反胶束萃取技术在生物工程中的应用_纪蓓

菌酶。 Goto 等 人[ 9] 用阴离 子表面 活性 剂 ) ) )
磷酸二油酯( DOL PA) 形成的反胶束溶液, 利 用活性 A- 胰凝乳蛋白酶和变性 A- 胰凝乳蛋白 酶的结构及性质不同, 选择性地分离两者的 混合物。Lee 等[ 10] 用 A OT / 异辛烷反胶束体 系选择 性分 离 A- 乳白 蛋 白 ( pI 4. 2 ~ 4. 5, M w14 ku) 和 B- 乳球蛋白( pI 5. 2, M w 36 ku)
1 反胶束萃取技术
反胶束 ( reversed m icelle) 是指当有机溶 剂中加入表面活性剂并令其浓度超过某临界 值时 ( 临界胶 束浓度 critical micelle concen-
第一作者: 硕士研究生。 收稿时间: 2002- 06- 10, 改回时间: 2002- 10- 12
tration, CM C) 表面 活性剂便会在 有机溶剂 中形成 一种稳定的大 小为毫微米 级的聚集 体, 这种聚集 体就是反胶束 ( 或 称反胶团) 。 通常, 形成反胶束体系的有机溶剂为脂肪烷 烃, 表面活性剂根据其极性头基性质的不同, 可分为以下 4 种类型: 非离子型( 如脂肪醇聚 氧乙烯醚, Brij30) , 阳离子型( 如二- ( 2- 乙 基己基) 丁二酸酯磺 酸钠, AOT ) , 阴离子型 ( 如二辛基二甲基氯化铵) , 两性离子型( 如卵 磷脂) ; 某些双亲物质, 如三辛基甲基氯化铵、 卵磷脂, 须加入一定量的助表面活性剂( 一般 为 C4~ C12 脂肪醇) 才能形 成稳定的反胶束 体系[ 3] 。
溶液。这种方法易控制水的含量和水核的尺 与 寸。( 3) 溶解法。用反胶团溶液与固体蛋白 专
pH 值和离子种类及其浓度) 又可使蛋白质由 有机相重新返回水相实现反萃取过程[ 5] 。
质粉末接触来使蛋白质进入反胶团。这种方 题
法适用于水不溶性蛋白质。
评
由于反胶束内存在微水池, 故可溶解氨 基酸、肽和蛋白质等生物分子, 为生物分子提
与蛋白质的静电相互作用。此外, 反胶束与 pH 、离子强度, 采用一步萃取和 2 步反萃取
生物分子之间的空间相互作用和疏水性相互 作用对生物分子的溶解率( 萃取率) 也有重要 影响。为增加反胶束萃取的选择性, 带有亲 和配体的助表面活性剂可以通过亲和作用协 同反胶束萃取产品。蛋白质在反胶束内的溶 解作用, 与蛋白质的表面电荷和反胶束内表 面电荷间的静电作用, 以及反胶束的大小有 关。所以, 任何可以增强这种静电作用或导 致形成较大的反胶束的因素, 均有助于蛋白 质的萃取。影响反胶束萃取生物分子的主要
专
以很好的从它们质量比为 1B1 的混合物中分 如果可以很便利地回收有机溶剂和表面活性
题
离出来, 而在高蛋白质浓度下, B- 乳球蛋白被 剂, 那么这种细胞溶解与蛋白质萃取相结合
评
排斥在胶束外。
的工艺方法, 将成为从细胞中直接提取蛋白
论
21112 从发酵液中直接分离纯化蛋白质
质的重要途径。
分离蛋白质混合物的研究主要为纯酶形 21113 同时分离植物中蛋白和油脂
成的纯物质模型系统, 反胶束萃取法还可以
通常用烃类有机溶剂提取向日葵籽( 干
从复杂的培养基, 如发酵液或粗提液中直接 重中含有 35% ~ 50% 的石灰质) 时, 残渣中
萃取蛋白质。 Krienger 等人[ 11] 用 AOT / 异辛烷反胶束
体系从桔青霉( Penicill ium cit ri num ) 的粗提
得到粗提液, 再经萃取可得脂肪酶。Soni 等 人[ 12] 用同样的反胶束体系从发酵液中提取
油被直接萃取到有机相, 而蛋白质却溶入反 胶束的/ 水池0内。先用水溶液反萃取得到蛋
了黑曲霉 ( A spergil lus niger ) 的胞外酸性磷 酸酯酶。实验结果表明, 萃取和反萃取在最
白质, 再用冷却反胶束溶液使表面活性剂沉 淀分离, 最后用 蒸馏方法 将油与烃 类分离。
综
食品与发酵工业 Food and F er mentation I ndustries Vol1 28 No1 12
述
与
反胶束萃取技术在生物工程中的应用
专
题
纪 蓓 朱明军 梁世中
评
( 华南理工大学食品与生物工程学院, 广州, 510640)
论
摘 要 主要综述了反胶束萃取技术及 其在分离和纯 化生物活性 物质, 如蛋白 质、氨基酸和 抗生素等方面的应用。 关键词 反胶束萃取, 生物活性物质, 蛋 白质, 氨基酸
Sun 等[ 8] 将 CB- 卵磷 脂形成的反胶束 溶液吸附于微孔聚丙烯中空纤维膜上, 作为 固定相, 这种用色谱法分离蛋白质的方法称
因素有水相的 pH 值、水相的离子强度、表面 为中空 纤 维 亲 和 色谱 分 离 法 ( hollow- f iber
活性剂的种类和浓度、助表面活性剂、蛋白质 af finit y part itioning chromatography,
( AOT ) 的浓度是影响 萃取 C- 球蛋白的最重 要的因素。在 400 mmol/ L NaCl, 350 mmol/
氨基酸溶解的参数, 这些参数是反胶束的结 构和氨基酸的离子化状态。氨基酸的结构和
L AOT 和 pH = 710 时, 保 证 产 物 纯度 为 其离子化状态将决定反胶束体系内的相互作
混合物。研究 表明萃取 分离两种 蛋白质受
蛋白质会缓慢地从水相转移到有机相中。这 pH 、离子强度和总蛋白质浓度的影响, 相转
种方法形成的最终体系是稳定的, 且可以在 低 W0 下得到高蛋白浓度。( 2) 注射法。这 是最常用的方法。蛋白质溶液直接注入含有
移前后水相的 A- 乳白蛋白和 B- 乳球蛋白混合 物的蛋白质浓度用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰 胺凝胶电泳( sodium dodecyl sulf at e polyacry-
蛋白质进入 反胶束溶 液是一种 协同过 程, 即在宏观两相( 有机相和水相) 界面间的 表面活性剂层, 同邻近的蛋白质发生静电作 用而变形, 接着在 2 相界面形成了包含有蛋
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第 28 卷 第 12 期 纪 蓓等: 反胶束萃取技 术在生物工程中的应用
综
述
白质的反胶束, 此反胶束扩散进入有机相, 从 而实现了蛋白质的萃取。改变水相条件( 如
有不同的溶解度, 可利用反胶束溶液选择性 溶解进行分离。Goklen 和 H at ton 等人[ 6] 以 AOT / 异辛烷反胶束体系为萃取剂分离核糖 核酸酶( pI 7. 8, M r 13 683) , 细胞色素 C( pI 10. 6, M r12 384) 和溶菌酶( pI 11. 1, M r 14 300) 等 3 种蛋 白质混合 物。通过 改变水相
优条件下, 可从最初发酵液中获得 29% 的酸 实验结果表明该方法相当优越, 这将引起油
性磷酸酯酶。 Yang 等人[ 13] 用反胶束萃取从猪血浆中
脂工业和植物蛋白传统加工方式的改变。 212 氨基酸
分离纯化 C- 球蛋白。实 验结果表 明水相的
用反胶束萃取还可以将氨基酸从发酵液
pH 值和盐( NaCl) 浓度和有机相表面活性剂 中提取出来。该过程关键在于有效控制影响
1977 年, 瑞士的 L uisi[ 1] 等人首先发现胰 凝乳蛋白酶可以溶解于含有表面活性剂的有 机溶剂中, 并首次提出了用反胶束萃取蛋白 质的概念, 但并未引起人们的广泛注意。直 到 80 年代, 科学家才开始进行反胶束萃取蛋 白质的研究。这种萃取技术具有成本低, 溶 剂可反复利用, 萃取效率高, 条件温和不会引 起生物活性 物质变性, 选择 性高, 使用范围 广, 操作简单等优点。目前已广泛应用于蛋 白质的分离和纯化, 并逐渐延伸至其他生物 工程产品, 如 氨 基酸、抗 生 素、核酸 等 的分 离[ 2] 。
过程, 用高效色谱法( H PL C) 检测可知 3 种 蛋白质被分离开来。Choe 等[ 7] 用伴刀豆凝 素( ConA) , 作为亲和配体分离 2 种分子质量 和等电点十分相似的糖蛋白, 大豆过氧化酶 ( SBP , M w 37 ku, pI 3. 7) 和 A- 酸性糖蛋白 ( AGP, M w 43 ku, pI 3. 7) 。在 pH \8 的条件 下 SBP 几乎完全萃取分离。
含有 30% ~ 50% 的蛋白质, 这种蛋白质有很 高的营养价值, 但不能被提取出来, 这些高营 养物质的渣饼只能用作饲料。L eser 等人[ 15]
物中提取和纯化了脂肪酶。发酵结束后桔青 霉菌丝体经过滤, 收集含有脂肪酶的上清液
使用烃类为溶剂的反胶束溶液作为提取剂, 同时萃取向日葵籽中的油和蛋白质, 经萃取
表面活性剂的有机相中, 搅拌成光学澄清的 lamide gel elect rophoresis, SDS- PAGE) 测量。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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综
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述
与
在低蛋白质浓度的条件下, 2 种纯蛋白质可 一个不利因素, 它使得反胶相不能重复使用。
酸。 翁连进等人[ 16] 已成功开发了从胱氨酸
母液中提取精氨酸的工艺, 该工艺采用 4 级
活性剂的作用下被溶裂, 析出酶进入反胶束 萃取, 3 级洗涤, 可以使反胶束中精氨酸的纯
的/ 水池0中, 经反萃可选择性地回收浓度很 度大于 98% , 整个工艺精氨酸的回收率大于
高的酶。在最优条件下, 对分子质量较小的 B- 羟丁酸脱氢酶( M w 63 ku) 和异柠檬酸脱氢 酶( M w 80 ku) , 反萃液中酶活性的回收率超 过 100% ( 相对于用无细胞抽提液) , 分子质 量较大的葡萄糖- 6- 磷酸脱氢酶( M w 200 ku) 不能被抽提出来, 至少不能抽提到有活性的
反胶束的形状有从球形或近球形到柱形 等不同的形式, 而且随着被加溶的水量的增 加, 从非对称形向球形转变。其大小取决于 盐的种类和浓度、溶剂和表面活性剂的种类 和浓度以及温度等, 一般为 5~ 20 nm, 表征 反胶束大小较好的参数是 W0, 它代表反胶 束溶液中加溶水的量, 即水与表面活性剂的 摩尔比。反胶束的半径随 W 0 增加而增加, 反胶束的大小对萃取也十分重要, 因为它可 以影响反胶束对蛋白质受到抑制或排斥[ 4] 。
的性质和浓度、有机溶剂的种类和温度等因 H FAPC) 完全分离了牛血清蛋白( BSA) 和溶
素。
2 反胶束萃取技术在分离和纯化生物 活性物质中的应用
2. 1 蛋白质 2. 1. 1 分离蛋白质混合物
制备 含有蛋白质的 反胶束相有 3 种方 法: ( 1) 相转移法。一般把含有表面活性剂的 有机相与含有蛋白质的水相接触, 通过搅拌,
为了使许多高附加值的生物工程产品实 现大规模产业化生产, 急需开发从发酵液或 细胞培 养液中连续提 取目的产物 的分离技 术, 以便减少对产品生物活性的影响, 以保证 产品的纯度。传统的溶剂萃取技术在许多领 域, 如化工、石化、冶金等工业中有广泛的应 用, 显示出其优良分离性能。但大多数生物 活性物质, 如蛋白质不溶于有机溶剂, 而且与 有机溶剂接触后会引起其变性和失活。反胶 束萃取技术就是在这一背景下发展起来的一 种新型的分离技术。
85% 的条件下, 可获得 97% 的收获率。 Giouvenco[ 14] 用反胶团萃取法从全料液
用和氨基酸溶解。氨基酸可以通过静电或疏 水作用增溶于反胶束中。利用氨基酸与反胶
中 提 取 和 纯 化 棕 色 固 氮 菌 ( A zotobact er 束作用的差异, 可以选择性地分离某些氨基
vi nelandii ) 的胞内 脱氢酶, 将 全细胞的悬浮 液注入十六烷 基三甲基溴 化铵( CTAB) / 己 醇- 辛烷反胶束溶液中, 完整的细胞在表面
分子质量相近的蛋白质, 由于它们的等 论 电点 pI 值( isoelectric piont ) 及其它因素而具
供易于生存的亲水微环境。关于反胶束溶解 蛋白质的形式, 目前普遍接受的是水壳模型。 由于周围水层和极性基团的保护, 维持了蛋 白质的天然构性不会造成失活。
生物分子溶解于 AOT 等离子型表面活 性剂的反胶束相的主要推动力是表面活性剂