(完整word版)农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素

二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素

转化机制：

与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。根癌农杆菌含有Ti 质粒。发根农杆菌含有Ri 质粒。根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转移DNA (transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。由于T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb 的外源基因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。

1 与农杆菌转化相关的基因

与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和Ti 质粒上T-DNA 以外Vir 区的基因。染色体基因包括chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。ChvD 蛋白可能在低pH 和磷酸饥饿情况下提高VirG 蛋白的合成水平。ChvE 与VirA 蛋白共同对virG 起激活作用。

原始的Ti质粒根据其功能的不同，可分为4个区：

（1）T-DNA区：是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关。T-DNA 上最重要的是两端的2个边界(LB和RB)，它们是T-DNA转移所必需的。只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要．

（2）毒性区：位于T-DNA以外的1个30~40 kb的区域内，该区段编码的基因但对T-DNA 的转移和整合非常重要．这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。

（3）接合转移区：该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因(tra)，调控Ti质粒在农杆菌间转移。

（4）复制起始区：该区段调控Ti质粒的自我复制。在遗传转化过程中除了Ti质粒上的基因参与外，还有农杆菌染色体基因。染色体基因包chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。延伸因子P对于农杆菌的生长非常重要，但非必需．高水平的糖结合蛋白一ChvE可以扩大VirA蛋白对酚类物质的识别范围。结合ATP盒式转运体类似物蛋白ChvD，参与Vir区基因的表达调控，chvD基因座中插入无启动子的lacZ，农杆菌侵染力以及Vir区基因表达量大大下降，ChvD突变体中virG组成型表达侵染力则得以恢复，这一现象说明ChvD通过影响virG表达控制毒性。

2 Vir 基因的诱导表达机制

在植物受到创伤后，创伤组织的细胞释放出创伤信号——酚类化合物，如乙酰丁香酮。

当农杆菌接受到此类信号时，其vir 区基因可被诱导转录。另一类诱导化合物是组成植物细胞壁的一些特异单糖，As 和单糖可协同诱导Ti 质粒上vir 区基因的表达。Vir 区基因的活化首先是从virA 基因开始的。VirA 蛋白是一种结合在膜上的化学受体蛋白，可直接对植物产生的酚类化合物感应，其感应部位可能位于胞质区域。VirA 蛋白的胞质区域有自激酶的功能，自身被磷酸化激活后，使VirG 蛋白活化。VirG 蛋白是DNA 结合活化蛋白，可以以二体或多体形式结合到vir 启动子的特定区域，从而成为其它vir 基因转录的激活因子，打开VirB、virC、virD、virE、virH 等几个基因。ChvE 可大大增强vir 基因被As 诱导的效果，ChvE 可结合一些单糖，也可直接与VirA 周质区相互作用，以加强As 对Vir 基因的诱导。

3 T-DNA 复合物的形成

T-DNA 的加工与转移是由Vir 基因被诱导后产生的蛋白完成。VirD基因编码的两个产物VirD1和VirD2直接参与加工过程。VirD1 蛋白是一种拓扑异构酶，可将超螺旋型DNA 变成松弛型DNA。VirD2 蛋白具有特异剪切单链DNA 的内切酶活性，它可以识别T-DNA 底链边界重复序列上的特定位点，并在底链24 bp 重复序列和第四个碱基之间切割，将T-DNA 从Ti 质粒上剪切下来，称为T-strand 或T-链。切开T-DNA后，VirD2 蛋白与T-链的5，端共价结合，避免核酸外切酶降解T-链。新的T-DNA 底链以此链为模板，从右端产生的DNA 缺口处以5’-3’方向进行合成。被取代的旧链游离出来，与许多VirE2 蛋白分子结合组成T-DNA 复合体。此外，VirD2 作为一个导向蛋白，可以指导整个T-DNA 复合体（或叫T-复合体）从农杆菌进入到植物细胞核。

4 T-DNA 复合物的跨膜转运

农杆菌的T-DNA 转移通道由多达12 种蛋白组成，包括两个主要部分：纤毛附属丝（或纤毛）和膜结合复合体。该通道也可称为T-复合体运输器，由virB 编码的11 种蛋白和VirD4 蛋白组成。VirB1可在细菌膜上为T-复合体运输器的装备提供位点；VirB2 和VirB5 可被移动到细胞表面形成纤毛；其余的VirB、VirD4 为T-复合体的运输提供能量。合成的T-复合体经过T-复合体运输器，以类似于细菌转导过程的方式注射到植物细胞内，并在VirD2 和VirE2 的核定位信号（NLS）序列引导下，以VirD2为先导向植物细胞核运动。在人工构建的质粒中，vir 基因和T-DNA 可以放在同一个质粒上，也可以放在不同的质粒上。

影响转化效率的因素

1、菌株染色体背景

不同农杆菌株的类型的chv基因决定了其对受体细胞的识别和附着能力的差异。根癌农杆菌的胭脂碱型和琥珀碱型生长快、不结球，转化易于操作，但共培养时菌体附着能力较差：章鱼碱型则生长慢、易结球，转化难于操作，但共培养时菌体附着后不易洗去。

2、共培养方式

农杆菌转化的共培养介质可以是细菌培养基或植物受体培养基。烟草等对农杆菌侵染比