蛋白含量测定及western步骤

蛋白的提取和定量

肺组织用预冷1×TBS洗净后，加入含PMSF的RIPA buffer（冰上操作，310ul,决定未来的蛋白浓度和蛋白液体积）,50-60mg肺组织砸碎放入1.5ml离心管，冰上孵育1h，10000转4℃离心10min，转上清至新管。裂解液分装后保存于-70℃

蛋白质定量：BCA蛋白测定法

①根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。

②完全溶解蛋白标准品(BCA试剂盒中，BSA原浓度2mg/mL),稀释到1mg/mL。

③将标准品按0，2，5，10，15，20，25 ul标准品孔中，加蒸馏水稀释标准品的

④加样品2uL加到96孔板的样品孔中，加蒸馏水23微升。

⑤各孔加入200微升BCA工作液，37o C放置30分钟。同时打开酶标仪预热。

注：也可以室温放置2小时，或60o C放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适量在较高温度孵育，或延长孵育时间。

⑥测定A570的波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

⑦计算调蛋白时所需TBS和RSB的体积（调所有样品浓度至3-5ug/ul）：

总体积=蛋白体积*蛋白浓度/3（ul）

RSB=1/5*总体积（ul）

TBS=总体积-RSB-蛋白体积（ul）

先加RSB（对蛋白有保护作用），后加TBS。最后放于-70℃保存。

Western Blot

SDS-PAGE

1. 玻璃板：注意对齐、夹紧，防止漏出，短板朝前。

灌至距绿线1cm左右，用dd水封顶，放置30－40min。状况好时往往能观察到

水与胶的界限。

4. 分离胶凝固后，配制浓缩胶。将水倒掉，灌好浓缩胶，立刻插入梳子，等待40min。在此期间，打开水浴锅（100℃）

注：此步后可停止，将胶连同梳子放入4℃保存一夜，若保存时间较长，为防止水分流失，可加盖湿润的滤纸和保鲜膜。

5．电泳前准备好：待测蛋白、Marker、1＊running buffer。蛋白在沸水中煮3－5min。（第二次后不用煮沸）

6．拔梳子，立即用1＊running buffer冲洗孔道（用塑料吸管）。

7．将玻璃板取出，固定于电泳槽（短面冲里－相对），也要牢固，可先将电泳液倒入两玻璃板槽间观察是否渗漏。

注：标记号1、2板及左右。

8．固定好后，加样。

跑道号码加入物质及体积

1 3.5ul Marker (thermo #26616)

2-10 10ul Sample

9．玻璃电泳槽倒满1＊running buffer，电泳液没过电泳槽中的钢丝即可，注意标记好带的顺序。

10.电极

黑对黑红对红，电压100V电泳1－1.5h，等蓝色条带跑出后再等待10－15min。蓝带对应8KD蛋白，根据蛋白样品分子量决定具体的电泳时间，确保不让目标蛋白抛出凝胶。一般可等蓝带完全跑出凝胶后10多分钟停止电泳。

Western-ECL

一、转膜

1. 玻璃板取出，用跷胶片打开，标记好切胶位置，将浓缩胶和分离胶上的空白切掉。切胶时不要划，要切。注意，在右上角切口标记，量胶的长、宽。

2. 将切好的胶（粘在一片玻璃板上）浸入Transbuffer，晃动使胶脱离下来，放上摇床，中速30min。

3. 根据胶的长宽剪滤纸和PVDF膜（不能折，不能用手碰），PVDF膜的右上角与胶一样切口。滤纸不能太大，膜可以大一点。PVDF膜甲醇激活，transbuffer 摇床10min。将滤纸浸入Transbuffer。（Transbuffer不倒掉）

4. 转膜装置:

①滤纸可以采用学校的大张滤纸剪裁，四层叠在一起使用

②三明治由低层向高层为：四层滤纸――膜――胶――四层滤纸，大小要一致

③滤纸、膜、胶都需要用TRANS BUFFER浸透，上面滴加TRANS BUFFER

④ 100伏转印60分钟。

⑤如果转膜结束后不立即做，可以用TRANS BUFFER洗一洗，PBST洗一洗，

晾干，保鲜膜包好后置四度保存。

再用之前，甲醇激活，再用TRANS BUFFER洗一洗，PBST洗一洗。即可封闭

二、杂交

1. 将10*TBS稀释至1*（100ml→1000ml），加入1ml Tween 20（0.1％），即TBST。（Tween较粘稠，把枪头剪掉一块。）

2．配封闭液，脱脂奶粉5g，用量筒加100ml TBST，一般50ml足够（2.5g脱脂奶粉，TBST50ml。）

3.将PVDF膜用PBST洗一下，根据Marker分子量切带（在右上角切口标记,

一定要在平的地方切）。

* 若此时停止当日试验，可将NC膜放在保鲜膜上晾干，包好放入冰箱4℃。待使用时，用PBST洗一下，放入封闭液。

4．正面朝上放入脱脂奶粉中封闭1h，放在摇床上。配杂交液：用小瓶称0.2g BSA，用量筒加入PBST20ml。

5．杂交完毕后，用TBST略洗一下膜，加入杂交液将小条没过（3ml即可，可视情况而定）

6．加入一抗，摇床2h。过夜。

7．取出膜，用洗膜液洗3次，5－15min／次。计算杂交液体积，若不足再配。

8.洗完三次膜加入二抗，摇床1h

9.用洗膜液洗3次，5－15min／次。

三、发光反应

准备：发光板、滤纸、小镊子、1000μl加样器、发光液1，2（按1：1的量混合先白瓶后黑瓶，混匀，注意换枪头）EP管。

显影：将洗完的PVDF膜放入PBST保持膜湿润，排好条带，记住顺序，用滤纸略吸水，放在发光板上，滴加显影液，用枪头滴在PVDF膜上，等20－30s，发光。存盘。

发光后，如要回收条带，收回后蒸馏水洗净，加入一抗二抗清除液，没过条带，摇床10min,蒸馏水漂洗5min,三次。洗净晾干回收。下次再用继续封闭。

备注：

1. 10×TBS

0.2M Tris base (FW121.14) 12.114g

1.5M Nacl (FW58.44) 43.83g

H2O to 500ml

PH=7.2—7.4 with HCL

TBST 1× TWEEN20 TO 0.05﹪

1L 100ml 10× and 500ul TWEEN20

2. RIPA buffer100ml 可订购

Tris 0.607g 溶于90ml水，HCl调PH=7.5，补足到100ml

NaCl 0.8766g

NP40 1ml，

脱氧胆酸0.5g，

SDS 0.1g，

用时按1：1000加入PMSF

每10ml放入一片PhosSTOP

3. PMSF贮备液

配置0.1M储存液，分子量174.19

0.0174g溶于为1ml无水乙醇（或异丙醇），-20摄氏度保存，用时1：1000稀释；