实验2-设计性实验-不同限制性内切酶对质粒切割-指导讲解
实验十二 DNA的限制性内切酶酶切分析
实验十二 DNA的限制性内切酶酶切分析实验目的：通过限制性内切酶酶切分析，了解DNA的结构和特性，掌握限制性内切酶的使用方法，以及掌握DNAGel电泳技术。
实验原理：限制性内切酶是一类可切割DNA分子的酶，可特异性地识别DNA的特定核苷酸序列并切割它们。
限制性内切酶可以将DNA切割成特定大小的DNA片段，这些片段可以进一步用于基因克隆、DNA指纹分析、DNA测序、DNA杂交等。
将DNA和内切酶一起反应一段时间后，可以通过电泳将酶切后的DNA片段按大小分离，从而得出不同DNA序列的长度和特征，达到对DNA结构特点进行研究的目的。
实验步骤：1. 从实验室提供的细菌菌株中提取DNA样品。
2. 将DNA样品用水稀释到适当浓度。
3. 按照所选内切酶的说明书，将相应量的酶加入DNA样品中。
混匀并放在37℃的水浴中进行反应1-2小时。
4. 制备1%的琼脂糖凝胶。
5. 将酶切后的DNA和DNA加载缓冲液混合后，放入琼脂糖凝胶槽中。
6. 进行DNAGel电泳，根据DNA片段的大小，将DNA分离开。
7. 取出凝胶进行染色，直接观察或用紫外线透射方式扫描成像。
实验注意事项：1. 在实验室中需要严格遵守生物安全措施，避免污染。
2. 在进行内切酶酶切反应时，需要严格按照酶的使用方法进行操作，以保证反应质量和结果准确。
3. 在制备DNA样品时需要避免DNA的降解或氧化。
4. 在进行DNAGel电泳时需小心操作，以避免凝胶破损或电流过强，影响实验结果。
实验结果分析：通过限制性内切酶酶切分析后，可以得到DNA片段的长度和特征，从中了解到DNA的特性和结构。
实验结果需要根据实验方法、酶的选择等进行分析和总结，以便进一步推进科研工作。
不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割
不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割——限制性核酸内切酶EcoRI对pUC19-P35S:ARF8切割摘要：【目的】为加深对限制性核酸内切酶和质粒DNA的酶切关系的认识，采用限制性核酸内切酶EcoRI对质粒DNA进行切割，从而验证不同限制性核酸内切酶对质粒DNA具有不同的切割结果。
【方法】采用限制性内切酶EcoRI对pUC19-P35S:ARF8进行切割，再用0.8%琼脂糖凝胶电泳加以分离，得到电泳图谱，对照分子量标样加以鉴定。
【结果】经琼脂糖凝胶电泳后，结果获得两条分子量不同的DNA带。
【结论】结果表明，用不同限制性核酸内切酶对质粒DNA 进行切割，可将质粒DNA切割成不同长度的DNA片段。
关键词：限制性内切酶EcoRI 质粒DNA 凝胶电泳酶切图谱引言：没有限制性核酸内切酶的发现和应用，就没有分子生物学的兴旺发展，在基因工程和分子生物学中，限制性核酸内切酶起着其足轻重的作用。
限制性核酸内切酶均来源于原核生物，用于抗击外来DNA的入侵。
限制性核酸内切酶，能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA的酶，既是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。
因此研究限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割具有重要的意义。
材料和方法：1．材料1.1 重组质粒pUC19-P35S:ARF8由广州大学生命科学学院生化楼分子生物学实验室构建1.2 限制性内切酶：EcoRI购自TaKaRa等生物工程公司1.3 琼脂糖：进口分装2．设备2.1 DYY-6C型电泳仪购自北京市六一仪器厂2.2 0.1-2.5ul、0.5-10ul、5-50ul移液枪购自北京市六一仪器厂2.3 ECFOII手掌型离心机购自碧云天生物技术研究所2.4 EDC-810基因扩增仪、微波炉、凝胶成像系统等。
3．试剂3.1 5 x TBE电泳缓冲液3.2 6 x 电泳载样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液，贮存于4℃；3.3 溴化乙锭溶液母液：将EB配臵成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温；3.4 DNA分子量标准：从小到大为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。
限制酶的多种切割要领
限制酶的多种切割方法 一、错位切割含目的基因的DNA片段和运载体──形成黏性末端 1. 单酶切 （1）同一种限制酶分别切割含目的基因DNA片段与运载体。
这是最简单的一种方法，含目的基因的DNA片段与运载体在同种限制酶作用下形成相同的黏性末端，这两个黏性末端间能通过碱基间的配对而连接，进而形成重组DNA分子。
（2）用同裂酶去切割含目的基因DNA片段与运载体。
有一些来源不同的限制酶识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这类酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。
同裂酶产生同样的切割，形成相同的黏性末端。
2009年江苏生物高考第34题就出现了同裂酶（BamHⅠ与BstⅠ），其中的差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。
（3）用同尾酶切割含目的基因DNA片段与运载体。
有一些来源不同、识别的核苷酸顺序和切割位置各不相同，但能产生相同的黏性末端，这类酶被称为同尾酶。
常用的限制酶BamHⅠ、BglⅡ、BclⅠ和Sau3A就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC四个核苷酸组成的黏性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其黏性末端之间的碱基互补作用而彼此连接起来。
【例1】（2005年天津理综）：限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。
在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。
①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。
②请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。
③在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？ 解析：这两种酶属于同尾酶，能产生相同的黏性末端，因此能够连接起来。
③由于两者产生的黏性末端相同（都是GATC），黏性末端之间能发生碱基互补配对而连接。
（4）单酶切的优点与缺点。
单酶切优点就是操作简单。
它的缺点主要有两个：①酶切后的质粒与目的基因在DNA连接酶作用下易自身环化：用单酶切切割后的目的基因和质粒的两侧各有一个黏性末端，而且是相同的末端，因此这两个末端会发生碱基互补配对而使目的基因和质粒分别发生首尾相连，都形成环状DNA分子，其中质粒又恢复成没有切割前的样子。
DNA的限制性酶切实验原理
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常用的电泳缓冲液
常用的6X载样缓冲液 Ⅰ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液
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4℃ 保存备用.
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三 材料、设备及试剂
质粒 ：pUC118、pEGFP 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式
４．酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应， 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则 是酶：ＤＮＡ=２－３：１ ２小时即可，充分酶解。
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溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下 发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物， 其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估 计样品DNA浓度。
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琼脂糖电泳的优点
（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由 电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。
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二、琼脂糖凝胶电泳实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具 有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓 度。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场 作用下向正极泳动。
不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割
不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割——限制性核酸内切酶EcoRI对pUC19-P35S:ARF8切割摘要:【目的】为加深对限制性核酸内切酶和质粒DNA的酶切关系的认识，采用限制性核酸内切酶EcoRI对质粒DNA进行切割，从而验证不同限制性核酸内切酶对质粒DNA具有不同的切割结果。
【方法】采用限制性内切酶EcoRI对pUC19-P35S:ARF8进行切割，再用0.8%琼脂糖凝胶电泳加以分离，得到电泳图谱，对照分子量标样加以鉴定。
【结果】经琼脂糖凝胶电泳后，结果获得两条分子量不同的DNA带。
【结论】结果表明，用不同限制性核酸内切酶对质粒DNA进行切割，可将质粒DNA切割成不同长度的DNA片段。
关键词:限制性内切酶EcoRI 质粒DNA 凝胶电泳酶切图谱1引言:没有限制性核酸内切酶的发现和应用，就没有分子生物学的兴旺发展，在基因工程和分子生物学中，限制性核酸内切酶起着其足轻重的作用。
限制性核酸内切酶均来源于原核生物，用于抗击外来DNA的入侵。
限制性核酸内切酶，能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA的酶，既是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。
因此研究限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割具有重要的意义。
材料和方法:1(材料1.1 重组质粒pUC19-P35S:ARF8由广州大学生命科学学院生化楼分子生物学实验室构建1.2 限制性内切酶:EcoRI购自TaKaRa等生物工程公司1.3 琼脂糖:进口分装2(设备2.1 DYY-6C型电泳仪购自北京市六一仪器厂2.2 0.1-2.5ul、0.5-10ul、5-50ul移液枪购自北京市六一仪器厂2.3 ECFOII手掌型离心机购自碧云天生物技术研究所2.4 EDC-810基因扩增仪、微波炉、凝胶成像系统等。
23(试剂3.1 5 x TBE电泳缓冲液3.2 6 x 电泳载样缓冲液:0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液，贮存于4?;3.3 溴化乙锭溶液母液:将EB配臵成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温;3.4 DNA分子量标准:从小到大为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。
质粒DNA的制备限制性内切酶切割重组PPT课件( 37页)
2.限制性内切酶的酶切鉴定(P82)
3.定性鉴定:DNA 的琼脂糖凝胶电 泳
4.定量检测：DNA 的紫外分光光度法 测定(P39)
实验目的
掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的 作用 ;
掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切 酶
一.质粒DNA的提取
(1)重组质粒;
(2)BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶;
(3)反应缓冲液。
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2.3 实验步骤
(1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育12h） (3)电泳鉴定（下次实验课内容）
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2.4 双酶切体系
质粒DNA 10×M buffer BamHⅠ HindⅢ
ddH2O
10μl 2μl 1μl 1μl 6μl
主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶 切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。
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1.2 分类
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
1.3 作用
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰 系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
1.4 命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
•
3、命运给你一个比别人低的起点是想告诉你，让你用你的一生去奋斗出一个绝地反击的故事，所以有什么理由不努力!
•
4、心中没有过分的贪求，自然苦就少。口里不说多余的话，自然祸就少。腹内的食物能减少，自然病就少。思绪中没有过分欲，自然忧就少。大悲是无泪的，同样大悟
无言。缘来尽量要惜，缘尽就放。人生本来就空，对人家笑笑，对自己笑笑，笑着看天下，看日出日落，花谢花开，岂不自在，哪里来的尘埃!
质粒DNA的限制性内切酶酶切分析讲解
质粒 DNA 的限制性内切酶酶切分析实验目的学习和掌握限制性内切酶的特性掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法重组技术的关键工具。
并理解限制性内切酶是 DNA 重组技术的关键工具。
2. 相关基础知识限制性核酸内切酶：是一类能识别双链 DNA 分子特异性核酸序列的 DNA 水解酶。
它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。
上世纪七十年代，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。
首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的 EcoR I 和 EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌(Heamophilus influenzae)的 Hind II 和 Hind III。
这些酶可在特定位点切开 DNA，产生可体外连接的基因片段。
研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。
1) 寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细菌细胞的一种防卫手段。
各种细菌都能合成一种或几种能够切割 DNA 双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源 DNA 存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的 DNA 不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA 进行了修饰，限制性酶对修饰过的 DNA 不能起作用。
这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。
2)限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的亚基组成和切断核酸情况的不同，分为三类：Ⅰ型Ⅱ型* Ⅲ型第一类（I 型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割 DNA 链，其切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
这类限制性内切酶在 DNA 重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析 DNA 结构或克隆基因。
这类酶如 EcoB、EcoK 等。
第三类（III 型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。
但这几个核苷酸对也不是特异性的。
因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度 DNA 片段，具有各种单链末端。
不同限制酶切割目的基因和质粒
不同限制酶切割目的基因和质粒
限制酶是一种能够识别并切割DNA的酶类，它们在基因工程领域中扮演着非常重要的角色。
通过使用不同的限制酶，我们可以切割出不同
的DNA片段，从而实现对基因和质粒的定向编辑和改造。
在基因工程中，我们常常需要对目的基因进行切割和重组，以实现对
其功能的调控和改变。
不同的限制酶具有不同的切割位点和切割方式，因此我们可以根据需要选择不同的限制酶来进行切割。
例如，EcoRI
限制酶可以切割出具有粘性末端的DNA片段，而BamHI限制酶则可以切割出具有平滑末端的DNA片段。
除了对目的基因进行切割外，限制酶还可以用于质粒的构建和改造。
质粒是一种常用的基因工程载体，它可以用于携带和传递目的基因。
通过使用不同的限制酶，我们可以将目的基因插入到质粒中，并实现
对其表达的调控和改变。
例如，pUC18质粒可以通过使用EcoRI和BamHI限制酶来进行切割和重组，从而实现对其载体能力和表达水平的调控。
总之，不同的限制酶在基因工程中具有非常重要的作用，它们可以用
于对目的基因和质粒进行切割、重组和改造，从而实现对其功能的调
控和改变。
在实际应用中，我们需要根据需要选择合适的限制酶，并进行精确的操作和控制，以确保实验的成功和可靠性。
限制性内切核酸酶的切割方法
基因工程
按照人们的愿望（人为的），进行严密的设 计（类似工程设计），通过体外DNA重组 （非生命活动过程）和转基因等技术，有 目的地改造生物种性，使现有的物种在较 短的时间内趋于完善（区别于自然突变和 常规育种），创造出更符合人们需求的新 的生物类型;利用这种技术对人类疾病进行 有效的诊断和治疗。
基因工程突出的优点
• 打破了常规育种难以突破的物种之间的界限
可以使原核生物与真核生物之间的遗传信 息进行相互重组和转移
可以使动物与植物之间的遗传信息进行相 互重组和转移
可以使人与其他生物间的遗传信息进行相 互重组和转移
基因工程的主要理论依据
不同基因具有相同的遗传物质(DNA/RNA) 基因是可以从DNA上切割下来的 基因是可以转移的 多肽与基因之间存在对应关系 遗传密码是通用的(绝少数除外) 可以通过DNA复制把遗传信息传递给下一代
酶切特点
同位酶：识别相同序列切点不同。 同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。限制酶HpaⅡ和 MspI是一对同裂酶，共同的靶子序列是CCGG。 同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。Sal I （5`-G TCGAC-3`）和Xho I(5`-C TCGAG-3`)的消化片 段相连，但所形成的重组片段（5`-GTCGAG-3`）则不能 被上述2种酶的任一种酶识别和切割。
不同限制酶切割目的基因和质粒
不同限制酶切割目的基因和质粒在分子生物学中，限制酶起到了至关重要的作用。
限制酶是一类具有特异性识别和切割DNA序列的酶，能够定位并切割DNA分子中的特定碱基序列。
通过限制酶的切割，科学家们能够实现对基因和质粒的精确操作，进而实现对生物体的遗传信息的研究和调控。
1. 切割目的基因基因是生物体内负责遗传信息传递和功能表达的基本单位。
切割目的基因是通过限制酶切割来实现对该基因的操作，包括分离、提取、重组等。
限制酶的选择取决于目的基因的特定序列。
例如，对于目的基因中含有特定酶切位点的情况，我们可以选择限制酶来切割该位点，实现对目的基因的精确操作。
以限制酶EcoRI为例，EcoRI是一种常用的限制酶，它能够识别并切割具有序列5'-GAATTC-3'的DNA。
如果我们要切割一个目的基因，而该基因具有GAATTC序列，我们可以选择EcoRI来切割该序列，从而将目的基因切割出来。
这样一来，我们就可以对目的基因进行进一步的操作，如PCR扩增、测序等。
2. 切割质粒质粒是一种存在于细菌细胞中的环状DNA分子，具有自主复制的能力。
质粒在基因工程和分子生物学研究中起着重要的作用，可用于携带外源基因、表达蛋白等。
限制酶的切割可以使质粒在特定位置断裂，从而实现质粒的分离、提取和重组。
以限制酶BamHI为例，BamHI是一种常用的限制酶，它能够识别并切割具有序列5'-GGATCC-3'的DNA。
如果我们要切割一个质粒，而该质粒具有GGATCC序列，我们可以选择BamHI来切割该序列，从而将质粒切割成两个片段。
这样一来，我们就可以对质粒进行进一步的操作，如插入外源基因、构建重组质粒等。
通过限制酶的切割，科学家们能够实现对目的基因和质粒的精确操作。
这为基因工程、分子生物学研究和生物医学领域的发展提供了重要的工具和技术支持。
同时，限制酶的应用也需要科学家们对酶的特性和操作技术有深入的了解和掌握，以确保实验结果的准确性和可靠性。
限制性内切核酸酶的酶切与鉴定实验原理及步骤、注意事项
实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。
根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。
许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。
例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。
5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。
限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。
根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。
根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。
小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。
本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。
在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。
在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。
二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。
2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。
三、操作步骤1．限制性内切酶反应一般在灭菌的0.2或0.5ml PCR薄壁离心管中进行。
2. 酶切反应体系（10ul）：酶解缓冲液（10×buffer） 1 ul限制性内切酶 0.5 ul EcoR I(7.5U) 底物DNA（质粒） x ul（依质粒浓度而定）灭菌ddH2O 加至10 ul限制性内切酶最后加入，手弹混匀或用吸头轻轻上下吹吸，混匀后6000 r/min，离心15s。
质粒DNA的限制性内切酶酶切及其鉴定
质粒DNA的限制性内切酶酶切及其鉴定［实验目的］训练学生正确使用加样器；了解限制性内切酶及酶切条；学会分析质粒DNA 的酶切图谱；系统掌握琼脂凝胶电泳的基本技术。
［实验原理］限制性内切核酸酶（也可称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。
细菌细胞内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰作用）。
它们对DNA底物有相同的识别顺序，但生物功能却相反。
由于细胞每存在DNA甲基化酶，它能在限制性内切酶所识别的若干碱基上甲基化，就避免了限制性内切酶对细胞自身DNA的切割破坏，而对感染的外来噬菌体DNA，因无甲基化而被切割破坏。
所以限制性内切酶是该细菌细胞的卫士，它与DNA甲基化酶一齐构成了保护自己、抵抗外源入侵的DNA防御机制。
目前已发现的限制性内切酶有数百种。
EcoRⅠ和Hind Ⅲ都属于Ⅱ型限制性内切酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA 片断。
EcoRⅠ和Hind Ⅲ的识别序列的切口是：EcoRⅠ: G↓AATTCHind Ⅲ: A↓AGCTTG,A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少个酶切片段，因此鉴定酶切后的片断在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片断的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。
用已知相对分子质量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
［实验器材］1.仪器和材料电泳仪、电泳槽，样品槽横板（梳子），有机玻璃内槽，橡皮膏，锥形瓶（100mL 或50mL），玻璃纸，一次性塑料手套。
pUC19（市售和自提），EcoRⅠ酶，λDNA- Hind Ⅲ酶切的分子量标准、琼脂糖。
2.试剂（1）TAE缓冲液（1×TAE）：称取Tris 4.9g、EDTA-Na2－2H2O0.74g，用900ml蒸馏水分别溶解后，添加冰醋酸1.14ml，最终用蒸馏水定容至1L。
限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析及应用 PPT
二.如果DNA切割不完全？ 1.内切酶活性下降 2.内切酶稀释方法不正确 3.DNA不纯，反应条件不佳 4.内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其 它修饰 5.部分DNA溶液粘在管壁上 6.内切酶溶液粘度大，取样不准 7.酶切后DNA粘性末端退火 8.由于反应溶液、温度使内切酶变性 9.过度稀释使酶活性降低 10.反应条件不适
通过 使 用 (15 种 )限 制 性 内 切 酶 酶 切 重 组质 粒，说明限制性内切酶的应用和限制性内切酶酶
切图谱分析的方法o
方法：
1.质粒的构建 采用聚合酶链反应chainreaction，PCR)方法扩增出 MLCKcDNA
片段，插入质粒 pBKrsv中，构建成 pBKrsv-MLCK 重组质粒
Ⅲ型酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制3、与命修名饰活：性，其切割位点很难预测。
规则： 第一个字母（大写）：取自该酶的细胞属名 第二、三个字母（小写）：该细胞的种名 第四个字母（罗马数字）：代表同一菌株中 不同限制性内切酶的编号
例如：EcoRⅠ、HindⅢ 等等
限制性核酸内切酶切割原理1来自Ⅰ类和Ⅲ类酶： 在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于
大家好
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限制性核酸内切酶切割原理、 方法、结果分析及应用
课堂内容回顾：
1、定义： 1、定义：限制性核酸内切酶是可以识别特
定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的 两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一 类酶，简称限制酶。
2、分类：
（根据酶的基因、蛋 白质结果、依赖的辅 助因子及DNA裂解的 特异性，将限制性内 切酶分为三种类型）
实验中可能出现的 问题及其讨论
一 . 如 果 DNA 完 全 没 有 被 内 切 酶切割？
基因工程课件3——实验2：质粒DNA的酶切及电泳鉴定
五、预期结果
（1）自提pMD18-T质粒（未插入外源基因片段）经单酶 切、电泳，紫外检测在对应Marker约2700bp处有专一条 带。 （2）未酶切的质粒跑出2~3条带，分别是超螺旋、开环/ 线形构象。
六、注意事项
1、溴乙锭是强烈的诱变剂，并有中度毒性， 使用时应带手套，电泳废弃物专门放置或 处理，避免溴乙锭污染实验桌台。溴乙锭 贮存液应避光保存。
平头末端：在识别序列的对称轴上切割双 链，产生平头末端。
例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT| 3’…… CTA ATC …… 3’ |TAG …… 5’
3、同裂酶和同尾酶
（1）同裂酶
来源不同的限制酶却识别和切割相同的序列 同裂酶产生同样切割，形成同样的末端 。
同裂酶之间的性质有所不同（如对离子强度、 反应温度以及对甲基化碱基的敏感性等方面可 能有所差别）。
2、酶解加样时必须在冰上操作，应准确无误， 防止错加或漏加，并避免交叉污染，保持 公用试剂纯净。 3、注意酶的用量，避免星号活性
（3）DNA分子构象
相同分子质量，但构型不同的质粒 DNA会造成电泳时受到的阻力不同， 最终造成泳动速率的不同。常规电泳中 质粒DNA分子的3种构型泳动速率：超 螺旋＞线状分子＞开环分子。
（4）电场强度
低电压时，线形DNA迁移率与电压成正比。 当电压增大时，琼脂糖凝胶分离的有效范围 反而减小。 目前有3种缓冲液适用于天然双链DNA的电 泳：TAE、TBE和TPE
（5）电泳缓冲液
（6）EB
三、实验材料
1、仪器和材料
电泳仪，电泳槽，透明胶布，锥形瓶 (100 mL 或 50 mL) ，紫外检测仪，一次性手套， Ep管，加样器(20 pL，200 pL)及无菌吸头， 水浴锅
限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法
限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法，个人觉得总结得很好，特转贴供本供大家分享。
酶切现问题，看内切酶说明书，相应试剂公司目录。
不同公司出产的内切酶，菌株来源、制备工艺、纯度活力、酶切活性优化可能不同，。
可在上面找到酶单位定义、保存条件、酶切体系[buffer及与其它酶双切的buffer等]、酶切反应温度[有些酶是在50、55或30等温度下反应的]、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活可能因素、保护性碱基，同尾酶、同裂酶1. 酶切不开或不完全1.1 质粒问题纯度差或残留酶切抑制物最为常见。
杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、盐、乙醇等；【重新提DNA，使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂，1.2 酶的问题：确认内切酶有效 [很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可用。
确认酶切效果不好，做标记，更换] 。
【题外话：用内切酶注意】a. 内切酶如无特殊要求，保存-20~-30度。
并非越低越好，酶通常是保存在50％甘油缓冲液中，温度过低时，酶会发生冻结（运输过程例外，由于酶需要低温运输，所以方便的情况下是使用干冰，酶会冻结，但冻结次数有限，相对是一种比较好的选择），如果是经常使用的话，酶会被反复冻融，从而降低了活性。
当然如果温度过高，呵呵，你就自己想去吧。
b. 酶在使用时应置于冰盒中取酶。
这点大家都清楚，不过多强调也没坏处。
因为实验室有些同学，酶取出后是放在冰盒上的，但有两点忽略了：拿酶的时候，手不是抓着管子上端，而握在管子的底部，相当于用手在给酶进行加热；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的时候，还是将酶拿出来。
偶尔一次没有大碍，反复如此，可能会影响酶活。
c. 酶使用完后应尽快旋紧盖子。
有时我们可以发现，即使是-20~-30度放置，酶仍然会冻结。
个人认为的可能原因是由于在配置酶切反应时，酶管的盖子在较长时间的开着，甘油会吸取空气中的水分，对于常用的大包装的酶有时就会出现冻结现象。
不同限制酶切割目的基因和质粒
不同限制酶切割目的基因和质粒1. 引言限制酶是一类能够识别特定DNA序列并将其切割为特定碱基序列的酶类。
在分子生物学研究中，限制酶的应用十分广泛，尤其是在基因工程和重组DNA技术中。
通过选择不同的限制酶，可以实现特定目的的基因和质粒的酶切。
2. 酶切目的：基因克隆基因克隆是指从一个生物体中将目标基因分离出来，并将其插入到另一个生物体中的过程。
限制酶在基因克隆中起到了至关重要的作用。
通过选择适当的限制酶，可以将目标基因从DNA中切割出来，并插入到质粒中。
常用的限制酶有EcoRI、BamHI等。
这些限制酶能够识别特定的DNA序列，并将其切割为特定碱基序列。
通过酶切，可以得到具有黏性末端的DNA片段，这些片段可以与质粒上的黏性末端进行连接，从而实现基因的插入。
3. 酶切目的：基因敲除基因敲除是将特定基因从生物体的基因组中去除的过程。
限制酶也可以在基因敲除中发挥作用。
通过选择与目标基因相邻的限制酶切割位点，可以将目标基因切除，并使其失去功能。
常用的限制酶有EcoRV、HindIII等。
这些限制酶能够识别特定的DNA序列，并将其切割为特定碱基序列。
通过酶切，可以得到缺失目标基因的DNA片段，从而实现基因敲除。
4. 酶切目的：基因定点突变基因定点突变是指在特定位点上引入特定的碱基改变。
限制酶也可以在基因定点突变中发挥作用。
通过选择与目标位点相邻的限制酶切割位点，可以将目标位点切除，并插入带有特定碱基改变的DNA 片段。
常用的限制酶有PvuII、SmaI等。
这些限制酶能够识别特定的DNA序列，并将其切割为特定碱基序列。
通过酶切，可以实现基因定点突变。
5. 酶切目的：质粒构建质粒构建是指将目标基因插入到质粒中，构建重组质粒的过程。
限制酶在质粒构建中也起到了关键作用。
通过选择适当的限制酶，可以将目标基因从DNA中切割出来，并插入到质粒中。
常用的限制酶有XbaI、PstI等。
这些限制酶能够识别特定的DNA序列，并将其切割为特定碱基序列。
2.实验二-质粒DNA的限制性内切酶酶切
二 实验原理
型酶识别的DNA序列一般含有4 个核苷酸。 DNA序列一般含有 Ⅱ型酶识别的DNA序列一般含有4～6个核苷酸。有的在识别顺序 的对称轴上对双链DNA同时切割产生平末端； 的对称轴上对双链DNA同时切割产生平末端；有的在识别顺序的双侧末 DNA同时切割产生平末端 DNA双链产生粘性末端 双链产生粘性末端。 型限制性内切酶需要Mg2+激活，大部分Ⅱ Mg2+激活 端DNA双链产生粘性末端。Ⅱ型限制性内切酶需要Mg2+激活，大部分Ⅱ 型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。 型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。 质粒DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列， 质粒DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列，可 DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列 被相应限制性内切酶切出相应数量的切口， 被相应限制性内切酶切出相应数量的切口，从而产生相应数量的酶切 片断。 片断。 本实验采用PMD18- 质粒具有EcoRⅠ Hind的识别序列和酶切位 EcoRⅠ和 本实验采用PMD18-T质粒具有EcoRⅠ和Hind的识别序列和酶切位 PMD18 点分别为 GAATTC CTTAAG 和 AAGCTT TTCGAA
对照组 0 0 0 X 20-X 20
充分混匀后于37℃保温1 2h。 充分混匀后于37℃保温1-2h。 37℃保温 注最终反应体系中质粒浓度至少达到1.2 1.5μg/μL） 1.2（注最终反应体系中质粒浓度至少达到1.2-1.5μg/μL）
1
2
3
四 实验结果
1泳道 maker 质粒DNA 2泳道 质粒DNA 3泳道 酶切产物
取实验一中提取的质粒，向其中加入10μL灭菌的双蒸水使其充分 取实验一中提取的质粒，向其中加入10μL灭菌的双蒸水使其充分 10μL 溶解，测定其dsDNA浓度。然后按下表进行操作： 溶解，测定其dsDNA浓度。然后按下表进行操作： dsDNA浓度
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实验二不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割（设计性实验）设计实验目的：培养学生独立完成实验设计、实验操作和撰写小论文的能力。
设计实验要求：选用1或2种内切酶，将所提供的质粒DNA切割为至少3-4个以上的片段。
设计实验过程：学生根据实验要求，运用学过的知识，先设计实验方案，提交老师批阅认可；再独立进行实验准备和实验；实验结束，撰写设计性实验报告，即小论文1篇。
小论文要求：字数不少于3000，包括论文题目、作者、摘要、关键词、引言、材料与方法、结果与分析、结论或讨论、参考文献等。
设计实验涉及知识点：1）质粒的限制性内切酶图谱；2）质粒酶切鉴定；3）DNA片段的琼脂糖凝胶电泳。
设计实验要求学生独立撰写小论文。
Digestion of plasmid DNA with different restriction endonuclease 不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割一、原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于A TP的存在。
Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子, 然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶, 它修饰同一识别序列。
Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。
当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时, 会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时, 每次都要用新的吸管头。
如果采用两种限制性内切酶, 必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。
若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。
若需要不同的盐浓度, 则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用, 随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。
也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。
DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。
本实验采用重组质粒pUC19-P35S:ARF8，其物理图谱如图1所示。
图1 重组质粒pUC19-P35S:ARF8 with Cutting sites of restriction enzymes在酶切过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1μg。
限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同, 各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。
对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。
但要完全酶解则必须增加酶的用量, 一般增加2-3倍, 甚至更多,反应时间也要适当延长。
DNA经限制性内切后得到不同大小的片段，可用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳加以分离，对照分子量标样加以鉴定。
二、材料、设备、试剂材料1、重组质粒pUC19-P35S:ARF8由本实验室构建（图1）；2、限制性内切酶：Pvu II、Hind III、Sph I、Pst I、Xba I、EcoR I、Pvu I、EcoR V等购自TaKaRa等生物工程公司；3、琼脂糖(Agarose): 进口分装。
设备水平式电泳装置, 电泳仪, 台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,凝胶成像系统等。
试剂1、5×TBE电泳缓冲液；2、6×电泳载样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃；3、溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可；4、DNA分子量标准：从小到大为100bp、25bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。
四、操作步骤一）DNA酶切反应1、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号, 用微量移液枪分别加入DNA1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl,将管内溶液混匀后加入1μl酶液, 用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下, 使溶液集中在管底。
此步操作是整个实验成败的关键, 要防止错加，漏加。
使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。
2、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）, 37℃水浴保温2-3小时, 使酶切反应完全。
3、每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀, 以停止反应,置于冰箱中保存备用。
二）琼脂糖凝胶的制备1、取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。
2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖, 置于200ml锥形瓶中, 加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化, 取出摇匀, 此为0.8％琼脂糖凝胶液。
加热过程中要不时摇动, 使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
加热时应盖上封口膜, 以减少水份蒸发。
3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。
将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。
向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。
用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧, 待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内, 使胶液形成均匀的胶层。
倒胶时的温度不可太低, 否则凝固不均匀, 速度也不可太快, 否则容易出现气泡。
待胶完全凝固后拨出梳子, 注意不要损伤梳底部的凝胶, 然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。
因边缘效应样品槽附近会有一些隆起, 阻碍缓冲液进入样品槽中, 所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
4、加样：取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。
若D NA含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。
每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
5、电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。
控制电压保持在60-80V,电流在40 mA以上。
当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。
6、染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。
7、观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。
DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。
紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。
经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6,曝光时间10-120秒(根据荧光条带的深浅选择)。
[注意事项]1、酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。
2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1mg lDNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不象lDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。
反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。
3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。
另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。
4、观察DNA离不开紫外透射仪, 可是紫外光对DNA分子有切割作用。
从胶上回收D NA时, 应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm）, 以减少紫外光切割DNA。
5、EB是强诱变剂并有中等毒性, 配制和使用时都应戴手套, 并且不要把EB洒到桌面或地面上。
凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
6、当EB太多, 胶染色过深,DNA带看不清时, 可将胶放入蒸馏水冲泡, 30分钟后再观察。
“不同限制性核酸内切酶对质粒DNA 的切割”实验设计要求Digestion of plasmid DNA with different restriction endonuclease 不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割An experiment designed by students设计性实验: Designer设计者:______ ID No:学号______ 设计要求：根据图谱，选用单酶切或双酶切，将载体切成至少4个片段。
Pvu I: (2919bp, H buffer), PvuII(2057, 4500, 4676, 5981, special buffer), HindIII (2236, 5112, 5611; M buffer + BSA), SphI (2246, 2318, 3194, 3371, 3858, 4014, 4249, 4607, 5196; H buffer),PstI (2251, 3356, 4146,; H buffer), XbaI(2259, 4077, 5002, 5549; M buffer), EcoRI (2301, 3174, 3786, 5149, 5599, 5888; H buffer + BSA), EcoRV(2919; special buffer)2 小论文写作要求：An experiment designed by students设计性实验: Designer设计者:______ ID No:学号______ Digestion of plasmid DNA with different restriction endonuclease-----Digestion of pUC19-P35S:ARF8 with Enzyme X不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割-----Enzyme X对pUC19-P35S:ARF8切割张三李四广州大学生命科学学院生物科学2008级Abstract(摘要): around 150 words. (150字左右)Key Words（关键词）: 3个或以上Introduction（引言）说明为什么要做本实验和本实验的意义Material and Methods（材料和方法）：详细说明Result and Analysis （结果和分析）：详细说明Discussion/Summary（讨论/小结）：Reference (参考文献) more than 5, 5篇以上，必需引用到论文中不少于3000字。