2018秋生物选修1课件：2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

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4.用活菌计数法统计菌落数时,为什么统计的菌落数目比活菌的实际数 目低? 提示:因为对细菌接种时存在两个或多个细胞相连的现象,当两个或多 个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落。 5.只有能分解尿素的细菌才能在该培养基上生存吗? 提示:不是。一些固氮菌能够固定大气中的氮,也可以在该培养基上生存; 一些微生物虽然不能够分解尿素,但是可以利用尿素分解后的产物作 为氮源,这样的微生物也能在该培养基上生存。 6.统计菌落数目时,选择具有多少菌落数的平板进行计数?教材中第 22 页楷体字部分所列举的两位同学对菌落数的统计,哪位同学的结果更 接近真实值?他们的实验需要改进吗?如果需要,如何改进? 提示:统计菌落数目时,一般选择数目为 30~300 的平板进行计数,目的是 保证结果准确。两位同学的结果都不太接近真实值,他们的实验都需改 进。两位同学都需要重新实验,实验时要至少设置 3 个组别,选择菌落数 为 30~300 的平板计数并且求平均值。
解析:Ⅰ培养基中没有氮源而有碳源,能在Ⅰ培养基上生长的微生物是
异养型的固氮微生物,故甲为异养型的固氮微生物;Ⅱ培养基中没有碳
源,能在Ⅱ培养基上生长的是自养型微生物,故乙是自养型微生物;Ⅲ培
养基中有碳源和氮源,大部分的微生物都能够生长,结合丙不能在Ⅰ、Ⅱ
培养基上生长,可知丙为异养型微生物。
答案:D
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取样涂布(在上述培养基的 9 个平板底面,每三个一组 分别用记号笔写上 104、105、106 倍的三种稀 释液,然后用三支 1 mL 无菌吸管分别由 104、 105、106 倍的三管土壤稀释液中吸取 0.1 mL 对号放入已写好稀释度的平板中,用无菌涂布 器在培养基表面轻轻地涂布均匀)
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二、实验设计
1.实验设计的内容 实验设计包括对实验方案,所需仪器、材料、用具和药品,具体的实验步 骤以及时间安排等的综合考虑和安排。 2.土壤中的微生物 土壤中的微生物主要分布在距地表 3~8 cm 的近中性土壤中,约 70%~90% 为细菌。 3.样品的稀释 因为不同微生物在土壤中含量不同,为保证获得菌落数在 30~300 之间, 适于计数的平板:细菌稀释倍数为 104、105、106,放线菌稀释倍数为 103、 104、105,真菌稀释倍数为 102、103、104。
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4.微生物的培养 不同种类的微生物,往往需要不同的培养温度和培养时间。 细菌一般在 30~37 ℃的温度下培养 1~2 d,放线菌一般在 25~28 ℃的温 度下培养 5~7 d,霉菌一般在 25~28 ℃的温度下培养 3~4 d。在菌落计数 时,每隔 24 h 统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果, 以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 5.菌落的特征 菌落的特征包括菌落的形状、大小、隆起程度、颜色等方面。
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迁移与应用 1 下列是关于检测土壤中细菌总数实验操作的叙述,其中错误的是( )。 A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基,经高温、高压灭菌后倒平板 B.取 104、105、106 倍的土壤稀释液和无菌水各 0.1 mL,分别涂布于各组 平板上 C.将实验组和对照组平板倒置,37 ℃恒温培养 24~48 h D.确定对照组无菌后,选择菌落数在 300 以上的实验组平板进行计数 解析:为保证结果准确可靠,一般选择菌落数在 30~300 的平板进行计数。 答案:D
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迁移与应用 2
甲、乙、丙是三种微生物,下表Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的三种培
养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖;甲能在Ⅰ中正常生长繁殖,
而乙和丙都不能;乙能在Ⅱ中正常生长繁殖,甲、丙都不能。下列说法正
确的是( )。
粉状 硫
10 g Ⅰ+ Ⅱ+ Ⅲ+
K2HPO4 4g
FeSO4 0.5 g
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三、操作提示和结果分析与评价
1.操作提示 (1)取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 (2)应在火焰旁称取土壤。将称好的土样倒入盛有无菌水的锥形瓶中, 塞好棉塞。 (3)在稀释土壤溶液的过程中,每一步都要在火焰旁操作。 (4)实验时要对培养皿做好标记,注明培养基类型、培养日期、平板上培 养样品的稀释度等。 2.结果分析与评价 (1)在细菌分解尿素的化学反应中,细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。 氨会使培养基的碱性增强,pH 升高。因此,我们可以通过检测培养基 pH 的变化来判断该化学反应是否发生。 (2)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂,培养某种细菌后, 如果该细菌能够分解尿素,则 pH 升高,指示剂将变红。
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预习交流 2
由一个细菌通过细胞增殖而形成的肉眼可见的子细胞群体叫做菌落。 (1)构成菌落的单个菌体和菌落分别对应生命系统的哪一层次? 提示:1 个菌体对应生命系统的细胞层次和个体层次;1 个菌落对应生命 系统的种群层次。 (2)构成同一个菌落的细菌遗传物质有何特点? 提示:如不考虑基因突变,构成同一个菌落的细菌应具有相同的遗传物 质,因为细菌的增殖方式不是减数分裂,不发生遗传基因的重组。 (3)如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌株数? 提示:统计某一稀释度下平板上的菌落数,最好统计 3 个平板,计算出平 板菌落数的平均值,然后按公式:每克样品中的菌株数=(C/V)×M 进行计 算,其中,C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V 代表涂布平 板时所用的稀释液的体积(mL),M 代表稀释倍数。
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预习交流 1
筛选菌株所用的培养基具有能满足需筛选微生物正常生长所需的营养 物质或条件,而不利于非筛选微生物的生长。 此类培养基可通过哪些方法来实现其选择作用? 提示:(1)在培养基中加入某种化学物质。例如,加入青霉素可以分离出酵 母菌和霉菌;加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的加入 是在培养成分的基础上加入。 (2)改变培养基中的营养成分。例如,缺乏氮源时可以分离固氮微生物; 石油作为唯一碳源时,可以分离出能消除石油污染的微生物;缺乏碳源 时可以分离自养微生物。 (3)改变微生物的培养条件。例如,将培养基放在高温环境中培养可以得 到耐高温的微生物。
蔗 糖 10 g
Fra Baidu bibliotek
(NH4)2SO4 0.4 g
H2O 100
mL
+
+
+-
+
+
+
-
+
+
+
+
++
+
MgSO4 CaCl2 9.25 g 0.5 g
+
+
+
+
+
+
A.甲、乙、丙都是异养微生物
B.甲、乙都是自养微生物,丙是异养微生物
C.甲是固氮微生物,乙是异养微生物,丙是自养微生物
D.甲是异养微生物,乙是自养微生物,丙是异养微生物
1.“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验步骤 土壤取样(从肥沃、湿润的土壤中,用无菌小铁铲铲去表层土,迅速取土 壤并装入无菌信封密封)
制备培养基(准备选择培养基)
样品的稀释(在火焰旁称取土壤 10 g,放入盛有 90 mL 无菌水的三角烧 瓶中,振荡使土样与水充分混合,将菌分散。制成 10 倍土壤稀释液,用一 支 1 mL 无菌吸管从中吸取 1 mL 土壤悬液注入盛有 9 mL 无菌水的试 管中,吹吸三次,使其充分混匀,制成 102 倍土壤稀释液,以此类推制成 103、 104、105、106 倍土壤稀释液)
预习交流 3
只要培养基中有尿素即可筛选出分解尿素的细菌,这句话对吗? 提示:不对。必须是以尿素为唯一氮源的培养基才能筛选出分解尿素的 细菌。
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一、研究思路
活动与探究 1
1.寻找目的菌株的思路是什么? 提示:根据目的菌株对生存环境的要求,到相应的环境中去寻找。 2.阅读教材第 22 页第一段旁栏中的相关内容,并思考回答下列问题。 (1)在培养基的配方中,为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么 物质?琼脂的作用是什么? 提示:碳源主要是葡萄糖,氮源是尿素。琼脂的作用是作为凝固剂。 (2)该培养基对微生物是否具有选择作用?如果具有,是如何进行选择 的? 提示:该培养基对微生物有选择作用。该培养基的氮源比较特殊,是尿素, 只允许能以尿素作为氮源的微生物生长。 (3)该培养基属于何种类型? 提示:该培养基属于固体培养基,又属于选择培养基。 3.样品中微生物数量的统计思路是什么? 提示:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落来源于样 品稀释液中的一个活菌,通过统计培养基上的菌落数可推知样品中的 活菌数。
缺 点
不能区分死菌与活菌,难以计数微 小的细菌。不适于对运动细菌的计 数;需要相对高的细菌浓度
间接计数法(活菌计数法) 当样品的稀释度足够高时,培养基 表面生长的一个菌落,来源于样品 稀释液中的一个活菌。通过统计平 板上的菌落数,就能推测出样品中 大约含有多少活菌 (1)设置重复组,增强实验的说服力 与准确性。 (2)为了保证结果准确,一定要选择 恰当的稀释度。 (3)选择菌落数在 30~300 的平板计 数,并计算平均值
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3.决定样品稀释度的因素是什么?一般而言,测定细菌、放线菌和真菌数 量所选择的稀释度分别是多少? 提示:决定样品稀释度的主要因素是样品中要测定的微生物的数量,数 量越多稀释度应越大。由于细菌菌体小、繁殖快、数量多,所以稀释度 一般较大,为 104~106 倍;放线菌为 103~105 倍;真菌菌体大、繁殖慢、数 量少,稀释度一般较小,为 102~104 倍。 4.在对菌落计数时,为什么要每间隔 24 h 统计一次菌落数目? 提示:菌种中有些菌体增殖快,有些菌体增殖慢,所以培养时间要充足,使 得每个菌体都能形成肉眼可观察到的菌落。并且选取菌落数目稳定时 的数据作为结果,以防止因培养时间不足而遗漏某些菌落。 5.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是什么? 提示:将一定体积的水用细菌过滤器过滤后,将滤膜放在伊红美蓝培养 基上培养,大肠杆菌菌落呈现黑色,通过计数得出水样中大肠杆菌的数 量。
课题 2 土壤中分解尿素的细菌 的分离与计数
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1.记住选择培养基的用途和配制要求。 2.进行微生物的选择培养和样品中微生物数量的测定。
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一、研究思路
1.课题背景 尿素是一种重要的氮肥,但农作物不能(选填“能”或“不能”)直接吸收利 用,而是首先通过土壤中的细菌将尿素在脲酶的催化下分解为氨之后, 才能被植物吸收。 2.筛选菌株 微生物筛选的原理:人为提供有利于目的菌株生长的条件,同时抑制或 阻止其他微生物生长,如可从热泉中将 Taq 细菌筛选出来。 3.统计菌落数目 (1)测定微生物数量的常用方法有活菌计数法和显微镜直接计数法。 (2)稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目。 ①为了保证结果准确,一般设置多于 3 个平板,选择菌落数在 30~300 的 平板进行计数,并取平均数。 ②统计的菌落数往往比活菌的实际数目少,因此,统计结果一般用菌落 数而不是用活菌数来表示。 4.设置对照 设置对照的主要目的是比照实验组,排除其他因素的干扰,证明确实是 所测试的条件引起相应的结果。
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统计菌落数目的方法
显微镜直接计数法
原 理
利用特定细菌计数板或血细胞计数 板,在显微镜下计算一定容积的样 品中微生物数量
操 作 方 法
(1)用计数板计数时,先将待测样品 制成悬液。(2)取一定量的悬液放在 显微镜下进行计数。(3)根据在显微 镜下观察到的微生物数目来计算出
单位体积内的微生物总数
只能计活菌数,受稀释度影响很大
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二、实验设计
活动与探究 2 1.阅读教材中第 22~23 页“(三)设置对照”内容中的楷体字部分,请帮助 A 同学设置对照实验,以排除其他同学所质疑的可能影响实验结果的因 素。 提示:另增加两个组别:一个不进行接种,但培养条件和其他组别完全相 同,以排除培养基被杂菌污染的可能;另一个接种不能以尿素为氮源的 微生物,培养条件和其他组别完全相同,以排除培养基中混入了其他含 氮物质的可能。 2.为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度? 提示:土壤中各类微生物的数量(单位:个/kg)是不同的,如在干旱土壤中 的上层样本中好氧及兼性厌氧细菌数约为 2 185 万,放线菌数约为 477 万,霉菌数约为 23.1 万。因此,为获得不同类型的微生物,就需要按不同 的稀释度进行分离,同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。