蛋白含量测定及western步骤
Western bloting 检测蛋白质含量变化
Western blotting 检测蛋白质含量变化溶液配方注意事项细节一、细胞收集、蛋白提取及浓度测定1、细胞收集及蛋白提取（1）培养瓶培养的细胞：以25cm2培养瓶培养细胞至90％汇合，加入各种药物处理后，用冷的PBS洗两遍，吸去瓶内培养液（可用枪头尽量吸干净），加入200ul冷的PBS在冰环境下用细胞刮刮下细胞收集到1.5mlEP管中，再用500ul冷的PBS洗培养瓶2遍，所有液体都转到EP管中，3500-4500rpm 4℃离心5min，去上清，弃净PBS，借助另一1.5mlEP管估计细胞体积。
向EP管中加入6-10倍体积细胞裂解液（碧云天强型RIPA裂解液495ulRIPA +5ul 100mM PMSF），在冰上裂解45-60min，期间弹打EP管几次或涡旋使细胞裂解充分，12000rpm 4℃离心30min，上清吸至新的EP管中。
（2）24孔板培养的细胞：去培养液，加冷的PBS冲洗2次，弃净PBS加细胞裂解液60-70ul，冰上裂解60min，期间可反复吹打，裂解后吸至EP管中，12000rpm 4℃离心30min，上清吸至新的EP管中。
2、蛋白浓度测定BCA法测定蛋白浓度（1）取10ul 5mg/mlBSA蛋白标准，加入90ulPBS，得0.5ug/ul BSA标准蛋白工作液（2）取2mlBCA试剂A，加入0.04mlBCA试剂B（50：1），得BCA工作液，此工作液室温24h内稳定。
（3）按下表制备标准曲线及测定样品蛋白浓度编号 1 2 3 4 5 6 7 8 90.5ug/ulBSA标准工作液（ul）0 1 2 4 8 12 16 20PBS（ul）20 19 18 16 12 8 4 0 20-x 样品（ul）x BCA工作液（ul）200 200 200 200 200 200 200 200 200蛋白含量（ug）0 0.5 1 2 4 6 8 10OD570 0以OD562为纵坐标，蛋白含量（ug）为横坐标，以1-8号管做标准曲线，从标准取线上查出样品的蛋白质含量（ug），除以测定样品的体积（ul）即的样品蛋白质浓度（ug/ul）。
WB实验步骤详解
Western实验步骤Western,也称Western blot、Western blotting、Western印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一.Western可以参考如下步骤进行操作。
1。
收集蛋白样品（Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液（P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提,例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028).收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒（P0009/P0010/P0011/P0012)。
2. 电泳(Electrophoresis）（1）SDS—PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS—PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
（2）样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS—PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品.5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X）(P0015)。
100℃或沸水浴加热3—5分钟，以充分变性蛋白。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤Western blot原理及步骤。
Western blot（简称WB）是一种常用的蛋白质分析技术，通过检测特定蛋白在混合物中的存在和量来研究蛋白质的表达和功能。
它是一种通过特异性抗体对蛋白质进行识别和检测的方法，具有高灵敏度和高特异性的特点。
本文将介绍Western blot的原理及步骤，希望能对初学者有所帮助。
一、原理。
Western blot的原理基于蛋白质的电泳分离和免疫检测。
首先，待检样品经过SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜（PVDF）或硝酸纤维素膜上。
接下来，膜上的蛋白质与特异性的一抗结合，再与二抗结合，形成特定的免疫复合物。
最后，通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量。
二、步骤。
1. 样品制备。
将待检样品加入SDS-PAGE样品缓冲液，并在100℃水浴中煮沸5分钟，使蛋白质变性。
然后冷却至室温，并离心去除沉淀物。
2. 凝胶电泳。
将样品加载到SDS-PAGE凝胶孔中，进行电泳分离。
根据蛋白质大小选择合适的分离凝胶浓度和电泳条件。
3. 转膜。
将凝胶中分离的蛋白质转移到PVDF或硝酸纤维素膜上，通常使用半干法或湿法转膜。
4. 封闭。
将转膜浸泡在牛血清蛋白（BSA）或非脂奶粉的封闭缓冲液中，阻断非特异性结合位点。
5. 抗体孵育。
将特异性的一抗加入封闭转膜的缓冲液中，孵育一定时间，使一抗与目标蛋白结合。
6. 洗涤。
用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的一抗。
7. 二抗孵育。
将与目标蛋白特异性结合的二抗加入转膜的缓冲液中，孵育一定时间，形成特异性的免疫复合物。
8. 洗涤。
用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的二抗。
9. 检测。
通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量，最终得到Western blot结果。
总结。
Western blot技术是一种重要的蛋白质分析方法，具有高灵敏度和高特异性的优点。
掌握其原理及步骤对于科研工作者来说至关重要，希望本文能够对初学者有所帮助。
Western blot详细操作过程
Western BlotWestern Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC ）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF ）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
流程：蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE 凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。
实验器材和试剂：一． 蛋白提取试剂1.10% SDS 裂解液：称取10g SDS 粉末加入双蒸水至90mL ，充分溶解，定容至100ml 室温保存。
2.RIPA 裂解液1ml 裂解液工作液配方： 10ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.2ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 5.0ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.9848ml 裂解液0.5ml 裂解液工作液配方： 5ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.1ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 2.5ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.4924ml 裂解液 PMSF 必须摇匀至无结晶时才可与裂解液混合3．蛋白酶抑制剂：100mmol/L PMSF ：17.4mg PMSF 粉末溶于1ml 异丙醇(AR)，分装250ul 每管后－20℃保存。
使用终浓度为1 mmol/L 。
【PMSF ：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。
PMSF 剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险一旦眼睛或皮肤接触了PMSF ，应立即用大量的水冲洗。
WB实验步骤
Western Blotting操作步骤一、蛋白样品制备（1）细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，PBS洗涤一次，用细胞刮刀或胰酶消化细胞后转移至1.5ml EP管中（悬浮细胞直接转移至EP管），1000r离心5min收集细胞，PBS洗涤两次。
2、加入200ul（25cm2培养瓶）含蛋白酶抑制剂的细胞蛋白裂解液（M-PER），置于冰上间歇反复吹打30min，必要时可以超声破碎。
（整个操作尽量在冰上进行，保持低温。
）3、4℃下12000rpm离心15min。
（提前开离心机预冷）4、收集离心后的上清，分装于-80℃保存。
（2）组织总蛋白的提取：1、称取适量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、200ul含蛋白酶抑制剂的组织蛋白裂解液（T-PER），冰上间歇匀浆30min，使组织尽量碾碎至无明显组织碎块。
3、将混合液移至1.5ml离心管中，4℃下12000rpm离心15min，取上清分装，-80℃保存。
二、蛋白含量的测定1、取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（20mg BSA）中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液，-200C可长期保存。
2、取25mg/ml蛋白标准，用0.9%NaCl或PBS稀释至终浓度0.5mg/ml，-200C可长期保存。
3、按50:1的比例混匀BCA试剂A和B制成BCA工作液，工作液24h内稳定。
4、将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20ul加到96孔板中，加标准品稀释液补至20ul。
5、加适当体积待测样品到96孔板中，加标准品稀释液至20ul。
6、各孔加入200ul BCA工作液，370C孵育20—30min或室温放置2h。
7、酶标仪测定A562（540-595nm也可行），根据标准曲线计算样品蛋白浓度。
三、SDS－PAGE电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗洁剂或肥皂用试管刷轻轻擦洗（注意切勿让试管刷的金属把手刮花玻璃板，尽量不要使用洗衣粉，因其含固体颗粒容易损伤玻璃板）。
western-blot-相关试剂及步骤
western-blot-相关试剂及步骤western-blot-相关试剂及步骤Western Blot蛋白测定步骤三蒸水制备后需要高压消毒一、组织的采集（一）器材和试剂准备：镊子、眼科剪、70%乙醇（三蒸水配制）、1.5mL 离心管、液氮（二）步骤（以心脏为例）:1、脱颈椎处死小鼠，读取小鼠编号2、乙醇消毒胸部，剪开胸腔，剪下心脏（一颗心脏约100mg），排除血液，放入离心管，投入液氮中3、组织于-80摄氏度冻存二、组织蛋白的提取：（一）器材和试剂准备：4mL离心管、15mL管、研磨机、镊子、冰盒、离心机、RIPA蛋白裂解液（Radio Immunoprecipitation Assay，详见下载的网页）（碧云天公司）、PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟，详见下载的网页prod号36978，Thermo Scientific）、70%乙醇、三蒸水（二）步骤1、准备好三管10mL70%乙醇、一管三蒸水；取出RIPA和PMSF 解冻2、按照1mLPIRA ：10uLPMSF ：100mg组织的比例，加试剂和组织于4mL离心管3、按照三管10mL70%乙醇、一管三蒸水的顺序依次洗涤研磨钻头（每管5秒），再研磨组织，上下且圆周运动离心管。
每管研磨的转速和时间保持一致。
当出现大量泡沫时即可停止4、静置于冰盒30分钟5、12000rpm，4摄氏度，30分钟6、先取100uL上清于离心管，再取300uL上清于离心管。
前者用于测试，后者备用。
-80摄氏度冻存。
注意：购置的RIPA不宜反复冻融，需分装-80摄氏度保存；PMSF为晶体状，购置后按照说明书溶于异丙醇，分装-80摄氏度保存三、蛋白上样量定量采用BCA法测蛋白（BCA protein assay kit，Prod号23225，详见下载的网页，Thermo Scientific）：（一）器材和试剂准备：1.5mL离心管、BCA测试试剂盒、提蛋白剩余的RIPA蛋白裂解液（二）步骤1、详见BCA Protein Assay Kit.pdf 使用说明书，配制溶液，制作标准曲线，测定蛋白浓度。
Western实验步骤(碧云天公司)
Western实验步骤Western，也称Westernblot、Westernblotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
Western blot(蛋白印迹法)详细步骤
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
western实验原理及步骤
western实验原理及步骤
western实验原理及步骤
western实验是一种分子生物学技术，它可以用来检测特定蛋白质的表达水平。
它的原理是将细胞内的蛋白质从细胞内取出，然后通过电泳来分离，最后将蛋白质用特定的抗体标记，然后用荧光染料检测，最后用荧光显微镜检测，从而检测特定蛋白质的表达水平。
Western实验的步骤包括：
1. 准备实验样本：首先准备实验样本，一般是细胞系或者组织样本，将其分离和提取蛋白质。
2. 电泳：将提取的蛋白质放入凝胶中，然后加入电流，使蛋白质受到电流的作用，从而分离不同的蛋白质。
3. 标记：将分离的蛋白质用特定的抗体标记，以便检测。
4. 检测：将标记的蛋白质用荧光染料检测，然后用荧光显微镜检测，从而检测特定蛋白质的表达水平。
western实验的原理是将细胞内的蛋白质从细胞内取出，然后通过电泳来分离，最后将蛋白质用特定的抗体标记，然后用荧光染料检测，最后用荧光显微镜检测，从而检测特定蛋白质的表达水平。
步骤包括准备实验样本、电泳、标记和检测。
WB实验步骤详解
Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western 可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012)。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
实验二 鱼类肌肉蛋白的提取、蛋白含量测定及其SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及其Western blotting鉴定
实验二鱼类肌肉蛋白的提取、蛋白含量测定及其SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及其Western blotting鉴定一、实验内容1．利用机械破碎和高速离心分离等手段，从不同种类的鱼肌肉中提取水溶性蛋白和盐溶性蛋白。
2．采用紫外吸收法测定以上各蛋白提取液中的总蛋白含量。
3.对以上蛋白提取液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，并利用凝胶成像系统软件对电泳结果进行分析。
4.将以上提取的水溶性蛋白和盐溶性蛋白进行Western blotting鉴定。
二、实验目的和要求1．了解从动物组织中提取蛋白的原理和实验方法。
2．熟悉蛋白质含量测定的各种方法和基本原理，并根据实验结果，比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量的差异。
3．掌握SDS-PAGE的原理和垂直板型凝胶电泳的操作方法，并根据电泳结果，比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白成分的差异。
4．掌握Western blotting操作方法。
三、实验仪器、材料和试剂（一）仪器微量移液枪及枪头、微量离心管（又称Eppendorf 管）、50ml离心管、常用玻璃器皿（见表1）、台式天平、组织捣碎机、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、垂直式电泳槽装置、凝胶成像系统。
（二）试剂准备1．Buffer I（2000ml）：20mM Tris-Cl, pH8.0 。
2．Buffer II（500ml）：Buffer I含有0.5M NaCl。
四、实验操作（一）动物肌肉蛋白的提取1．称取新鲜的淡水鱼或海水鱼剔除鱼鳞、鱼刺及脂肪取肌肉，用刀切碎，称取3g左右，加入30 ml 左右冰冷的Bufffer I（鱼肉[g]：BuffferI[ml]=1:10），在捣碎机中捣碎成匀浆。
2．将以上匀浆转入50ml 离心管中，在4℃下，10000×g，离心15min，将上清和沉淀分开。
3．上清用四层纱布进行过滤除去脂肪，滤液即水溶性蛋白提取液（留样（1.5ml）、量体积、测蛋白含量、SDS化）4．在以上沉淀中，加入30 ml 冰冷的Bufffer I，重悬沉淀，在4℃下，10000×g，离心15min，取沉淀。
蛋白含量测定及western步骤
蛋白含量测定及w e s t e r n步骤 SANY GROUP system office room 【SANYUA16H-蛋白的提取和定量肺组织用预冷1×TBS洗净后，加入含PMSF的RIPAbuffer（冰上操作，310ul,决定未来的蛋白浓度和蛋白液体积）,50-60mg肺组织砸碎放入1.5ml离心管，冰上孵育1h，10000转4℃离心10min，转上清至新管。
裂解液分装后保存于-70℃蛋白质定量：BCA蛋白测定法①根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。
BCA工作液室温24小时内稳定。
②完全溶解蛋白标准品(BCA试剂盒中，BSA原浓度2mg/mL),稀释到1mg/mL。
③将标准品按0，2，5，10，15，20，25ul标准品孔中，加蒸馏水稀释标准品④加样品2uL加到96孔板的样品孔中，加蒸馏水23微升。
⑤各孔加入200微升BCA工作液，37o C放置30分钟。
同时打开酶标仪预热。
注：也可以室温放置2小时，或60o C放置30分钟。
BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。
并且显色反应会因温度升高而加快。
如果浓度较低，适量在较高温度孵育，或延长孵育时间。
⑥测定A570的波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
⑦计算调蛋白时所需TBS和RSB的体积（调所有样品浓度至3-5ug/ul）：总体积=蛋白体积*蛋白浓度/3（ul）RSB=1/5*总体积（ul）TBS=总体积-RSB-蛋白体积（ul）先加RSB（对蛋白有保护作用），后加TBS。
最后放于-70℃保存。
WesternBlotSDS-PAGE1.玻璃板：注意对齐、夹紧，防止漏出，短板朝前。
灌至距绿线1cm左右，用dd水封顶，放置30－40min。
状况好时往往能观察到水与胶的界限。
4.分离胶凝固后，配制浓缩胶。
将水倒掉，灌好浓缩胶，立刻插入梳子，等待40min。
蛋白含量测定及western步骤
蛋白的提取和定量肺组织用预冷1×TBS洗净后，加入含PMSF的RIPA buffer（冰上操作，310ul,决定未来的蛋白浓度和蛋白液体积）,50-60mg肺组织砸碎放入1.5ml离心管，冰上孵育1h，10000转4℃离心10min，转上清至新管。
裂解液分装后保存于-70℃蛋白质定量：BCA蛋白测定法①根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA 工作液，充分混匀。
BCA工作液室温24小时内稳定。
②完全溶解蛋白标准品(BCA试剂盒中，BSA原浓度2mg/mL),稀释到1mg/mL。
③将标准品按0，2，5，10，15，20，25 ul标准品孔中，加蒸馏水稀释标准品的溶液④加样品2uL加到96孔板的样品孔中，加蒸馏水23微升。
⑤各孔加入200微升BCA工作液，37o C放置30分钟。
同时打开酶标仪预热。
注：也可以室温放置2小时，或60o C放置30分钟。
BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。
并且显色反应会因温度升高而加快。
如果浓度较低，适量在较高温度孵育，或延长孵育时间。
⑥测定A570的波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
⑦计算调蛋白时所需TBS和RSB的体积（调所有样品浓度至3-5ug/ul）：总体积=蛋白体积*蛋白浓度/3（ul）RSB=1/5*总体积（ul）TBS=总体积-RSB-蛋白体积（ul）先加RSB（对蛋白有保护作用），后加TBS。
最后放于-70℃保存。
Western BlotSDS-PAGE1. 玻璃板：注意对齐、夹紧，防止漏出，短板朝前。
距绿线1cm左右，用dd水封顶，放置30－40min。
状况好时往往能观察到水与胶的界限。
4. 分离胶凝固后，配制浓缩胶。
将水倒掉，灌好浓缩胶，立刻插入梳子，等待40min。
在此期间，打开水浴锅（100℃）注：此步后可停止，将胶连同梳子放入4℃保存一夜，若保存时间较长，为防止水分流失，可加盖湿润的滤纸和保鲜膜。
蛋白质含量测定法蛋白质沉淀法Western免疫印迹
1 蛋白质含量测定法2 WESTERN PROTOCOL3 Western免疫印迹（Western Blot）4 蛋白质沉淀法5 蛋白质提取的方法总汇1 蛋白质含量测定法本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。
了解各种测定方法的基本原理和优缺点。
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。
目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。
另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。
其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。
定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。
每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。
在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH| + 3H2SO4 ® 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)NH22NH3 + H2SO4 ® (NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4 + 2NaOH ® 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
western实验操作原理及方法
蛋白免疫印迹（Western blotting）实验操作原理及方法一、实验目的：通过本实验，可以特异性的检测蛋白的表达水平。
二、实验原理：1、蛋白浓度测定：考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）存在两种不同的颜色形式：红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，结合后燃料演的有红变蓝，最大光吸收由465 nm变成595 nm。
通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
此反应大约2 min即可完成，并可稳定1小时。
2、SDS凝胶：丙烯酰胺（Acr）和甲叉丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵（ammonium persulfate, (NH4)2S2O8, APS）或核黄素（ribofavin, VB2）和加速剂N, N, N’,N’-四甲基乙二胺（N, N, N’,N’-ytetramethyl ethylenediamine, TEMED）的作用下，聚合成三维网状结构。
* Acr和Bis之比可以决定胶的孔径等因素。
浓缩胶为大孔胶，分离胶为小孔胶。
3、SDS-PAGE电泳：SDS是阴离子去垢剂，由于其带有大量负电荷，当与蛋白结合时，所带电荷大大超过了天然蛋白原有的负电荷，因而消除了蛋白之间原有的电荷差异，则电泳迁移率主要依赖于分子量，而与所带净电荷和形状无关。
三、实验方法及步骤：样品预处理：1、将细胞从平皿上刮下，离心后，用1 X PBS冲洗，12000rpm 1min离心，弃上清，细胞沉淀保存于-80℃。
2、把细胞沉淀取出，加M-PER或T-PER（Thermo，约为细胞体积的2~3倍），悬浮细胞。
10 mL M-PER或T-PER+50μL 200 mM Na3VO4+50μL 200 mM PMSF+1片IN（Roche，酶抑制剂复合物）3、将装有细胞悬液的Doff管固定在4℃层析柜中的脱色摇床上，max speed，剧烈摇1小时。
4、冰上，超声破碎（注意先用纯水清洗探头），AmL=35%超声10s，停顿5s，反复10次（探头不能碰到管壁，且始终保持在液面以下，尽量不要产生气泡）5、重新固定在脱色摇床上，4℃，1 h，max speed。
Westernblot操作步骤[完整版]
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Westernblot操作步骤[完整版]Western blot 操作流程作者：孙雪纯审核人：关宝生发布者：王建宇实验原理：Western,也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
内参:WB过程监测以及目的蛋白定量的标准;最重要和最不可或缺的对照就是内参照。
1.内参可检测整个WB实验过程及体系是否正常工作,如果一个实验连内参照都出不了阳性结果的话（在内参抗体有效的情况下）,那么这个体系就是存在问题的；2、起半定量的标准的作用,内参一般选择管家基因编码表达的蛋白,在很多组织和细胞中都是稳定表达的,因此可以作为检测靶蛋白表达量的标准；内参名称分子量大小适用范围beta-actin 43kDa 胞浆和全细胞GAPDH 30-40kDa 胞浆和全细胞Tubulin 55kDa 胞浆和全细胞VCDA1/Porin 31kDa 线粒体COXIV 16kDa 线粒体TBP 38kDa 细胞核实验步骤一、蛋白样品制备（组织中总蛋白的提取）第一步：法（1）敲取0.07-0.1g组织+400-500ul裂解液，放入打样管，放入打样机打样。
法（2）实验室研钵研磨：取稍大于0.1g的样品放入研钵中，来回磨，至粉末状，用枪头刮取收集入离心管。
注：任何操作都要在液氮中进行，并且要将枪头和离心管提前泡在液氮中。
Western blot具体实验操作步骤
一、提取总蛋白1.将皿中上清吸光后，用外用PBS将皿洗3遍，最后一遍将皿内液体吸光（否则会降低蛋白浓度）。
（亦可先将带有PBS的细胞刮入1.5ml EP管，离心后弃去上清）2.配制裂解液:1ml RIPA裂解液（4度冰箱棕瓶）(0.5M Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl, 1%NP40, 0.5% 去氧胆酸钠, 0.1%SDS)加入5μl PMSF（-20度冰柜内矩形盒小管内）(蛋白酶抑制剂，防蛋白降解).根据皿中细胞团块大小加入100-300μl裂解液, 4℃摇床30min3.皿中液体吸至1.5mlEP管，离心机预冷后， 4℃，12000×g（RCF），离心15min后取上清(装于500μlEP管)（可分装后-20℃保存）。
二、BCA蛋白浓度测定1.按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀；2.完全溶解蛋白标准品（存于-20℃冰箱第一抽屉），取10微升稀释至100微升，使终浓度为0.5mg/ml；3.将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20微升加到96孔板的标准品孔中，用专用生理盐水补足到20微升;4.加1μL样品到96孔板的样品空中，加生理盐水19微升;5.各孔加入200微升BCA工作液，37℃孵箱放置30分钟;6. 570nm波长测定蛋白。
根据标准曲线计算出蛋白浓度EXCEL详细过程：标曲：上一行吸光度，下一行浓度（0，0.5，1，2，4，6，8，10），以此作标曲，标曲相关系数须达两个9，以这次的样品为例，算得两样品浓度分别为4.09和5.26 因为须上样100μg，所以算得须上样的蛋白体积=100/4.09=24.5μL所以上样须补水30-24.5=5.5μL及βme：6×SDS（2：3）为10μL现此样品蛋白体积足够煮10份，即按照245μL蛋白样品+55μL水+100μLβme：SDS（2：3）来配注意：SDS很粘，须涡旋再低速离心，使用枪时须慢吸三、煮蛋白：加样配制: 总体积:40μL（含蛋白液与dH2O混合物30μL+β-meSDS10μL）1.β-巯基乙醇（β-me）：6×SDS（2：3）样品缓冲液10μL2.蛋白取量取一组蛋白中,样品蛋白加的体积=蛋白浓度最低的浓度*30μL/每个样品浓度3.剩余的体积即30μL-样品蛋白加的体积，即为各管需补加水的体积4.多加一点防煮时蒸发部分混和后file22-start100℃煮沸5 min。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项实验方法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸 2 ml；ddH2O118 ml。
WesternBlot实验步骤
WesternBlot实验步骤Western Blot实验步骤Western Blot操作步骤：（一）蛋白样品制备选TRIZOL 法（二）蛋白含量的测定（1）制作标准曲线1、从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。
2、取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0 g，2.5 g，5.0g ，10.0 g ，20.0 g ，40.0 g。
4、混匀后，室温放置2min。
在生物分光光度计（Bio－Photometer，Eppentoff）上比色分析。
5、（2）检测样品蛋白含量1、取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。
室温放置30min后即可用于测蛋白。
2、取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 l，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
3、弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。
4、取一管考马斯亮蓝加95 l 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5 l待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample检测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。
可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。
测得的结果是5 l样品含的蛋白量。
（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
（2）灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面Western Blot实验步骤快到所需高度时要放慢速度。
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蛋白的提取和定量
肺组织用预冷1×TBS洗净后，加入含PMSF的RIPA buffer（冰上操作，310ul,决定未来的蛋白浓度和蛋白液体积）,50-60mg肺组织砸碎放入1.5ml离心管，冰上孵育1h，10000转4℃离心10min，转上清至新管。
裂解液分装后保存于-70℃
蛋白质定量：BCA蛋白测定法
①根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。
BCA工作液室温24小时内稳定。
②完全溶解蛋白标准品(BCA试剂盒中，BSA原浓度2mg/mL),稀释到1mg/mL。
③将标准品按0，2，5，10，15，20，25 ul标准品孔中，加蒸馏水稀释标准品的
④加样品2uL加到96孔板的样品孔中，加蒸馏水23微升。
⑤各孔加入200微升BCA工作液，37o C放置30分钟。
同时打开酶标仪预热。
注：也可以室温放置2小时，或60o C放置30分钟。
BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。
并且显色反应会因温度升高而加快。
如果浓度较低，适量在较高温度孵育，或延长孵育时间。
⑥测定A570的波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
⑦计算调蛋白时所需TBS和RSB的体积（调所有样品浓度至3-5ug/ul）：
总体积=蛋白体积*蛋白浓度/3（ul）
RSB=1/5*总体积（ul）
TBS=总体积-RSB-蛋白体积（ul）
先加RSB（对蛋白有保护作用），后加TBS。
最后放于-70℃保存。
Western Blot
SDS-PAGE
1. 玻璃板：注意对齐、夹紧，防止漏出，短板朝前。
灌至距绿线1cm左右，用dd水封顶，放置30－40min。
状况好时往往能观察到
水与胶的界限。
4. 分离胶凝固后，配制浓缩胶。
将水倒掉，灌好浓缩胶，立刻插入梳子，等待40min。
在此期间，打开水浴锅（100℃）
注：此步后可停止，将胶连同梳子放入4℃保存一夜，若保存时间较长，为防止水分流失，可加盖湿润的滤纸和保鲜膜。
5．电泳前准备好：待测蛋白、Marker、1＊running buffer。
蛋白在沸水中煮3－5min。
（第二次后不用煮沸）
6．拔梳子，立即用1＊running buffer冲洗孔道（用塑料吸管）。
7．将玻璃板取出，固定于电泳槽（短面冲里－相对），也要牢固，可先将电泳液倒入两玻璃板槽间观察是否渗漏。
注：标记号1、2板及左右。
8．固定好后，加样。
跑道号码加入物质及体积
1 3.5ul Marker (thermo #26616)
2-10 10ul Sample
9．玻璃电泳槽倒满1＊running buffer，电泳液没过电泳槽中的钢丝即可，注意标记好带的顺序。
10.电极
黑对黑红对红，电压100V电泳1－1.5h，等蓝色条带跑出后再等待10－15min。
蓝带对应8KD蛋白，根据蛋白样品分子量决定具体的电泳时间，确保不让目标蛋白抛出凝胶。
一般可等蓝带完全跑出凝胶后10多分钟停止电泳。
Western-ECL
一、转膜
1. 玻璃板取出，用跷胶片打开，标记好切胶位置，将浓缩胶和分离胶上的空白切掉。
切胶时不要划，要切。
注意，在右上角切口标记，量胶的长、宽。
2. 将切好的胶（粘在一片玻璃板上）浸入Transbuffer，晃动使胶脱离下来，放上摇床，中速30min。
3. 根据胶的长宽剪滤纸和PVDF膜（不能折，不能用手碰），PVDF膜的右上角与胶一样切口。
滤纸不能太大，膜可以大一点。
PVDF膜甲醇激活，transbuffer 摇床10min。
将滤纸浸入Transbuffer。
（Transbuffer不倒掉）
4. 转膜装置:
①滤纸可以采用学校的大张滤纸剪裁，四层叠在一起使用
②三明治由低层向高层为：四层滤纸――膜――胶――四层滤纸，大小要一致
③滤纸、膜、胶都需要用TRANS BUFFER浸透，上面滴加TRANS BUFFER
④ 100伏转印60分钟。
⑤如果转膜结束后不立即做，可以用TRANS BUFFER洗一洗，PBST洗一洗，
晾干，保鲜膜包好后置四度保存。
再用之前，甲醇激活，再用TRANS BUFFER洗一洗，PBST洗一洗。
即可封闭
二、杂交
1. 将10*TBS稀释至1*（100ml→1000ml），加入1ml Tween 20（0.1％），即TBST。
（Tween较粘稠，把枪头剪掉一块。
）
2．配封闭液，脱脂奶粉5g，用量筒加100ml TBST，一般50ml足够（2.5g脱脂奶粉，TBST50ml。
）
3.将PVDF膜用PBST洗一下，根据Marker分子量切带（在右上角切口标记,
一定要在平的地方切）。
* 若此时停止当日试验，可将NC膜放在保鲜膜上晾干，包好放入冰箱4℃。
待使用时，用PBST洗一下，放入封闭液。
4．正面朝上放入脱脂奶粉中封闭1h，放在摇床上。
配杂交液：用小瓶称0.2g BSA，用量筒加入PBST20ml。
5．杂交完毕后，用TBST略洗一下膜，加入杂交液将小条没过（3ml即可，可视情况而定）
6．加入一抗，摇床2h。
过夜。
7．取出膜，用洗膜液洗3次，5－15min／次。
计算杂交液体积，若不足再配。
8.洗完三次膜加入二抗，摇床1h
9.用洗膜液洗3次，5－15min／次。
三、发光反应
准备：发光板、滤纸、小镊子、1000μl加样器、发光液1，2（按1：1的量混合先白瓶后黑瓶，混匀，注意换枪头）EP管。
显影：将洗完的PVDF膜放入PBST保持膜湿润，排好条带，记住顺序，用滤纸略吸水，放在发光板上，滴加显影液，用枪头滴在PVDF膜上，等20－30s，发光。
存盘。
发光后，如要回收条带，收回后蒸馏水洗净，加入一抗二抗清除液，没过条带，摇床10min,蒸馏水漂洗5min,三次。
洗净晾干回收。
下次再用继续封闭。
备注：
1. 10×TBS
0.2M Tris base (FW121.14) 12.114g
1.5M Nacl (FW58.44) 43.83g
H2O to 500ml
PH=7.2—7.4 with HCL
TBST 1× TWEEN20 TO 0.05﹪
1L 100ml 10× and 500ul TWEEN20
2. RIPA buffer100ml 可订购
Tris 0.607g 溶于90ml水，HCl调PH=7.5，补足到100ml
NaCl 0.8766g
NP40 1ml，
脱氧胆酸0.5g，
SDS 0.1g，
用时按1：1000加入PMSF
每10ml放入一片PhosSTOP
3. PMSF贮备液
配置0.1M储存液，分子量174.19
0.0174g溶于为1ml无水乙醇（或异丙醇），-20摄氏度保存，用时1：1000稀释；
4. 5*RSB10ml PH=6.8
Tris-HCl PH 6.8 0.312M/L 3.12mM*121.14=0.3779gTris
SDS 10% 1g
β-巯基乙醇25% 2.5ml
溴酚兰0.25% 0.025g
甘油50% 5ml
5. 凝胶储备液（30％Acr／Bise）可订购
acrylamide(丙烯酰胺，有剧毒) 29g
N’,N’-Methylenebisa-crylamide 1g，
加ddH2O至100ml。
6. Gel buffer
分离胶：1.5M Tris—HCl PH: 8.8
浓缩胶：0.5M Tris—HCl PH: 6.8
方法：按照Tris的摩尔质量计算所需摩尔浓度（Tris摩尔质量：121.14）
故分别称取Tris 18.171g、6.057g，加蒸馏水90－95ml，然后用PH
计调节溶液PH,最后定容至100ml。
7. 10%SDS
1g SDS加入蒸馏水10ml
8. 10﹪APS
0.1g过硫酸铵加ddH2O至1ml，新鲜配制
9. 10*电泳缓冲液（running buffer）
Tris 30.3g，
甘氨酸144g，
SDS 10g，
蒸馏水定容至1000ml。
（PH = 8.3）
10.Transbuffer:
Tris 3.03g，
甘氨酸14.4g，加水至850ml，再加甲醇150ml
11.封闭液：脱脂奶粉5g，用量筒加100ml TBST，一般50ml足够（2.5g脱脂奶粉，TBST50ml）
12.洗膜液：0.1﹪Tween20,1×TBS
13.杂交液：1﹪BSA,0.1﹪Tween20,1×TBS 几十毫克几毫升！
14.显影液、定影液
15. 5*PBS
NaH2PO4 ·2H2O 1.362g 8.5m mol
Na2HPO4 ·12H2O 16.295g 45.5m mol
NaCl 43.83g 0.75mol
上述药品定容至1000ml。