3. 连接启动子和终止子：为确保基因在宿主细胞中能够正常表达，需要在基因的上游添加启动子和在基因的下游添加终止子。

这些序列将调控基因的表达方式和水平。

4. 检验构建质量：通过限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法，验证所构建的载体和目标基因的正确性和完整性。

5. 转化宿主细胞：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。

常用的转化方法有电穿孔、热激冲击和化学转化等。

6. 筛选和鉴定：通过特定的筛选方法或选择标记，在转化的宿主细胞中筛选和鉴定表达目标基因的阳性克隆。

7. 表达优化：根据需要，可以通过调节培养条件、添加诱导剂或使用特定的宿主菌株等方法，优化目标基因的表达水平和质量。

8. 收获表达产物：经过一段时间的培养后，收获表达的基因产物，如蛋白质，进行后续的纯化、鉴定和应用等。

需要注意的是，具体的构建流程和方法可能会因实验的目的和要求而有所不同。

在实施过程中，需要对不同步骤和条件进行优化和调整，以确保表达载体的构建和表达目标基因的成功。

载体构建技术经验分享

载体构建技术经验分享一、PCR 过程中的经验教训做分子克隆，构建表达载体的过程中，目的片段必须跟genebank 中的序列完全一致才行，所以在 PCR 过程中酶的选择首先应选择高保真酶，尤其是当目的片段较长的时候更是如此。

这样才能在 PCR 过程中减少错配情况。

高保真酶常常对退火温度有要求，对一般的酶来说，退火温度是 Tm-5 度，但如 NEB 的高保真酶的退火温度是 Tm 值+3 度。

PCR 循环数不宜太大，20-30 即可。

我就曾经用普通的酶进行过PCR，扩增时出现非特异条带，T-A 克隆后送去测序，发现碱基有错配，而且每次都不一样。

二、PCR 产物直接酶切后连接不成功当你获得 PCR 产物后，首先是进行纯化、酶切、纯化，然后与酶切后胶回收的载体连接，如果连接成功，当然是恭喜了。

但往往会出现连接不成功的，原因以 PCR 产物没有酶切成功可能性大，这可能与引物设计的好坏有关。

因为这个时候 PCR 产物是否酶切成功是无法鉴定的，所以你反复尝试几次还不成功的话，就赶紧做个 T-A 克隆吧三、T-A 克隆应注意的问题T-A 克隆应该时间很简单的事，但知者不难，难者不知啊，还是有很多问题要注意的。

T-A 阳性率高，简单易操作，所以在质粒构建过程常常用来选择做为一个亚克隆，既可以用来测序，又有利于进一步酶切，确实很方便。

但要注意，首先是T 载体的选择，尽量避免选择含有目的片段酶切位点的T 载体，这样会切成多个片段，有时候可能对后面的胶回收会有影响。

其次，因为在 PCR 产物是用高保真酶扩增的，所以首先要进行加 A 反应。

这时候应购买 T-A 快速克隆平末端加A 试剂盒。

进行加A 时反应体系不要太小，因为太小是酶量加的可能不准确。

我开始就是这样，想着节约，说明书写的是PCR 产物加15ul,我没舍得，加了3ul,加A 反应液、酶都相应减量，后面就是转化不成功。

后来我 PCR 产物加为 6ul,就成功了，屡试不爽。

PCR技术及载体构建

打开PriPrimer
设置搜索参数
等待搜索结果
逐条查看引物详细参数
Primer3在线设计引物
主要内容

PCR原理简介 PCR反应体系及条件 PCR引物设计

克隆载体的选择和构建
引物设计完成与载体克隆
F: gcGAATTCggATGGGTCGACAGAAGGAGCT
PCR技术及载体构建
主讲:胡兴旺 20150115
主要内容

PCR原理简介 PCR反应体系及条件 PCR引物设计

克隆载体的选择和构建
PCR原理简介
主要内容

PCR原理简介 PCR反应体系及条件 PCR引物设计

克隆载体的选择和构建
PCR反应体系
10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物（终浓度）引物（终浓度）模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+（终浓度）

③引物内部不应出现互补序列。 ④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。 ⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末
端连续5个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致
非特异性扩增。
常用的引物设计软件
Primer Premier5.0 （自动搜索）* vOligo6 （引物评价） vVector NTI Suit Tip：引物设计完成后可以到NCBI上做一下比对。 vDNAsis 选出相对特异性较好的候选设计。 vOmiga vDNAstar vPrimer3 （在线服务） *
引物匹配区域
补齐读码框添加碱基
添加酶切位点酶切保护碱基
载体的选择
启动子
抗性基因

载体构建的基本步骤

载体构建的基本步骤集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-载体构建一、原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒 10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1O 7H2将加好的EP管置于37℃保温1-2h。

7、单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。