2谷氨酸发酵机制总结

图2-3 黄色短杆菌谷氨酸的代谢调节机制
1-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；2-柠檬酸合成酶；3-异柠檬酸脱氢酶； 4-α-酮戊二酸脱氢酶；5-谷氨酸脱氢酶
(1)优先合成 所谓优先合成，就是对于一个分支合成途径来 讲，由于催化某一分支反应的酶活性远远大于催化另 一分支反应的酶活性，结果先合成酶活性大的那一分 支的终产物。当该终产物达到一定浓度时，就会抑制 该酶，使代谢转向合成另一分支的终产物。谷氨酸比 天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会抑制和 阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸。 α-酮戊二酸合成后由于α-酮戊二酸脱氢酶活性微 弱，谷氨酸脱氢酶的活力很强，故优先合成谷氨酸。
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(2)谷氨酸脱氢酶活性强 谷氨酸产生菌的谷氨酸脱氢酶活性都很 强。该酶以NADP+为专一性辅酶，谷氨酸发酵 的氨同化过程，是通过连接NADP+的L-谷氨酸 脱氢酶催化完成的。沿着由柠檬酸至α-酮戊二 酸的氧化途径，谷氨酸产生菌有两种NADP+专 性脱氢酶，即异柠檬酸脱氢酶和L-谷氨酸脱氢 酶。
在谷氨酸生物合成中必须有谷氨酸脱氢 酶和异柠檬酸脱氢酶的共轭反应。在铵离子 存在下，两者偶联起来形成氧化还原共轭体 系，使α-酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸。 由于谷氨酸产生菌的谷氨酸脱氢酶比其它微 生物强大得多，所以由三羧酸循环所得的柠 檬酸的氧化中间物α-酮戊二酸就不再往下氧 化，而以谷氨酸的形式积累起来。
2 谷氨酸发酵机制
L-谷氨酸是生物机体内氮代谢的基本氨 基酸之一，也是联接糖代谢与氨基酸代谢的 枢纽之一，在代谢上具有比较重要的意义。 L-谷氨酸单钠，通称味精，具有强烈的鲜味， 是一种十分重要调味品，广泛应用于烹调和 食品加工。
目前，全世界谷氨酸钠年产量已达280300万吨，占氨基酸总产量1/2左右。它不 仅在氨基酸工业，而且在整个发酵工业中 也令人瞩目。 1964-1965年我国建立发酵法生产。目 前全国有近30家工厂生产味精，2007年年 产量约191.3万吨，居世界首位。
α-酮戊二酸和氨作用生成α-亚氨基酸，α-亚氨基 酸被还原成α-氨基酸，这一反应称为还原氨基化反应。
（二）转氨酶（AT）催化的转氨反应 α-酮戊二酸+氨基酸 → 谷氨酸+α-酮酸
转氨基反应是由α-酮戊二酸转变成氨基酸的重要反应， 由转氨酶(或氨基移换酶)催化，使一种氨基酸的氨基转移给 α-酮戊二酸，形成新的氨基酸。转氨酶既催化氨基酸脱氨基 又催化α-酮戊二酸氨基化。利用已存在的其它氨基酸，经过 转氨酶的作用，将其它氨基酸与α-酮戊二酸生成L-谷氨酸。
（三）谷氨酸合成酶（GS）催化的反应 α-酮戊二酸+谷氨酰胺→ 2谷氨酸
以上三个反应中，由于在谷氨酸生产菌中谷氨酸脱 氢酶的活力很强，因此还原氨基化是主导性反应。
2.1.2 谷氨酸生物合成的理想途径
由葡萄糖生物合成谷氨酸的途径见图2-1。
图2-1 由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径
图2-1 由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径由上述 谷氨酸生物合成的理想途径可知，由葡萄糖生物合成 谷氨酸的总反应方程式为：
(5)α-酮戊二酸脱氢酶的调节 在谷氨酸产生菌中，α-酮戊二酸脱氢酶 活性微弱。
(6)谷氨酸脱氢酶的调节 谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑 制和反馈阻遏。
在谷氨酸产生菌正常代谢中，谷氨酸 比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量时， 谷氨酸抑制谷氨酸脱氢酶的活力和阻遏柠 檬酸合成酶催化柠檬酸的合成，使代谢转 向天冬氨酸的合成。天冬氨酸合成过量后， 天冬氨酸反馈抑制和反馈阻遏磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶的活力，停止草酰乙酸的合 成。所以，在正常情况下，谷氨酸并不积 累。
(1) 葡萄糖首先经EMP及HMP两个途径 生成丙酮酸。其中以EMP途径为主，生物 素充足时HMP所占比例是38％；控制生物 素亚适量（2～5μg/L），在发酵产酸期， EMP所占的比例更大，HMP所占比例约为 26％。
(2) 生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脱 氢酶系的作用下氧化脱羧生成乙酰CoA，另 一部分经CO2固定反应生成草酰乙酸或苹果 酸，催化CO2固定反应的酶有丙酮酸羧化酶、 苹果酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
2.2.2 糖代谢的调节
谷氨酸的合成除上述调节外，还与糖代谢和氮代谢 的调节有关。 (一）能荷控制 糖代谢的调节主要受能荷的控制，也就是受细胞内 能量水平的控制。糖代谢最重要的生理功能是以ATP的 形式供给能量，在葡萄糖氧化过程中，中间产物积累或 减少时，会引起能荷的变化，造成代谢终产物ATP的过 剩或减少，这些中间产物和腺嘌呤核苷酸(ATP、ADP和 AMP)通过抑制或激活糖代谢各阶段关键酶活性来调节 能量的生成。
（二）控制谷氨酸合成的重要措施
由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径可 知，有三个重要环节可控制谷氨酸的大量生 成，也就是谷氨酸生产菌所必须具备的主要 生化特点。
(1)α-酮戊二酸氧化能力微弱，即α-酮戊 二酸脱氢酶活力微弱 谷氨酸产生菌糖代谢的一个重要特征 就是α-酮戊二酸氧化能力微弱。谷氨酸产生 菌的α-酮戊二酸氧化力微弱，尤其在生物素 缺乏条件下。在铵离子存在下，α-酮戊二酸 因谷氨酸脱氢酶的催化作用，经还原氨基 化反应生成谷氨酸。
2.1 谷氨酸发酵机制
谷氨酸生物合成包括糖酵解途径 (EMP)、磷酸戊糖途径 (HMP途径 )、三 羧酸循环 (TCA) 、乙醛酸循环和 CO2 固 定反应等。
2.1.1 谷氨酸生物合成的主要酶反应
在谷氨酸发酵中，生成谷氨酸的主要 酶反应有以下三种： （一）谷氨酸脱氢酶（ GHD ）所催化的还原 氨基化反应 α- 酮 戊 二 酸 +NH4++NADPH2→ 谷 氨 酸 +H2O+NADP
谷氨酸脱氢酶活力很强，同时NADPH ＋H＋再氧化能力弱，使到琥珀酸的反应受 阻，在过量NH4+存在时，经氧化还原共轭 的氨基化反应而生成谷氨酸。生成的谷氨 酸不形成蛋白质而分泌到菌体外。由于谷 氨酸产生菌不利用菌体外的谷，故谷氨酸 成为最终产物。
2.2.1 优先合成与反馈调节
黄色短杆菌的谷氨酸代谢调节机制如图 2-3所示，以它为例说明以葡萄糖为原料生物 合成谷氨酸主要存在的代谢调节方式。
(3)细胞膜对谷氨酸的通透性高 谷氨酸的分泌可降低细胞内产物的浓度， 消除了谷氨酸转化成其它代谢物的可能，减低 了对谷氨酸脱氢酶的抑制，并使谷氨酸的生成 途径畅通。由生物素亚适量可造成细胞膜对产 物的高通透性。生物素改变细胞膜通透性的机 制与影响细胞膜磷脂的含量及成分有关。还可 通过添加表面活性剂、高级饱和脂肪酸或青霉 素等控制细胞膜对谷氨酸的通透性。通过选育 温度敏感突变株、油酸缺陷型或甘油缺陷型等 突变株也可控制细胞膜对谷氨酸的通透性 。
(三)乙醛酸循环的作用
由于三羧酸循环的缺陷(α-酮戊二酸脱 氢酶活力微弱，即α-酮戊二酸氧化能力微 弱)，为了获得能量和产生生物合成反应所 需的中间产物，在谷氨酸发酵的菌体生长 期，需要异柠檬酸裂解酶催化反应，走乙 醛酸循环途径。
乙醛酸循环中关键酶是异柠檬酸裂解酶 和苹果酸合成酶，它们催化的反应如下：
1.5 C6H12O6 + NH3+4.5O2 → C5H9O4N+4CO2+6H2O
即1.5mol葡萄糖生成1mol谷氨酸，理论糖 酸转化率只有54.4%[147/(1.5×180) ×100%=54.4%]。
实际上谷氨酸发酵时，由于菌体生长、 副产物生成和生物合成所消耗的能量(ATP 等)均消耗了一部分葡萄糖，另外培养基还 有残糖，所以实际糖酸转化率处于54.4%和 81.7％的中间值。
(2)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的调节 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化CO2 固定反应的关键酶，受天冬氨酸的反馈抑 制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏。
(3)柠檬酸合成酶的调节 柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶， 除受能荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏 和乌头酸的反馈抑制。
(4)异柠檬酸脱氢酶的调节 异柠檬酸脱氢酶催化的异柠檬酸脱氢 脱羧生成α-酮戊二酸的反应和谷氨酸脱氢酶 催化的α-酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸的 反应是一对氧化还原共轭反应体系。细胞 内α-酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平 衡，当α-酮戊二酸过量时对异柠檬酸脱氢酶 发生反馈抑制作用，停止合成α-酮戊二酸。
（一）谷氨酸发酵的代谢途径
谷氨酸的合成主要途径是α-酮戊二酸的 还原性氨基化，是通过谷氨酸脱氢酶完成的。 α-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体，它来 源于三羧酸循环，是三羧酸循环的一个中间 代谢产物。由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢 途径如图2-2所示，至少有16步酶促反应。
图2-1 由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径
由于1mol葡萄糖可以生成1mol的谷氨酸，因此理 论糖酸转化率为81.7%(147/180×100%=81.7%)。
上式中四碳二羧酸(草酰乙酸)100%通过CO2 固定反应供给。
2.1.3 谷氨酸发酵的代谢途径
葡萄糖生成丙酮酸后，一部分氧化脱 羧生成乙酰CoA，一部分固定CO2生成草 酰乙酸或苹果酸，草酰乙酸与乙酰CoA在 柠檬酸合成酶催化下缩合成柠檬酸，再经 氧化还原共轭的氨基化反应生成谷氨酸。
在谷氨酸发酵过程中，菌体生长期的 最适条件和谷氨酸生成积累期的最适条件 是不一样的。在菌体生长之后，理想的发 酵应按图2-1由葡萄糖生物合成谷氨酸的理 想途径进行，即四碳二羧酸是100％通过 CO2固定反应供给，理论糖酸转化率为81.7 ％。
倘若固定反应完全不起作用，丙酮酸在丙 酮酸脱氢酶的催化作用下脱氢脱羧全部氧化成 乙酰CoA，通过乙醛酸循环(异柠檬酸裂解生成 琥珀酸和乙醛酸)供给四碳二羧酸(琥珀酸)，反 应如下：
当以葡萄糖为碳源时，CO2固定反应与 乙醛酸循环的比率对谷氨酸产率有显著影 响，乙醛酸循环活性越高，谷氨酸生成收 率越低。因此，在糖质原料发酵生产谷氨 酸时，应尽量通过CO2固定反应供给四碳二 羧酸，减弱乙醛酸循环。
2.2 谷氨酸生物合成的调节机制
谷氨酸产生菌大多为生物素缺陷型，谷 氨酸发酵时通常控制生物素亚适量，引起代 谢失调，使谷氨酸得以积累。 谷氨酸产生菌应丧失或仅有微弱的α-酮 戊二酸脱氢酶活力，使α-酮戊二酸不能继续 氧化。
1磷酸果糖激酶； 2果糖-1,6-二磷 酸酯酶；3柠檬酸 合成酶；4异柠檬 酸脱氢酶； 5反 丁烯二酸酶；6乙 酰CoA羧化酶；7 糖原磷酸化酶；8 糖原合成酶
图2-4 能量生成代谢系的调节
如图2-4所示，当生物体内生物合成或其它 需能反应加强时，细胞内ATP分解生成ADP或 AMP，ATP减少，ADP或AMP增加，即能荷降 低，就会激活某些催化糖类分解的酶或解除 ATP对这些酶的抑制(如糖原磷酸化酶、磷酸果 糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶等)， 并抑制糖原合成的酶(如糖原合成酶、果糖-1,6二磷酸酯酶等)，从而加速糖酵解、TCA循环产 生能量，通过氧化磷酸化作用生成ATP。
CO2固定反应如下：
(3) 草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶催化作 用下，缩合成柠檬酸，进入三羧酸循环，柠檬 酸在顺乌头酸酶的作用下生成异柠檬酸，异柠 檬酸再在异柠檬酸脱氢酶的作用下生成α-酮戊 二酸，α-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体。
(4) α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶作用下经还原 氨基化反应生成谷氨酸。
乙醛酸循环中生成的四碳二羧酸，如琥珀酸、 苹果酸仍可返回三羧酸循环，因此，乙醛酸循环 途径可看作三羧酸循环的支路和中间产物的补给 途径。谷氨酸产生菌通过乙醛酸循环途径进行代 谢，提供四碳二羧酸及菌体合成所需的中间产物 等。但是，在菌体生长期之后，进入谷氨酸生成 期，为了大量生成、积累谷氨酸，最好没有异柠 檬酸裂解酶催化反应，封闭乙醛酸循环。
细胞所处的能量状态用ATP、ADP和AMP之 间的关系来表示，称为能荷(energy charge)。能 荷计算公式为：
从上式可以看出，能荷是细胞所处能量状态 的一个指标。当细胞内的ATP全部转化为 AMP时， 能荷值为0；当AMP全部转化为ATP时，能荷值 为1。可见能荷值在0和1之间变动。已知大多数 细胞的能荷处于0～0.95之间，处于一种动态平 衡。