蛋白质分离与纯化

是指可以穿过质膜的任何酶，大多数是水解
酶，大多数工业用酶是胞外酶。 优点：它比胞内酶容易回收、纯化，不必 将细胞破碎，也不用去核酸，容易获得高产。
2. 胞内酶
是指合成后仍然在细胞内发挥作用的酶。 细胞本身结构的非均一性决定了酶分布和所 处状态非均一，或处于“溶解”状态，或定位 结合于某一特定的亚细胞结构中； 由于细胞器的分工，某些酶对特定细胞来说 是独有或主要的；各细胞器上往往集中了具 各自特征的酶系统（标记酶）。
常用的浓缩方法

超滤法 使用超滤膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方
法。液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，
溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，适于蛋白质和酶的 浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较 好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。
超滤膜及反渗透作用机制
Ultrafiltration
第二节

分离纯化的前处理

选择材料主要根据实验目的而定。工业上通常选择含 量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的 动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上 述问题，只要能达到实验目的即可。 实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料 需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植 物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。 另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理。 若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。
2 蛋白质和酶的提取 提取方法：水溶液提取、有机溶剂提取、混 合提取 选择方法依据：存在部位、分子结构和溶解 性质


大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶 液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。 通常采用类似生理条件下的缓冲液，如20~50m mol/L的磷酸盐缓冲液 (pH7.0~7.5) 或0.1mol/L Tris-HCl (pH7.5~8.0) 缓冲液作提取液。 对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较 多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸， 常在提取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇、丙 酮、异丙醇、正丁醇等。
蛋白质组学实验室所需的条件
蛋白质组研究相关网站

http://www.proteomeworks.bio-rad.com 蛋白质组研究技术、 信息等 http://www.proteinpathways.com 发现新蛋白及新作用（新药 开发） http://www.proteome.med.umich.edu 蛋白质组研究相关企业 、各种仪器来源、新闻等 http://www.proteome.co.uk 各种蛋白质组研究相关信息 http://www.micromass.co.uk 介绍蛋白质鉴定的先进仪器 http://www.expasy.ch 蛋白质鉴定专家系统，Swiss Institute of Bioinformatics http://expasy.proteome.org.au 蛋白质鉴定专家系统， Australian Proteome Analysis Facility http://expasy.cbr.nrc.ca 蛋白质鉴定专家系统，Canadian Bioinformatics Resours
2 物理破碎方法
2.1 温度差破碎法 将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复 几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐 浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
2.2 超声波破碎法 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞 急剧震荡破裂。多适用于微生物材料，用大肠 杆菌制备各种酶，常选用50~100mg菌体/mL浓 度，在1~10kG频率下处理10~15min。缺点是 在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温 措施。 影响因素：样品浓度、超声波频率、功率、破 碎时间 操作：冰浴、间歇进行 适用于悬浮细胞破碎。对超声波敏感和核酸 应慎用。
组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模， 不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法 和条件也不同。



一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎 或用超声波处理破碎。 植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶 等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的 提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能 达到目的。 细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的 骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大 分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与 石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚 糖）。
蛋白质的分子量一般在10000~1000000 Da之间 1 Da＝1×C12绝对质量/12 ≈1.66×10-27 kg
一、分离纯化的意义
1 从生物材料中分离制备蛋白质（酶），研究其结 构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命 现象的本质有重大意义。 2 工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工 业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制 造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。 3 医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。 4 基因工程的需要
二、分离纯化的要求
1 纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研 究蛋白质（酶）一级结构、空间结构，一级结构与功能的 关系、工具酶和标准蛋白、分析用酶制剂，都要求均一； 工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即 可，不要求均一。 2 活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。 3 收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少 损失。而且提纯步骤越多，损失越大。 4 在制备时丢失的蛋白（酶）永远不能在后面实验中弥补。
2.1 水溶液提取
1 机械破碎方法
1. 1 高速组织捣碎机 将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积， 盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关 后，逐步加速至所需速度。适用于动物内脏组 织、植物肉质种子等。 操作：装料，低速→高速 效果：作用强烈，活性物质易受破坏
1. 2 匀浆器 先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回 研磨，上下移动，即可将细胞研碎。细胞破碎 程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动 物脏器组织。 1. 3 研磨器 石英砂

How to isolate total protein


裂解细胞； 溶解的蛋白质； 必须使用含表面活性剂的蛋 白质提取缓冲液来溶解膜蛋 白
4Hale Waihona Puke Baidu酶破碎法




细菌：用溶菌酶，能专一性的作用于肽多糖的 β-1,4糖苷键。 酵母菌：蛋白酶（作用于蛋白质-甘露聚糖） ，再加入葡聚糖酶，再改变渗透压使细胞膜破 裂，因为酵母壁厚，难破碎。 霉菌：几丁质酶 植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶混 合使用。
三、分离纯化的原则

所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀 防止在样品制备过程中发生的化学修饰（如酶 性或化学性降解等）

去除样品中的核酸和某些干扰蛋白等杂质
四、分离纯化的一般程序
分离纯化一般可分为以下几个阶段： ① 材料的选择和预处理 ② 破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞 器的分离） ③ 分离纯化：包括粗分级分离和细分级分 离其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前 处理。
3 化学破碎法
原理：化学试剂改变或破坏细胞膜结构 常用试剂：有机溶剂、表面活性剂 十二烷基磺酸钠、去氧胆酸钠
提取蛋白质缓冲液中常用的 表面活性剂

非离子表面活性剂 (温和 ) Triton X-100：打破脂-脂相互作用和脂-蛋白质相互作用 阴离子表面活性剂 (more denaturing) SDS：打破蛋白质相互作用 脱氧胆酸钠：打破蛋白质相互作用
一、细胞破碎

分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子 从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，
并保持原来的天然状态，不丢生物活性。因此应
选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是
体液（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则
不必进行组织细胞的破碎。
微生物合成后分泌的酶有两种
1. 胞外酶（分泌型酶）
细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细 胞还有叶绿体。 如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为 了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染， 还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某 一物质。 细胞器的分离一般采用离心法，即将破碎后的细胞在适 当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠 檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同， 经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经 多次分步离心后，即可获得所需组分。
细胞器碎片
溶酶体
粒线体
过氧化物酶体
三、提取
1 提取的基本概念与影响因素 提取（抽提或萃取）：组织细胞破碎过程中， 大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来，必须 立即将其置于一定溶剂中，让制备物充分溶解， 并尽可能保持原来的天然状态，避免因长久放 置造成制备物的分解破坏。 主要影响因素：a 欲提取的物质在所用的溶剂中 的溶解度；b 该物质向溶剂扩散的难易 溶解度大小：a 溶剂（相似相溶）；b 温度；c 等电点
Where are the proteases from when isolating the protein?

动物细胞： 溶酶体，含有
大量的水解酶降解样品中的 蛋白质和其他物质

植物细胞：液泡，发现许
多类在动物细胞中溶酶体似 的水解酶 其他细胞器也有蛋白酶
蔗糖密度梯度超速离心细胞器
10％~40％蔗糖密度梯度的制作： 首先配置好不同百分比(w/w) 的蔗糖溶液，然后在与离心转头 相匹配的离心管中先加入浓度最 低(10%)的溶液，然后用吸管加 入浓度稍高的溶液。 加时吸管要插入离心管的底部， 缓慢加入，务求界面分明。然后 按上法依次分层加入其余各浓度 的蔗糖溶液。 将事先用更低密度蔗糖溶液 (小于10%)悬浮的样品轻轻加入 10%蔗糖溶液的表面。
标记酶的种类
质膜： 主要两种：Na+、K+-ATP酶、腺甘酸环化酶； 细胞核：主要是担负DNA与RNA合成的酶。如RNA甲基 转移酶、乳酸脱氢酶等；
线粒体：主要集中了参与三羧酸循环、脂肪酸氧化、呼吸
链、氧化磷酸化等与能量代谢有关的酶和酶系。 如 NADH脱氢酶、己糖激酶等；
溶酶体：各种水解酶（约60种左右）；
蛋白质（酶）的分离与纯化
第一节
引言
蛋白质（酶）、核酸存在于一切生物体中， 是非常重要的生物大分子。蛋白质（酶）是 生物功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别等多 种生理功能； 核酸是遗传信息的携带者，在生物体中指 导各种蛋白质（酶）的合成。
DNA
RNA
Protein
大分子
盐 水
渗透压 纯 水
水
小分子
反渗透
Reverse osmosis
纯 水
水
超过滤——除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质
加压
蛋白质溶液 半透膜 支持膜的栅板
超滤液
胞内酶需要破碎细胞
尽可能减少蛋白水解/其它形式降解


机械法（超声波法、高压法、机械匀浆法） 化学法（去污剂法） 物理法（液氮研磨法、循环冻融法、渗透 法、玻璃珠破碎法） 酶法
内质网：蛋白质合成、脂类合成、药物转化的酶。如细胞 色素还原酶、胆固醇酰基转移酶。
胞外酶常需要浓缩培养液


减压蒸发浓缩 通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高 ，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，适用于一些不耐热的生 物大分子的浓缩。 吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用 的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附 ，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯 酮、蔗糖和凝胶等。使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大 分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度 下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水 饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
细胞破碎确认
1.直接测定破碎前后的细胞数： 破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数 破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。 2.测定导电率： 利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。 3.测定释放的蛋白质量或酶活力： 测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破 碎率。
二、细胞器的分离