凝胶过滤层析资料
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析的基本操作凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）是一种常用的分离和纯化生物大分子（如蛋白质、核酸等）的方法。
该方法基于分子的大小和形状的差异，利用一种孔隙较小的基质（凝胶）将分子按照大小分离，从而达到纯化的目的。
凝胶过滤层析是一种非亲和层析法，因为分离是通过分子与基质之间的排斥效应进行的，而不是通过特定的信号配对。
1.准备样品：将待纯化的生物大分子样品（如蛋白质溶液）处理成适合进行层析的条件。
这通常包括调节样品的pH值、离子强度、缓冲剂等。
2. 准备层析柱：选择合适的凝胶填料，并根据需要选择合适的柱尺寸。
凝胶填料可以是聚合物凝胶或硅胶凝胶。
聚合物凝胶（如Sephadex、Sepharose等）常用于分离中等分子量的生物大分子，而硅胶凝胶（如Sephacryl等）则适用于分离较大分子量的生物大分子。
3.平衡柱：将层析柱与缓冲液平衡。
通常用适当的缓冲液（如甘氨酸盐缓冲液）进行平衡，以确保柱内填充物的孔隙充满均匀。
4.样品加载：取适量的样品，在不破坏填充物的情况下缓慢地、连续地将样品滴入柱顶端。
加载速度要缓慢，以确保样品充分进入柱内而不是渗漏到填充物外。
5.洗脱：在缓冲液的作用下，样品溶液逐渐沿柱体下滤。
较小的分子会占据填充物内较小的孔隙，因此会与缓冲液一起快速通过填充物，而较大的分子则会在填充物中逐渐滞留。
洗脱时间的长短取决于目标分子的大小。
6.收集洗脱液：用收集管接收洗脱液，以便将目标分子收集起来。
7.考虑后续处理：根据需要，纯化后的生物大分子可以进一步进行其他处理，如浓缩、冻干或储存等。
凝胶过滤层析技术的优点包括操作简单、不需要特殊的设备和试剂、分离过程温和且不破坏生物大分子的活性。
但也需要注意凝胶的选择、控制操作速度、适当调节缓冲液等因素，以获得最佳的纯化效果。
另外，凝胶过滤层析不能对极低分子量的物质进行有效分离，且柱内的适用范围有限，对于较大的生物大分子可能需要较长的时间来完成分离。
第2章 凝胶过滤层析
五、【实验器材】
层析柱 恒流泵
紫外检测仪
部分收集器
试管等普通玻璃器皿
六、【操作方法】
凝胶的处理 装柱；平衡； 上样； 洗脱和检测； 层析柱的再平衡；
1、凝胶的处理
Sephadex G-100干粉经蒸馏水室温充分 溶胀48h，或沸水浴中煮沸2h，冷却至室温 后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。
使用方法
1. 检查：连接是否正确，将“波长”旋钮旋到所需波长刻度； 2. 预热：按下 “电源”开关，电源指示灯亮； 3. 调100%：把“灵敏度”旋钮选择到“100％”档，调节“光量” 旋钮，数字显示为100，即透光率为100％； 4. 调零：把“灵敏度” 旋到所需档（使用者自行掌握），缓慢调 节“调零”旋钮，数字显示为“0”。 备注：以上步骤需反复调节几次。在样品检测过程中，不可再调 节“调零”、“光量”旋钮。如绘出的图谱即出峰过小，可改变 “灵敏度”选择档，每档成两倍放大关系。
1与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关2与柱的长短粗细无关每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数特定的分配系数kdkdvevokdvivevokdvi2vevikd分子完全不被排阻完全向凝胶颗粒内部扩散在两相分配的比值为1最后流出
一、一般介绍
280nm处检测，将检测信号输入色谱工作站系 统，绘制洗脱曲线。
6、凝胶柱的处理
凝胶用过后，反复用蒸馏水通过柱（2~3倍 床体积）即可。
7、凝胶的再生及保存
再生 用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以
恢复其性能
凝胶的保存方法
0.02%叠氮钠
或0.002%双氯苯双胍己烷
凝胶过滤层析
C. Sephadex G-150（分级范围， 5,000-400,000 D）
凝胶粒度的影响
凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱 流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒 凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐 等。 在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μ m左右较合适。对于在水中 保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150μ m左右。凝胶颗粒大小 要均匀，这样流速稳定，效果较好
层析柱 （ a ）自制简易层祈柱（ 1 ．玻璃 管；2.橡皮塞；3．尼龙网）； （b）普通商品柱； （c）双底板层析柱（1.洗脱液进 出口； 2. 多孔底板； 3 ．柱床； 4 ．恒温水进口； 5 ．恒温水出口； 6．可调节的塞子）
4、样品的准备
样品的粘度：粘度大产生介质吸附， 一般要求样品粘度小于0.01Pa· s
选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小 分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd=0， 小分子的Kd＝1。这样能取得最好的分离效果。
例题：从某蛋白质溶液（MW=5500D）中除去无机盐，应选择下 列哪种凝胶最合适？
A. Sephadex G-15（分级范围， <1,500 D） B. Sephadex G-25（分级范围，1000-5000 D）
凝胶过滤层析
定义
凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层 析（size exclusion chromatography）、分子筛层 析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗 透层析（Gel Permeation Chromatography）
凝胶过滤层析简介
凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
柱的选择 柱的装填
同样直径的层析柱 同样长度的层析柱 同样体积的层析柱 理想的层析柱
长层析柱比短的分辨率高； 直径大的比小的分辨率高； 层析柱长的比短的分辨率高。 直径与长度之比是1：25-1：100
常用的支持物有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻璃等。 空柱中应留约1/5的水或溶剂。 不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。
测定分子量
当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。
0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。
|分类与性质
凝胶
分类性质
凝 胶 含大量液体的具三维网状开孔弹性结构的多聚体结构，
一般制成球状颗粒。
性
能 多孔、亲水、惰性、稳定、色谱性能好
凝胶过滤层析技术
凝胶过滤层析技术 content
凝胶过滤的基本原理
凝胶分类与性质 凝胶过滤的基本操作
凝胶过滤层析的应用
|基本原理
原理
分子
洗脱体积
分配系数
凝胶过滤法又称为分子筛层析、凝胶 层析或排阻层析,是利用凝胶 的网状结构根据分子大小进 行分离的一种方法。凝胶过
Services 滤所用的介质是由交联葡萄
| 基本操作
凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
凝胶再生 凝胶保存
仅使用过一次的凝胶柱，通常进行更新平衡后 即可再次使用； 湿法：洗净的凝胶悬浮于蒸馏水和缓冲液中，应加入 适量的防腐剂如氯仿、0.05％NaN3或20％乙醇等，不 先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲液进行 然微生物将生长。 平衡，平衡毕，即可重复使用 干法：用浓度逐步升高的乙醇洗净凝胶，使其脱水收 把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理 缩，再抽干乙醇，用60-80℃的暖风吹干，在室温下 方法进行，处理后重新装柱即可再行使用 保存。 半缩法：是过度法，用60%-70%的乙醇使凝胶部分脱 水，然后封口，4 ℃保存。
4.1 凝胶过滤层析
㈡ Superdex
是由安玛西亚公司开发的一类新型凝胶过滤 介质,是目前分辨率和选择性最高的凝胶介质之 一。Superdex是将葡聚糖与高度交联的琼脂糖 颗粒共价结合而形成的，属于复合型凝胶 。
在该凝胶的结构中，琼脂糖基质决定了凝胶 具有高度的理化稳定性，而葡聚糖链决定了凝 胶的层析特性。
三、Gel过滤色谱中溶质运动的特征
㈠. 洗脱体积Ve Ve 与样品体积 VS 有关
具体影响如下图说明：
(二）. 分配系数Kd
Kd =
固定相中溶质浓度（g/l） 流动相中溶质浓度（g/l）
A类分子 Kd=0 Ve = V0 C类分子 Kd=1 Ve = Vi + V0 B类分子 0〈 Kd〈 1
• 2.脱盐
第一节 凝胶过滤色谱基本理论
一、
简单原理
凝胶颗粒具三维网状结构，可对大小不同 的分子流动产生不同的阻滞作用。
孔隙
间隙
颗粒粒径几十到几百um
间隙几到几十um
孔隙的孔径nm级
（一般大分子也在nm级）
要分离的分子分为三类：
A类：dA＞最大孔径，全排阻（出） 凝胶对它无阻滞，最早流出；
C类：dC＜最小孔径，能进入全部孔隙区 阻滞最大，流速最慢，最晚流出；
二、 实验设计要点 ㈠. 要求
⒈高分辨率 Rs = 2Y/(W1+W2)
Y
W1
W2
Rs应〉1.2 （减小W，增大Y）
⒉回收率高（减少峰宽，可提高回收率）
⒊减少稀释（避免以下几种情况） ⑴. 涡流扩散 （通道不均匀） ⑵. 动定相不平衡（速度过快） ⑶. 纵向分子扩散 （速度过慢）
⒋短时间 尽可能缩短时间，尤其是活性物质的分离
A类与B类、B类与C类、A类与C类间 ⒉分级分离
凝胶过滤层析法
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Sephadex经改性后比其母体具有更广泛的用途，适用于脂类、甾类、脂肪酸、激素、维生素及其他小分子的分级分离。
10
15-20
72
5
150
5000-400000
1000-150000
15
20-30
72
5
200
5000-800000
1000-200000
20
30-40
72
5
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Sephadex的型号及性能
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3、主要用途：孔径较小的凝胶主要用于脱盐、肽与其他小分子的分离；孔径较大的凝胶用于蛋白质与其他大分子的分离。DNA级的Sephadex适用于DNA或低聚核苷酸的分离。
峰宽：峰的基线宽度，通过层析峰两侧拐点作切线交于基线上的距离。
标准差：样品组分被带出层析柱的分散度，用σ表示。两侧拐点之间的距离为2个标准差。
Wb=4 σ=1.699W1/2
W1/2=2.354 σ
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保留值：表示样品中各组分在层析柱中停留时间的长短或组分流出时所需流动相体积的大小。
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Sephacryl系列产品性能
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(五)、Superdex系列产品 是最新的凝胶过滤介质，属BioProcess介质中的一种。是将葡聚糖以共价键方式结合到高交联的多孔琼脂糖珠体上形成的复合凝胶。是将交联葡聚糖优良的过滤选择性及高交联的琼脂糖的物理化学稳定性集于一身的具有优良选择性和高分辨率的产品。可在0.1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液中40℃处理400小时而分辨率保持不变。
生化实验报告凝胶过滤
一、实验目的1. 理解凝胶过滤的原理和操作步骤。
2. 掌握凝胶过滤在蛋白质分离纯化中的应用。
3. 通过实验验证凝胶过滤的分离效果。
二、实验原理凝胶过滤，又称分子筛层析，是一种基于分子大小差异的分离技术。
层析柱内填充带有小孔的凝胶颗粒，凝胶颗粒的孔径大小不同。
当含有不同大小蛋白质的混合溶液通过层析柱时，小分子蛋白质能够进入凝胶颗粒的孔隙中，从而在层析柱中停留时间较长；而大分子蛋白质则无法进入孔隙，在层析柱中的停留时间较短。
因此，不同大小的蛋白质得以分离。
三、实验材料1. 蛋白质混合样品（如血红蛋白、肌红蛋白等）2. 凝胶过滤柱（如Sephadex G-75）3. 缓冲液（如磷酸盐缓冲液）4. 离心机5. 分光光度计6. 移液器7. 玻璃棒8. 实验记录表格四、实验步骤1. 柱的制备：将凝胶过滤柱垂直放置，用缓冲液充分洗涤，去除凝胶颗粒表面的杂质。
2. 样品的制备：取一定量的蛋白质混合样品，用缓冲液稀释至适当的浓度。
3. 样品的加载：将样品缓慢加入层析柱的顶部，使其自然流下。
4. 洗脱：用缓冲液以恒定流速（如1 mL/min）洗脱层析柱，收集洗脱液。
5. 检测：使用分光光度计检测洗脱液中的蛋白质含量，记录不同洗脱峰的位置和峰面积。
6. 收集：根据蛋白质含量变化，收集不同洗脱峰的蛋白质溶液。
五、实验结果与分析1. 洗脱曲线：根据洗脱曲线，可以观察到不同大小的蛋白质在层析柱中的洗脱顺序。
通常，小分子蛋白质先被洗脱，而大分子蛋白质后被洗脱。
2. 蛋白质分离效果：通过比较不同洗脱峰的峰面积，可以评估凝胶过滤的分离效果。
峰面积越大，说明蛋白质含量越高，分离效果越好。
六、实验讨论1. 凝胶过滤是一种高效、简便的蛋白质分离纯化方法，广泛应用于生物化学和分子生物学领域。
2. 凝胶过滤的分离效果受到凝胶类型、柱径、流速等因素的影响。
在实际应用中，需要根据具体实验目的和样品特性选择合适的凝胶类型和操作条件。
3. 凝胶过滤可以与其他分离技术（如SDS-PAGE、电泳等）联合使用，进一步提高蛋白质的分离纯化效果。
凝胶过滤层析
三 操作步骤
1 凝胶的选择和预处理 本实验样品中含有分子量差异不大的多中组 分，其中目的物为分子量60kd 的可溶性蛋白 质，因此属大分子化合物的分离纯化，故选 用SephadexG-75。对球形蛋白质而言，其排 阻限为3000-70000。 称取40g SephadexG-75，加入10倍以上吸液 量的蒸馏水浸泡，在水浴加热时充分膨胀。
三 操作步骤
4 样品预处理及加样 蛋白质样品浓度一般以不大于4%为宜，溶剂为洗脱液。 如样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后再上柱。 将床面多余的洗脱液除掉，吸至离层析床面2厘米处为止。 将出口打开，使床面的洗脱液流至1毫米，关闭出口。用 加样器将样品加入床表面1厘米左右，再打开出口，使样 品渗入凝胶内。样品加完后，用尽量少的洗脱液洗涤表 面1-2次。当样品完全渗入凝胶内后，再仔细加入洗脱液 至离床面3-4厘米处，即可接上洗脱瓶进行层析。
实验六 凝胶过滤层析
一 实验原理
凝胶层析是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相， 由于在层析过程中样品不同的蛋白质具有不同的洗脱， 使不同的分子量的组分得以分离的层析方法。凝胶层 析的分离过程是在装有多孔物质如交联聚苯乙烯、多 孔玻璃、多孔硅胶、交联葡聚糖等填料的柱中进行的。 填料颗粒含有许多不同大小的孔隙。这些孔隙对于溶 剂分子而言是很大的，他们可以自由扩散出入。对于 溶质分子而言，如果分子大小合适时，则可以不同程 度地往孔隙中扩散，大分子量的溶质分子只能占有较 小的孔隙，而小分子量的溶质分子除能占住大孔隙外， 还可以占有另外一些起更小的孔隙。
一 实验原理
所以随着溶质分子尺寸的减小，其占有 孔隙体积迅速增加。当具有一定分子量 分布的高聚物溶液从柱中通过时，由于 溶质分子在孔隙中溶剂与颗粒溶剂之间 进行扩散分配的差异造成较小的分子在 柱中停留的时间比大分子停留的时间要 长，所以整个样品按分子大小顺序而分 开，最先洗脱出来是最大的分子。
凝胶过滤层析
因此分子的正常Ｋav值0~1之间,这种由小 到大的顺序决定了物质流出的顺序。
排阻极限： 是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部 的最小分子的分子量。
排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分 子量。
第二节 凝胶介质的分类和性质
1） 葡聚糖凝胶 ① G类葡聚糖（Sephadex） ② LH-亲脂型葡聚糖 ③ Sephacryl
凝胶过滤原理示意图
凝胶层析的几个概念
外水体积（Vo）：是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流 动相的体积。 内水体积（Vi）：是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体 积。 基质体积（Vg）：是指凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积（Vt）：是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积 （Ve）：样品中某组分洗脱下来所需洗脱液的总体积。
（2） 琼脂糖凝胶
商品名 Sepharose（瑞典）
1）2B,4B等型号，数字代表颗粒中琼脂糖的百 分含量，数字越大，分离的范围越小 2）与1，3－二溴异丙醇反应生成交联琼脂糖， 稳定性提高；
Bio－gel A(美国）
一般有A0.5, A1.5等型号，数字×106代表分 离的分子量极限；
与葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶相比，琼脂糖凝 胶机械强度和筛孔稳定性好，洗脱速度可以快些
对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水 体积和在外水体积中的浓度分配关系。
Ｋav＝（Ｖｅ－Ｖｏ）／(Ｖt － Vo)
它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔 隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无 关，也就是说它对每一物质为常数与柱的 物理条件无关。
（1）Ｋav = 0时,Ve = Vo,意味着该分子完全被排 阻于凝胶颗粒之外,全部分布于流动相里,在固定相 分布为0,而最先流出。
凝胶过滤层析讲解
四、加样 加样体积越小，分辨率越高。 两种蛋白洗脱体积为VeA、VeB，两种蛋白分离体 积Vs（洗脱体积之差），Vs＝VeA-VeB,
理论上，Vp(加入样品体积）＝Vs时就能分离两种
蛋白质
Vp<Vs时效果好。
样品粘度的影响
五、 洗脱 洗脱液：能溶解被洗脱物质、不使其变性或 失活为原则。 一般都以单一缓冲液(如磷酸缓冲液、TrisHCl缓冲液等)或者盐溶液作为洗脱液。
3)中等大小的分子，在凝胶颗粒内外均有分布，部分进 入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。
凝胶过滤原理示意图
凝胶层析的几个概念
外水体积（Vo）：是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流 动相的体积。 内水体积（Vi）：是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体 积。 基质体积（Vg）：是指凝胶颗粒实际骨架体积。
分级分离一般选用排阻极限略大于样品中最高分子 量物质的凝胶。
2）粒度的选择
目数（反映凝胶颗粒直径的大小）。目数越 大，直径越小。 每种型号凝胶都有有粗粒和细粒之分。 细粒均一性好，分离效果好，但是流速慢， 适合小型实验。层析柱选用大直径的； 粗粒的优势是流速快，适合样品量大的实验， 选用小直径的柱子提高分辨率。
（2） 琼脂糖凝胶
第五章-凝胶过滤层析
复习
根据凝胶床的组成，总柱床体积等于外水体积、内水体积 与凝胶体积之和：
Vt=V0+Vi+Vg
凝胶柱体积参数示意图
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复习
凝胶过滤洗脱曲线示意图 （组分A为全排阻分子，组分B为部分渗透分子，组分C为全渗透分子）
洗脱体积Ve定义为自样品加至层析柱上部开始，至洗脱组分达到最 大浓度（对映洗脱峰峰顶）时流经层析柱的洗脱液的体积.
3
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
一、凝胶过滤的概念
不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同, 凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层 析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.
4
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶色谱分离原理
5பைடு நூலகம்
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶过滤洗脱曲线示意图 （组分A为全排阻分子，组分B为部分渗透分子，组分C为全渗透分子）
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
所示层析图谱中，样品由三种组分组成。 组分A为全排阻分子，分子量大于凝胶分级范围上限，不能进入 凝胶网孔，经凝胶颗粒间隙被洗脱，该组分的洗脱体积Ve等于外 水体积V0（Ve=V0）。 组分C为全渗透分子，分子量小于凝胶分级范围下限，完全渗透 进入凝胶网孔内，在正常洗脱条件下，与凝胶间不存在吸附作用 时，此类组分的洗脱体积是最大的，等于外水体积V0与内水体积 Vi之和（Ve=V0+Vi）。 组分B为部分渗透分子，分子量处于凝胶分级范围内，是此类凝 胶能有效分离的物质。根据组分B的分子量，该组分能以一定程 度进入凝胶网孔之中，其洗脱体积Ve处于组分A与组分C之间 （V0<Ve<V0+Vi）。
《凝胶过滤层析》课件
高分子材料
随着高分子合成技术的进步，新型的高分子材料将应用于凝胶过滤层析中，以提高分离效率和分辨率。
纳米材料
纳米材料具有独特的物理和化学性质，将其应用于凝胶过滤层析中，有望实现更高效的分离和更精确的检测。
自动化和智能化发展
借助人工智能和机器学习技术，对凝胶过滤层析的数据进行深度分析，为实验结果提供更准确的解释和预测。
聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂聚合形成的网状高分子凝胶，具有良好的分子筛效应。
简介
应用
优点
缺点
常用于分离蛋白质、多肽等生物小分子，也可用于制备亲和层析介质。
分离效果好、分辨率高、操作简便。
可能产生毒性，对盐浓度和pH值敏感。
凝胶过滤层析的步骤
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葡聚糖凝胶
简介 应用 优点 缺点 葡聚糖凝胶是一种由葡萄糖单元组成的线性高分子凝胶，具有良好的化学稳定性和生物相容性。 分离效果好、分辨率高、操作简便。 广泛用于分离蛋白质、酶、核酸等生物大分子，也可用于制备亲和层析介质。 成本较高，对盐浓度和pH值敏感。
琼脂糖凝胶
简介 应用 优点 缺点 琼脂糖凝胶是由琼脂糖形成的线性高分子凝胶，具有较好的机械强度和稳定性。 常用于分离DNA、RNA和蛋白质等生物大分子，也可用于制备微孔过滤介质。 机械强度高、稳定性好、成本较低。 对盐浓度和pH值敏感，可能产生拖尾现象。
凝胶过滤层析是一种基于分子大小分离蛋白质混合物的技术。
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定义
它利用具有不同孔径的凝胶作为分离介质，根据蛋白质分子的大小和形状进行分离。
凝胶过滤层析基本原理
凝胶过滤层析基本原理
凝胶过滤层析是一种常用的分离和纯化生物大分子的技术方法，其基本原理是利用凝胶材料的孔隙结构，通过分子大小和电荷差异，将混合物中的目标分子从其他分子中分离出来。
在凝胶过滤层析中，常用的凝胶材料包括琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。
这些凝胶材料具有多孔结构，可以形成一种网络状的三维结构。
目标分子可以通过这些孔隙进入凝胶内部，而其他分子则因孔隙的大小或电荷而无法进入，从而实现目标分子的分离。
凝胶过滤层析的基本步骤包括样品加载、洗脱和分离。
首先，将混合物样品加载到凝胶柱上，样品中的分子会根据其大小和电荷的不同，以不同的速率进入凝胶内部。
然后，通过洗涤凝胶柱，将非目标分子洗脱掉，使其通过凝胶柱。
最后，目标分子可以通过改变实验条件，例如改变缓冲液pH值、离子强度等，从凝胶中洗脱出来。
凝胶过滤层析的优势在于其操作简单、成本低廉、适用范围广，可以用于分离和纯化多种生物大分子，如蛋白质、核酸等。
同时，凝胶材料的孔隙结构可调控，可以根据实验需要选择不同的凝胶材料和孔隙大小，以实现对目标分子的高效分离。
凝胶过滤层析是一种基于凝胶材料的分离技术，通过利用凝胶的孔隙结构和分子特性的差异，实现混合物中目标分子的分离和纯化。
该技术简便易行，适用范围广泛，对于生物分子的研究和应用具有
重要意义。
凝胶过滤层析实验
凝胶过滤层析实验凝胶过滤作为实验室最常用的层析方法之一，无疑是众多层析方法中最娇贵的存在。
原理凝胶过滤层析是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果的，凝胶过滤填料中含有大量微孔，只允许缓冲液及小分子量蛋白质通过，而大分子蛋白质及一些蛋白复合物则被阻挡在外。
因此，高分子量的蛋白质在填料颗粒间隙中流动，比低分于量蛋白更早地被洗脱下来。
最大的蛋白质分子最早流出柱子，因为它们在到达柱底前经过的体积最小。
中等大小的蛋白质可以进入填料分子中较大的孔内，因此它们晚一些到达柱底，而小蛋白质可以逬入所有填料的孔内，有最大的通过体积，故最后到达柱底。
材料与仪器蛋白质溶液缓冲液、蓝色葡聚糖溶液、乙醇、乙腈、乙酸、胃蛋白酶低压层析系统操作步骤1.凝胶的填装1.1凝胶的溶胀如果凝胶是脱水的干粉（例如Sephadex）在使用前需要溶胀。
1.1.1一份凝胶加10份的缓冲液，原则上应将凝胶颗粒放入洗脱缓冲液中。
1.1.2在摇床上或手动搅拌混合，避免使用电力搅拌器。
因为机械搅拌力会导致凝胶颗粒破裂成碎片，这些细小的碎片将干扰层析。
如果出现细小的凝胶碎片可将凝胶浆悬浮，待凝胶颗粒沉降后，去除上清，重复几次，直到液相不再混浊为止。
1.1.3自然溶胀需要24 h至数天，为了加速溶胀，可用热法溶胀。
即在沸水浴中将凝胶浆逐渐升温至近沸，这样可加速溶胀平衡，通常1～2 h即可完成。
这种方法不但省时，还可以排除气泡和消毒。
1.1.4无论凝胶是否需要溶胀，为了防止气泡影响层析，需用水泵或真空泵对凝胶浆抽气1 h。
1.2装柱1.2.1将层析柱垂直安装在无直接光照、无空气对流处，以防止由于温度变化使层析柱内产生气泡。
通常放在专用的层析冷柜中；1.2.2装柱前取3/4体积的凝胶和1/4体积的缓冲液制成凝胶浆；1.2.3对于经常使用的层析柱，建议使用一个商品化的流动相接头（flow adaptors）。
它对柱床表面有保护作用，还可以避免样品中的大颗粒混入凝胶中，从而延长层析柱的寿命；1.2.4将缓冲液加入层析柱，当有缓冲液流出时关闭柱的出口。
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析法是一种常用的实验室分析技术，它可以将混合溶液分离成不同的成分。
该方法主要利用一种含有疏水性的底物的结构性聚合物（凝胶）作为滤床，通过滤床上物
质的比较灵活的空间配比，利用物质的大小、形状、电荷、形态等分子特性的不同，进行
凝胶过滤层析，实现它们的分离和分离富集提纯加离。
凝胶过滤层析实验室分析中，根据物质与凝胶分子相互作用方式不同，分为离子交换
层析和非离子交换层析两种方式。
离子交换层析中，常用的凝胶有Amberlite XAD-2、Amberlite IR-120等；而非离子交换层析中，常用凝胶有Sephadex G-50、Sepharose 4B、Flysorb V、ComboGel等。
凝胶过滤层析实验属于实验离子交换，首先应正确配置实验设备，然后将原混合胶固
化成凝胶颗粒，最后将混合溶液放入过滤室中，并以规定的渗透速率和浓度进行过滤，
实现各成分的分离和分离技术的提纯。
通过此技术，不仅能有效地分离和提纯高浓度的有
用物质，而且可以获得具有不同性质的物质，获得较高纯度的有用物质。
凝胶过滤层析作为一种相对简单、快捷、可操作性强的实验方法，已广泛应用于药用
植物材料及药物分析、环境污染物实验分析、食品分析、细胞培养分析等领域，可满足实
验研究中分离富集提纯加离的需要。
凝胶过滤层析
【实验目的】掌握凝胶过滤层析的原理及操作方法【实验原理】凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
1、器材：核酸蛋白检测仪、层析柱、水浴锅、真空泵2、试剂：SephadexG-25【实验步骤】（1）凝胶的选择：在经过膜分离后，分子量<5000。
本次实验选用G-25葡聚糖凝胶（分离范围1000-5000）。
（2）柱子的选择：分子量<5000，膜分离后玉米肽中不同的小肽分子量比较接近，属于分级分离，所以选用50*1.6规格的柱子。
（3）干凝胶用量的计算：柱子体积/膨胀度，G-25膨胀度是4~6。
（4）凝胶的预处理：将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。
可以用玻璃棒搅拌，但是不能剧烈，防止凝胶破裂。
多洗几次，尽量洗干净。
自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。
充分溶胀后，进行真空脱气。
（5）洗脱液的选择：本实验采用蒸馏水做洗脱液。
（6）凝胶的填充：将层析柱与地面垂直固定在架子上，然后将处理好的凝胶倒入柱子里，不能有气泡，要防止干柱。
（7）柱平衡：装柱完成后，用洗脱液来平衡柱子，直至核酸蛋白检测系统基线保持水平半个小时以上。
（8）上样：上样量在5%~10%。
（9）标准曲线的制作：本次实验用到还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、杆菌肽（氧化型谷胱甘肽（GSSG），M=612.63；还原型谷胱甘肽（GSH），M=307.33；杆菌肽M=1422.69）。
三种肽各称取0.03g 配成2ml，进行层析，在恒定流速下进行凝胶过滤层析。
凝胶过滤层析的原理
凝胶过滤层析的原理
凝胶过滤层析是一种常用的分离和纯化蛋白质的方法。
它利用了凝胶的孔径大小，将不同分子质量的蛋白质分离开来。
工作原理如下：首先，将凝胶过滤层析柱装满含有孔径较大的凝胶颗粒的柱子。
当混合物被施加于柱子上方时，较大的分子无法通过凝胶颗粒的孔径，而较小的分子可以流过凝胶颗粒，并逐渐被洗脱出来。
这样，分子量较大的蛋白质被留在柱子中，而分子量较小的蛋白质则被洗脱出来。
通过控制凝胶孔径的大小，可以根据目标蛋白质的分子量选择合适的凝胶颗粒。
常见的凝胶颗粒包括琼脂糖、聚乙二醇、聚丙烯酰胺等。
凝胶过滤层析的原理基于凝胶的筛分作用，而凝胶颗粒的孔径大小可以调节分子质量的分离范围。
这种方法在生物化学和分子生物学中广泛应用，用于蛋白质的富集、分离和纯化，为后续的实验和分析提供了可靠的样品。
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分类
以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作为固定相，以水 溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法 称为葡聚糖凝胶过滤层析。
以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀)作为固定相，以有机 溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称 为葡聚糖凝胶渗透层析。
当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此， 要避免与其接触。
葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、 0.05％NaN3或20％乙醇等，不然微生物将生长。
3．吸附性
葡聚糖凝胶系弱酸性物质，这是由于其每克干胶中含 10-20μg当量的羧基基团所致。
羧基基团能与分离物中电荷基团 (尤其是碱性蛋白质) 发生吸附作用。
的多糖链。 这种多糖链在100℃左右时呈液态，当温度下降到
45℃以下时呈固态。 它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环
凝胶过滤层析
gel filtration chromatogra
phy,GFC
定义
凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离
物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻 层析（size exclusion chromatography）、分子筛 层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗 透层析（Gel Permeation Chromatography）
这样，经过层析柱，混合物中的各物 质按其分子大小不同而被分离。
固定相（凝胶）
三维空间网状结构
分子筛效应： 按分子大小不同,在凝胶受到的
阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝 胶柱中的迁移速度不同得到分离。
小分子
固 定 相
样品
流 动 相
大分子
小分子 被延滯
较快流出
基本概念
外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒 间液体流动相的体积。
内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。 基质体积(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积(Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积(Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积
凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）
分配系数（Kd）
每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数
2．稳定性
葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中 是稳定的、不溶解的，而且很少产生化学降解。
在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120℃)消毒0.5h，其 性质并不改变。
在0.1mol／L HCl溶液中浸泡1~2h，甚至在0.02mol／L HCI溶液中 浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。
交联葡聚糖凝胶的化学结构
Sephadex G系列凝胶的分级范围 G10 <700 D G15 <1,500 G25 1,000 ~ 5,000 G-50 1,500~30,000 G-75 3,000~70,000 G100 4,000 ~150,000 G150 5,000 ~400,000 G200 5,000 ~800,000
应用
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多 肽、激素、多糖、核酸类等物质。
分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一 凝胶床就可以完全将它们分开。
利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液 进行脱盐、去热源和脱色。
原理
带网孔的
凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每 葡聚糖珠
个颗粒犹如一个筛子。
Kd=0 0＜Kd<1 Kd=1
大分子量
小分子量
洗脱体积
为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩 散
典型的凝胶类型
交联葡聚糖凝胶：Sephadex������ 聚丙烯酰胺凝胶：Sephacryl ������ 琼脂糖凝胶：Sepharose和Bio-Gel������ 其它：有机凝胶Sepharon，交联聚醚
葡聚糖凝胶
1．理化性质 葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒。 它带有大量的羟基，亲水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极
易膨胀。 由于各种型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，致使如下理化性质在
水中的有明显的差异： 膨胀度(床体积) 吸水量(每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量) 筛孔的大小 分级范围
小分子进入
当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子 葡聚糖珠内 质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔
隙，随进 出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移 动速率慢而最后流出层析柱。
中等大小的分子在大分子物质与小分 子物质之间被洗脱。
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
Ve=Vo+KdVi
(1)Ve = Vo，Kd = 0 分子完全被排阻于凝胶颗粒之外 全部分布于流动相里 最先流出 (2)Ve = Vo + Vi，Kd = 1 分子完全不被排阻 完全向凝胶颗粒内部扩散 在两相分配的比值为1,最后流出
(3) 0 <Kd <1，Ve = Vo +ViKd
特点：与被分离物质分子的 大小和凝胶颗粒孔隙的大小 有关
Toyopeal，纤维素凝胶，改性刚性填料等
葡聚糖凝胶
葡聚糖凝胶（Sephadex）具有 良好的化学稳定性，是目前生 化产品制备中最常用的凝胶。
基本骨架：葡聚糖（dextran）; 交联剂：3-氯-1 ,2-环氧氯丙 烷使葡聚糖之间通过醚键交联 聚合而成的三维空间网状结构
葡聚糖凝胶网孔大小可通过调 节交联剂和葡聚糖的配比及反 应条件来控制。交联度越大， 网孔越小，吸水膨胀就越小。 交联度越小，网孔越大，吸水 膨胀就越大
这种吸附作用可以借助提高洗脱液的离子强度得以克 服。 当离子强度大于0.05时，一般对弱碱性蛋白质就无 吸附力了。 因此，常用含有NaCl的缓冲液作洗脱液。
琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose)
琼脂糖是从琼脂中分离出来的。 在制备过程要将其中含硫酸根和羧基基团的琼脂胶除
去，得到不带电荷基团的琼脂糖。 琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接构成