蛋白质分离与纯化
蛋白质的分离与纯
溶液中加入一定量的中性盐如[NH4]2SO4 A 由于 [NH4]2SO4的亲水性比蛋白质亲水性大，能与大 量的水分子结合，使蛋白质表面水膜退化、消失； B [NH4]2SO4解离，中和了蛋白质颗粒所带的电荷，破 坏蛋白质表面电荷层而沉淀析出
（二）有机溶剂沉淀蛋白质： • 凡能与水以任意比例混合的有机溶剂， 如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀 蛋白质。 • 沉淀原理是：① 脱水作用；② 使水的 介电常数降低，蛋白质溶解度降低。 • 为了防止蛋白质在分离过程中发生变性， 有机溶剂浓度不能太高 (30%-50%) ，而且 需要在低温条件下进行。
Ion exchange chromatography 离子交换层析（2）
Ion exchange chromatography 离子交 换层析（3）
Ion-exchange chromatography exploits differences in the sign and magnitude of the net electric charges of proteins at a given pH. The column matrix is a synthetic polymer containing bound charged groups; those with bound anionic groups are called cation exchangers, and those with bound cationic groups are called anion exchangers. Ion-exchange chromatography on a cation exchanger is shown here. The affinity of each protein for the charged groups on the column is affected by the pH (which determines the ionization state of the molecule) and the concentration of competing free salt ions in the surrounding solution. Separation can be optimized by gradually changing the pH and/or salt concentration of the mobile phase so as to create a pH or salt gradient.
蛋白质分离纯化
性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。 (3)粗提: 离心除去固体杂质后，可经过沉淀法、超
滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。 (4)精制：可用层析法、电泳法等进行精制。 (5)成品加工：测定蛋白质旳性质并干燥成成品。
－5℃，25％乙醇沉淀卵清蛋白。
蛋白质旳纯化措施
等电点沉淀法
蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分 子之间旳静电排斥力最小，因而轻易汇集 形成沉淀。
当蛋白质混合物溶液旳pH 被调到某一成份 旳等电点时，则该蛋白质大部或全部将沉 淀出来。而那些等电点高于或低于该pH 旳 蛋白质依然留在溶液中。
该法合用于在等电点pH稳定旳蛋白质。
b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂
+
基质
c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离
+
+ 杂质
基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex
应用
分离纯化酶、 抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶旳构造与功能
d. 偶联复合物经解离后，得到纯旳待纯化分子
+
蛋白质旳纯化措施
在外电场旳作用下，带电颗粒将向着与其电性 相反旳电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质 溶液旳pH值不等于等电点时，蛋白质颗粒均带 有不同旳电荷。因为不同蛋白质旳分子量不同， 所带旳电荷不同，因而在电场中移动旳速度也 不相同。
用已知分子量旳蛋白质作为原则，则能够估算出 不同蛋白质旳分子量。
离心技术
1．离心机类别 一般离心机 6000转/分 高速离心机 2-3万转/分 超速离心机 3万转/分
2．沉降系数（S）概念
蛋白质的分离与纯化
（1）凝胶的选择：
。
（2）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀
后，配成
。
（3）凝胶色谱柱的装填方法
① 固定：将色谱柱处置固定在支架上
② 装填：将
一次性的缓慢倒入 内，装填时轻轻敲动色谱柱，
使凝胶填装均匀。
③ 洗涤平衡: 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在 高的操作压下，用
3、具体过程：
相对分子质量 较小的蛋白质
（1）
（2） （3） （4）
（5）
相对分子质量 较大的蛋白质
A B
A
的蛋白质由于
作用进入凝胶颗粒内部而被滞
留；
的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间
迅速通过。
B（1）
混合物上柱；
（2）洗脱开始，
的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；
的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；
（3）
子
以及分子本身 、
的不同使带电分子产
生不同的
，从而实现样品中各种分子的分离。
3、分类： 琼脂糖凝胶电泳 聚丙稀酰胺凝胶电泳。
测定（ 蛋白质相对分子质量 ）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶
电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的
大小等因素。为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入
(4) 透析
2. 凝胶色谱制作
1）凝胶色谱柱的制作
① 取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
② 底塞的制作：打孔 挖出凹穴
安装移液管头部 覆
盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；
b、在橡皮塞顶部切出锅底状的 ，在0.5ml的 头部切
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化方法根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。
根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。
透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。
超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。
它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。
由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。
所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。
当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。
例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。
使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。
常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。
可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。
密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。
蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。
凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。
凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。
蛋白质的分离、纯化和鉴定
三、蛋白质的胶体性质与蛋பைடு நூலகம்质沉淀
蛋白质是亲水胶体。 1. 蛋白质是亲水胶体。 水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。 水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。
球状的水溶性蛋白疏水基团借疏水作用聚合在分 子内部， 子内部，而亲水基团则分布于表面与周围水分子 结合形成水化层； 结合形成水化层； 水化层 同时蛋白质表面的可解离基团带有相同的净电荷， 同时蛋白质表面的可解离基团带有相同的净电荷， 与其周围的反离子构成稳定的双电层。 与其周围的反离子构成稳定的双电层。 双电层
影响盐析的因素有： 影响盐析的因素有： 温度 pH值 值 蛋白质浓度 常用的中性盐主要有硫酸铵， 常用的中性盐主要有硫酸铵，优点是温度系数小而溶 解度大 。
※ 有机溶剂沉淀反应
：用与水互溶的乙醇、丙酮等夺取 用与水互溶的乙醇、
水膜，降低介电常数，增加蛋白质之间的相互作用， 水膜，降低介电常数，增加蛋白质之间的相互作用，使 蛋白质颗粒凝集而沉淀。不同蛋白质所需溶剂浓度不同， 蛋白质颗粒凝集而沉淀。不同蛋白质所需溶剂浓度不同， 可进行分级沉淀，但易引起变性，与有机溶剂浓度、 可进行分级沉淀，但易引起变性，与有机溶剂浓度、作 用时间和沉淀温度有关。 用时间和沉淀温度有关。 例如：丙酮沉淀。使用丙酮沉淀时，必须在 ～ ℃ 例如：丙酮沉淀。使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温 下进行，丙酮用量一般 倍于蛋白质溶液体积 倍于蛋白质溶液体积。 下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质 被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外， 被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙 醇沉淀。 醇沉淀。
（2）不可逆沉淀
在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性， 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性， 而且也破坏了蛋白质的结构和性质， 而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可 能再重新溶解于水。 能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构 和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐 沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。 沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。
蛋白质分离和纯化技术的研究和应用
蛋白质分离和纯化技术的研究和应用蛋白质是生物体内最基本的分子，其担负着细胞结构与功能、物质转运、信号传递等重要生理功能。
由于生物样品中蛋白质种类众多、含量差异较大，为了深入揭示蛋白质的生物学功能和结构特性，必须对蛋白质进行精确分离和纯化。
本文将介绍蛋白质分离和纯化技术的研究和应用。
一、蛋白质分离技术蛋白质分离是指将复杂的蛋白质混合物进行分离，得到不同种类的纯化蛋白质的过程。
在蛋白质分离的基础上，再进行进一步纯化，能够更好地揭示蛋白质的生物学特性。
（一）凝胶电泳凝胶电泳是当前最常用的蛋白质分离技术之一。
它基于蛋白质的电荷、大小、形状和亲疏水性等性质，利用电场将蛋白质分子沿着凝胶移动，实现分子大小的分离。
凝胶电泳具有分离效果好、操作简单易行、样品消耗量小以及可视化等优点。
（二）液相色谱液相色谱（Liquid chromatography）是一种通过化学亲和性、分子大小、极性与非极性等属性分离物质的分离技术。
常用的液相色谱有透析液相色谱、醚基、硅烷基、反相、离子交换、凝胶过滤等类型。
其中反相色谱在蛋白质分离中尤为重要，它基于不同蛋白质在疏水性基质表面的分配系数不同，以蛋白质的亲水性为基础进行分离。
二、蛋白质纯化技术蛋白质纯化是指在获得蛋白质的基础上，通过不同的纯化技术去除其中的杂质，得到纯度高的蛋白质分子。
蛋白质的纯化技术主要分为两类：非特异性纯化和特异性纯化。
（一）非特异性纯化非特异性纯化是指利用物理化学性质对样品进行分步纯化，将目标分子与混杂物质逐步分离开来的方法。
常用的非特异性纯化技术有盐析、凝胶过滤和透析等。
其中，盐析技术是常用的一种非特异性纯化技术，它利用富集目标蛋白质对盐的结合能力高于混杂蛋白质的特性，将混杂蛋白质和目标蛋白质分离。
（二）特异性纯化特异性纯化是指通过蛋白质与配体、抗体等生物学活性团之间的特异作用进行分离纯化的方法。
常用的特异性纯化技术包括亲和层析、免疫亲和层析等。
其中，亲和层析是一种重要的特异性纯化技术，它通过识别目标蛋白质与固定于固相材料上的亲和基团之间的特异性互作来分离纯化蛋白质。
蛋白质的分离、纯化
胰岛素的分离纯化
胰岛素是一种由胰腺分泌的激素， 具有降低血糖的作用。胰岛素的 分离纯化通常采用离子交换色谱
和结晶法。
胰岛素的分离纯化对于治疗糖尿 病具有重要意义。纯化的胰岛素 可以用于注射，帮助糖尿病患者
控制血糖水平。
在胰岛素的分离纯化过程中，需 要特别注意避免蛋白质的聚集和 变性，以确保产品的安全性和有
利用半透膜，根据不同物质之间的分 子大小和形状差异进行分离。
色谱分离
利用不同物质在固定相和流动相之间 的吸附、分配等作用力差异进行分离。
蛋白质的纯度鉴定
化学分析
电泳分析
利用蛋白质中的特定化学基团进行定量分 析，如测定氨基酸组成和序列、测定肽键 等。
利用不同蛋白质在电场中的迁移率差异进 行分离，再通过染色或放射自显影等技术 进行检测。
有机溶剂沉淀法
利用有机溶剂降低水的介电常数，使 蛋白质发生沉淀。常用的有机溶剂有 乙醇、丙酮等。
离心法
高速离心法
利用高速旋转产生的离心力使溶液中 的悬浮颗粒沉降，从而实现蛋白质的 分离。
超速离心法
在高速离心的基础上，利用密度梯度 离心技术，将不同密度的蛋白质进行 分离。
膜分离法
微滤
利用微孔滤膜，将溶液中的悬浮颗粒和微生物截留，从而实现蛋白质的分离。
蛋白质在水中的溶解度 受pH、离子强度、温度 等因素影响。不同蛋白 质具有不同的溶解度。
蛋白质的分离纯化方法
沉淀法
利用蛋白质的溶解度差异，通过改变 某些条件（如pH、离子强度、温度 等）使蛋白质沉淀析出。
离心分离
利用离心机的高速旋转产生的离心力， 根据不同物质之间的密度和沉降系数 差异进行分离。
膜分离
血红蛋白的分离纯化通常采用色谱技术，如凝胶过滤色谱和离子交换色谱。这些技术可以根据蛋白质 的大小、电荷和疏水性等性质进行分离。
蛋白质的分离和纯化的方法
蛋白质的分离和纯化的方法
蛋白质分离纯化常用方法有：
1、沉淀；
2、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。
根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。
3、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。
4、层析：
a.离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定PH时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。
如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来f
b.分子筛，又称凝胶过滤。
小分子蛋白质进入孔内，滞留时间长，大分子蛋白质不能时入孔内而径直流出。
5、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。
不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。
蛋白质的分离纯化
度最大,向上逐渐减小
常用的密度梯度有 蔗糖梯度(图) 聚蔗糖梯度 其他合成材料的密度梯度 蔗糖便宜，纯度高，浓溶液（60％，w/w）密度可达1.28g/cm3。 聚蔗糖的商品名是Ficoll，它是由蔗糖和1- 氯-2,3-环氧丙烷合成的 高聚物，Mr 约400000。
需要高密度和低渗透压的梯度时，可用Ficoll代替蔗糖。
脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。
2、粗分级分离
盐析 方法 等电点沉淀 有机溶剂分级分离 蛋白质提取液体积较大，则可采用 超过滤 凝胶过滤 冷冻真空干燥 或其他方法（如聚乙二醇浓缩法） 特点 简便 处理量大 既能除去大量杂质（包 括脱盐），又能浓缩蛋 白质溶液
3、细分级分离
凝胶过滤 一般使用层析法 包括
第三节 蛋白质的分离纯化
一、蛋白质分离纯化的一般原则：
蛋白质纯化的总目标 增加制品的纯度或比活 (1)前处理：把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态
蛋 释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生 白 质 物活性。 的 分 (2)粗分级分离：将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。 离 纯 (3)细分级分离：样品的进一步纯化。 化 步 (4)结晶：是蛋白质分离纯化的最后步骤。 骤
盐析法的一般操作是：
选择一定浓度范围的盐溶液（如0-25%饱和度硫酸铵），使部
分杂质呈“盐析”（沉淀）状态，有效成分呈“盐溶”（溶解
）状态。经离心分离后得到上清液，再选择一定浓度范围的盐 溶液（如25%-60%饱和度的盐溶液），使有效成分等物质呈盐 析状态，而另一部分杂质呈盐溶状态，用离心法收集的沉淀物 即为初步纯化的有效成分物质。
过硫酸铵
丙烯酰胺、Bis和TEMED的水溶液
激活 TEMED 通过Bis交联 ②光聚合: 活化 聚合
分离纯化蛋白质的方法及原理
分离纯化蛋白质的方法及原理
蛋白质纯化是生物分子的一项重要技术，它是分子生物学的核心技术之一，也是蛋白质结构及功能的研究的基础。
它可以从生物样本中分离出蛋白质，研究其结构、性质、功能及相关特性。
根据蛋白质纯化的原理和方法，可以分为物理法、化学法和生物学法等。
1.物理法
物理法是纯化蛋白的最简单方法之一，通常通过使用力场或温度去把一定浓度的蛋白质从溶质中萃取出来。
物理法不耗费能量也不会改变蛋白质的化学结构，不改变蛋白质的结构和功能，但有时可能会引发蛋白质的活性降低，因为櫛发性和相互之间复合物的结合可能会受到改变。
例如分子筛膜技术、沉淀离心技术等。
2.化学法
化学法是一种可以改变蛋白质结构的方法，一般是通过有机溶剂或水溶性固定相，以水或有机溶剂和化学试剂实现蛋白质的分离和纯化。
化学法可以破坏蛋白质的活性，从而改变其化学结构和功能，或者通过改变蛋白质的电性或物理状态来实现蛋白质的分离和纯化。
例如偏光技术、电泳技术、蛋白质酶剪切技术等。
3.生物学法
生物学法是一种比较复杂的蛋白质分离方法，是利用特定生物因子。
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化一，蛋白质（包括酶）的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。
为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。
用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。
同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。
升浓度为宜。
缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必须在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。
蛋白质分离和纯化是蛋白质组学研究中必需的技术
蛋白质分离和纯化是蛋白质组学研究中必需的技术蛋白质组学是研究生物体内蛋白质种类、结构、功能及其相互作用的学科，是在基因组学研究的基础上，通过高通量技术对蛋白质实现全面分析的一门学科。
而蛋白质分离和纯化则是蛋白质组学研究中最常用的技术手段。
一、蛋白质分离技术蛋白质组学研究中最重要的技术之一就是蛋白质分离技术，这是将复杂的蛋白质混合物分离成单一蛋白质易于研究的过程。
蛋白质分离技术可以根据蛋白质的物理化学性质和结构特征来进行分离。
目前常用的蛋白质分离技术有以下几种：1.凝胶电泳技术凝胶电泳是一种以电泳为基础的分离技术，是实验室中最常用的蛋白质分离技术。
凝胶电泳有许多种类型，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-PAGE、二维凝胶电泳等，其中SDS-PAGE技术最为常用。
SDS-PAGE技术能将分子量相近的蛋白质分离出来，便于后续的鉴定和纯化。
2.色层分离技术色层分离技术以蛋白质的同种电性、不同待测的酶活性（或它的纯化协因子）进行分离。
常见的色层分离技术有离子交换色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、逆向水相色谱和氢氧化铝柱等。
3.分子筛分离技术分子筛分离技术是一种利用分子质量大小差异进行分离的方法，分子筛通常是指分子筛柱，目前广泛采用的是分子排斥色谱柱，一般以戊二醛或者聚山梨醇等为填料，能有效地分离小分子杂质和行动质量与待纯化蛋白质分子量大致相同的杂质。
二、蛋白质纯化技术蛋白质分离并不能直接得到纯净的蛋白质，还需要进行蛋白质纯化。
通常是利用某些特异性技术或单一的物理和化学性质将蛋白质分离出来。
目前常用的蛋白质纯化技术有以下几种：1.亲和层析技术亲和层析是指通过一种化合物(即配体）固定在搭载材料上，然后靶汔蛋白通过目标亲和化合物和固定在搭载材料上的配体之间相互作用，以此达到纯化目的。
2.透析技术透析是将有机化合物从高浓度的介质中移到低浓度的介质中的方法，以此去除杂质并使蛋白质获得更好的空间构象。
3.分子排除色谱技术分子排除色谱以分子量为依据，通过选择性分离小分子与大分子之间的区别来达到去除杂质和获得纯化的蛋白质。
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化方法2.1根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开，并使蛋白质混合物也得到分离.根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。
透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液进行分离。
超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。
它们经常和盐析、盐溶方法联合使用，在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐.由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢，截流物质的分子量也越来越小。
所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。
当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。
例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中，加入纤维素酶和α—淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3］。
使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度（区带）离心。
常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度.可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。
密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白，得到的产品纯度高但产量偏低。
蒋辰等［6］通过比较不同密度梯度介质的分离效果，利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白.凝胶过滤也称凝胶渗透层析，是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。
凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之，比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外.目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。
蛋白质的分离和纯化
柱的顶端,不要破坏凝胶面
4.纯度鉴定---SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳
三、蛋白质提取分离的程序以血红蛋白的分离纯化为例
蛋白质的提取和分离一般分为四步： 1 样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释 放；分离血红蛋白溶液, 2 粗分离：薄膜透析法除去分子较小的杂质, 3 纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂 质蛋白质除去, 4 纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,
酸缓冲液处理的目的是
D
A.防止血红蛋白被O2氧化
B.血红蛋白是一种碱性物质,需要酸中和
C.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
D.让血红蛋白处在稳定的pH范围内,维持其结 构和功能
5、下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的
处理措施中,错误的是
A
A.采集血样后要高速短时间离心获得血细胞
B.洗涤三次后如上清液仍有黄色,可增加洗涤 次数,否则血浆蛋白无法除净,
2、下列关于血红蛋白提取和分离实验中样品
处理步骤的描述,正确的是 C
A.红细胞的洗涤：加入蒸馏水,缓慢搅拌,低速 短时间离心
B.血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯,置 于磁力搅拌器上充分搅拌
C.分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心、 过滤后,用分液漏斗分离
D.透析：将血红蛋白溶液装入透析袋,然后置 于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12h
1、下列关于DNA和血红蛋白的提取与分离属
于的叙述中,错误的是 A
A.可用蒸馏水涨破细胞的方法从猪红细胞中 提取到DNA和蛋白质
B.用不同浓度的NaCl溶液反复溶解于析出 DNA可去除部分杂质
C.透析法分离蛋白质的依据是利用蛋白质不 能通过半透膜的特性
蛋白质的分离与纯化
蛋白质分离纯化的技术流程
蛋白质的分离：利用蛋白质的物理性质和化学性质进行分离，如离心、过滤、沉淀等。
蛋白质的纯化：通过一系列的层析技术、电泳技术等，将蛋白质从复杂的混合物中分离 出来，得到高纯度的蛋白质。
蛋白质的检测：利用蛋白质的生物活性或化学性质进行检测，如免疫分析、质谱分析等。
蛋白质的保存：将分离纯化后的蛋白质进行适当的保存，如低温、干燥等，以保持其生 物活性和稳定性。
蛋白质的稳定性和活性：在分离和纯化过程中，如何保持蛋白质的稳定性和活性是一个重要的问题。一些物理和化学因素可能会导致 蛋白质变性或失活，从而影响其结构和功能。
生物安全和伦理问题：在分离和纯化过程中，需要考虑生物安全和伦理问题。例如，某些病毒或细菌可能会污染蛋白质样 品，因此需要采取适当的措施来确保样品的安全性。同时，在研究过程中也需要遵守伦理规范，确保研究符合道德要求。
步骤：平衡、上 样、洗脱、再生
优点：分辨率高、 分离效果好
疏水相互作用色谱法
原理：利用蛋白质的疏水性差异进行分离
填料：疏水性配基附着在硅胶或琼脂糖颗粒上 操作条件：通过改变流动相的离子强度或极性，选择性地对蛋白质进行洗 脱 应用：适用于蛋白质的精细分离纯化，特别是那些具有强疏水性的蛋白质
亲和色谱法
蛋白质的分离技术
沉淀法
原理：通过改变蛋白质的溶解度或带电状态，使其从溶液中析出 方法：包括盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法等 优点：操作简单、成本低 缺点：可能会产生大量杂质，影响蛋白质的纯度
离心分离法
原理：利用离心机的高速旋转产生 的离心力使不同密度的蛋白质分离
优点：操作简便，分离效果好
在农业领域的应用
提高农产品品质和产量 培育抗逆性强的新品种 促进植物生长和发育 增强植物抗病虫害能力
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细胞器碎片
溶酶体
粒线体
过氧化物酶体
三、提取
1 提取的基本概念与影响因素 提取（抽提或萃取）：组织细胞破碎过程中， 大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来，必须 立即将其置于一定溶剂中，让制备物充分溶解， 并尽可能保持原来的天然状态，避免因长久放 置造成制备物的分解破坏。 主要影响因素：a 欲提取的物质在所用的溶剂中 的溶解度；b 该物质向溶剂扩散的难易 溶解度大小：a 溶剂（相似相溶）；b 温度；c 等电点
标记酶的种类
质膜： 主要两种：Na+、K+-ATP酶、腺甘酸环化酶； 细胞核：主要是担负DNA与RNA合成的酶。如RNA甲基 转移酶、乳酸脱氢酶等；
线粒体：主要集中了参与三羧酸循环、脂肪酸氧化、呼吸
链、氧化磷酸化等与能量代谢有关的酶和酶系。 如 NADH脱氢酶、己糖激酶等；
溶酶体：各种水解酶（约60种左右）；
二、分离纯化的要求
1 纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研 究蛋白质（酶）一级结构、空间结构，一级结构与功能的 关系、工具酶和标准蛋白、分析用酶制剂，都要求均一； 工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即 可，不要求均一。 2 活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。 3 收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少 损失。而且提纯步骤越多，损失越大。 4 在制备时丢失的蛋白（酶）永远不能在后面实验中弥补。
2 物理破碎方法
2.1 温度差破碎法 将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复 几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐 浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
2.2 超声波破碎法 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞 急剧震荡破裂。多适用于微生物材料，用大肠 杆菌制备各种酶，常选用50~100mg菌体/mL浓 度，在1~10kG频率下处理10~15min。缺点是 在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温 措施。 影响因素：样品浓度、超声波频率、功率、破 碎时间 操作：冰浴、间歇进行 适用于悬浮细胞破碎。对超声波敏感和核酸 应慎用。
2 蛋白质和酶的提取 提取方法：水溶液提取、有机溶剂提取、混 合提取 选择方法依据：存在部位、分子结构和溶解 性质
大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶 液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。 通常采用类似生理条件下的缓冲液，如20~50m mol/L的磷酸盐缓冲液 (pH7.0~7.5) 或0.1mol/L Tris-HCl (pH7.5~8.0) 缓冲液作提取液。 对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较 多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸， 常在提取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇、丙 酮、异丙醇、正丁醇等。
蛋白质的分子量一般在10000~1000000 Da之间 1 Da＝1×C12绝对质量/12 ≈1.66×10-27 kg
一、分离纯化的意义
1 从生物材料中分离制备蛋白质（酶），研究其结 构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命 现象的本质有重大意义。 2 工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工 业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制 造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。 3 医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。 4 基因工程的需要
细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细 胞还有叶绿体。 如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为 了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染， 还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某 一物质。 细胞器的分离一般采用离心法，即将破碎后的细胞在适 当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠 檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同， 经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经 多次分步离心后，即可获得所需组分。
一、细胞破碎
分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子 从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，
并保持原来的天然状态，不丢生物活性。因此应
选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是
体液（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则
不必进行组织细胞的破碎。
微生物合成后分泌的酶有两种
1. 胞外酶（分泌型酶）
细胞破碎确认
1.直接测定破碎前后的细胞数： 破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数 破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。 2.测定导电率： 利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。 3.测定释放的蛋白质量或酶活力： 测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破 碎率。
二、细胞器的分离
3 化学破碎法
原理：化学试剂改变或破坏细胞膜结构 常用试剂：有机溶剂、表面活性剂 十二烷基磺酸钠、去氧胆酸钠
提取蛋白质缓冲液中常用的 表面活性剂
非离子表面活性剂 (温和 ) Triton X-100：打破脂-脂相互作用和脂-蛋白质相互作用 阴离子表面活性剂 (more denaturing) SDS：打破蛋白质相互作用 脱氧胆酸钠：打破蛋白质相互作用
组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模， 不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法 和条件也不同。
一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎 或用超声波处理破碎。 植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶 等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的 提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能 达到目的。 细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的 骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大 分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与 石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚 糖）。
蛋白质组学实验室所需的条件
蛋白质组研究相关网站
蛋白质组研究技术、 信息等 发现新蛋白及新作用（新药 开发） 蛋白质组研究相关企业 、各种仪器来源、新闻等 各种蛋白质组研究相关信息 介绍蛋白质鉴定的先进仪器 http://www.expasy.ch 蛋白质鉴定专家系统，Swiss Institute of Bioinformatics .au 蛋白质鉴定专家系统， Australian Proteome Analysis Facility http://expasy.cbr.nrc.ca 蛋白质鉴定专家系统，Canadian Bioinformatics Resours
内质网：蛋白质合成、脂类合成、药物转化的酶。如细胞 色素还原酶、胆固醇酰基转移酶。
胞外酶常需要浓缩培养液
减压蒸发浓缩 通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高 ，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，适用于一些不耐热的生 物大分子的浓缩。 吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用 的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附 ，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯 酮、蔗糖和凝胶等。使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大 分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度 下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水 饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
是指可以穿过质膜的任何酶，大多数是水解
酶，大多数工业用酶是胞外酶。 优点：它比胞内酶容易回收、纯化，不必 将细胞破碎，也不用去核酸，容易获得高产。
2. 胞内酶
是指合成后仍然在细胞内发挥作用的酶。 细胞本身结构的非均一性决定了酶分布和所 处状态非均一，或处于“溶解”状态，或定位 结合于某一特定的亚细胞结构中； 由于细胞器的分工，某些酶对特定细胞来说 是独有或主要的；各细胞器上往往集中了具 各自特征的酶系统（标记酶）。
蛋白质（酶）的分离与纯化
第一节
引言
蛋白质（酶）、核酸存在于一切生物体中， 是非常重要的生物大分子。蛋白质（酶）是 生物功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别等多 种生理功能； 核酸是遗传信息的携带者，在生物体中指 导各种蛋白质（酶）的合成。
DNA
RNA
Protein
第二节
分离纯化的前处理
选择材料主要根据实验目的而定。工业上通常选择含 量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的 动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上 述问题，只要能达到实验目的即可。 实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料 需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植 物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。 另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理。 若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。
How to isolate total protein
裂解细胞； 溶解的蛋白质； 必须使用含表面活性剂的蛋 白质提取缓冲液来溶解膜蛋 白
4 酶破碎法
细菌：用溶菌酶，能专一性的作用于肽多糖的 β-1,4糖苷键。 酵母菌：蛋白酶（作用于蛋白质-甘露聚糖） ，再加入葡聚糖酶，再改变渗透压使细胞膜破 裂，因为酵母壁厚，难破碎。 霉菌：几丁质酶 植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶混 合使用。
常用的浓缩方法
超滤法 使用超滤膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方
法。液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，
溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，适于蛋白质和酶的 浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较 好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。
超滤膜及反渗透作用机制
Ultrafiltration
1 机械破碎方法
1. 1 高速组织捣碎机 将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积， 盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关 后，逐步加速至所需速度。适用于动物内脏组 织、植物肉质种子等。 操作：装料，低速→高速 效果：作用强烈，活性物质易受破坏
1. 2 匀浆器 先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回 研磨，上下移动，即可将细胞研碎。细胞破碎 程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动 物脏器组织。 1. 3 研磨器 石英砂