01油镜的使用和细菌的简单染色法
油镜使用及革兰氏染色
教学目标
掌握油 浸镜的使用 原理
二．染色原理和油镜的工作原理
1．油镜工作原理
油镜的放大倍数最大（100），故镜头焦距短， 直径小,但所需光照强度却最大。从标本片透过的光 线是从玻片进入空 气，再进入镜头。由于玻璃和空 气的介质密度不同，有些光会 因折射或反射而 不能进入 镜头。物象就显 现不清。 为了不使通过的 光线有 所损失，须在油镜与玻片 之间加入折射率和玻璃 (n=1.52）相仿的香柏油 (n=1.515)。故而称之为 “油镜”。
转换器: 其上装置各种不同放大倍数的 物镜，用以转换物镜至使用位 置上。
聚光镜:
位于载物台的下方，可以上下移动， 以使光线集中于检查的标本上
光圈:
位于聚光镜之下，可以放大和缩小； 用以调节进入聚光镜的光量。
四、显微镜的使用
1、取显微镜：右手握镜臂，左手托住镜座。 2、打开电源（调节反光镜）使射入镜头光 线最强。 3、上提集光器。 4、打开光圈。 5、将标本片放在载物台上，用片夹固定。
6 、调节转换器，先使低倍镜对准中央， 寻找适宜的视野。 7、于标本片的欲检部位滴加香柏油。 8、然后转换油镜镜头，使其对准中央。 9、两眼对准目镜，向上转动粗调节器，直 至见到模糊物像为止。 10、转动细调节器，直至物像完全清晰为 止。
显微镜的维护
（１）将载物台降至最低，取下标本片。 （２）将光量调至最小，关上电源。 （３）擦试镜头： 先用干擦镜纸擦掉香柏油； 再用滴加少量乙醚的擦镜纸擦试； 最后再用干擦镜纸擦拭。 （4）低倍镜对准中央 （5）将显微镜放入镜箱，还原。
3-5
6. 媒染 水洗。 7. 脱色
加媒染剂碘液使之覆盖1分钟， 滴加95% 乙醇数滴，立即水洗,。
8. 复染 吸干。
油镜的使用和细菌的简单染色
油镜的使用和细菌的简单染色一、实验目的1、掌握油镜的使用方法2、掌握简单染色的原理及方法3、学习并掌握无菌操作技术二、实验原理⑴、油镜使用的原理油镜，即油浸接物镜。
当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。
若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。
由于微生物细胞含有大量水分（一般在80-90%以上），对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大，与周围背景没有明显的明暗差。
所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察。
但是，任何一项技术都不是完美无缺的。
染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其生活细胞的真实情况，染色观察时必须注意。
⑵、染色剂和染色原理微生物染色的基本原理，是借助物理和化学因素的作用而进行的。
物理因素如：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。
化学因素如：正负离子之间的相互吸引等。
染色剂染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型： 1. 酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。
2. 碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。
3. 中性（复合）染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞核染色）。
4. 单纯染色：这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudan b)的染料。
细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。
因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。
所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。
三、实验材料器材：显微镜、擦镜纸、吸水纸、载波片、盖玻片、接种环、酒精灯、废液缸、洗瓶等。
油镜的使用与简单染色法
实验一油镜的使用、简单染色法一、实验目的1、复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。
2、掌握细菌简单染色及无菌操作技术。
二、实验原理（一）普通光学显微镜的构造普通光学显微镜包括机械部分和光学部分两部分。
机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。
光学部分包括接目镜、接物镜、反光镜、光圈（虹采）、聚光镜（集光器）等。
（二）油浸系的原理浸系是在油浸镜与标本之间加1滴香柏油，调整光源检查细菌标本的方法。
油浸镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95x、100x等。
其镜头标记国产镜多用“油”字表示，国外产品则用“Oil”（Oil Immersion）或HI （homogeneous Immersion）表示。
而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长，镜片最小，这也是识别的另一种标志。
其使用原理是：由于香柏油与玻璃的折光率相似（香柏油为1.515，玻璃为1.52）。
镜检时，滴加香柏油的作用是使光源尽可能多的进入物镜中，避免光线通过折光率低的空气（折光率为1.0）而散失，因而能提高物镜的分辨率，使物像明亮清晰（见下图）。
图介质为空气（A）与介质为香柏油（B）时光线通过的比较（三）细菌简单染色细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。
利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
实验1显微镜油镜的使用、细菌单染色法及细菌芽孢观察（09下）
实验1显微镜油镜的使用、细菌单染色法及细菌芽孢观察（09下）实验1 显微镜油镜的使用、细菌单染色法及细菌芽孢观察(09下)A.显微镜油镜的使用一、实验目的和内容目的：复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。
内容：1．学习油浸系物镜的使用方法。
2．用油镜观察枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片。
二、实验材料和用具枯草芽孢杆菌(Bacillus subitilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的染色装片。
香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。
三、操作步骤(一)观察前的准备1．将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4cm。
坐正，练习用左眼观察。
2．调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。
转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。
观察染色装片时，光线宜强；观察末染色装片时，光线不宜太强。
(二)低倍镜观察染色装片首先上升镜简，将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升(或使镜台下降)至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。
移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。
(三)高倍镜观察眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相懂。
再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。
用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。
将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。
不要移动装片位置，准备用油镜观察。
(四)油镜观察1．提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。
在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油。
2．从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。
显微镜油镜的使用及细菌观察
显微镜油镜的使用及细菌观察一、实训目的能利用显微镜油镜观察细菌的基本形态和特殊结构，并会进行显微镜的保养。
二、实训器材显微镜、香柏油、乙醇乙醚(乙醇与乙醚的比例为3∶7)、擦镜纸、细菌染色标本片。
三、实训内容1．调试（1）将显微镜放置在洁净平稳的实验台上，绸布叠放整齐。
（2）打开电源开关和灯的开关，检查灯的亮度是否可以调节。
（3）尽量升高聚光器，放大光圈。
2．选择油镜（选好后使其正对通光孔）（1）长度最长；（2）放大倍数最大（100×）；（3）白色线圈标志；（4）“油”或“oil”字样标志。
3．放置标本片（1）正面朝上；（2）加油于待检部位滴加一滴香柏油，保持滴状，不要涂开。
4．镜检（1）第一步眼睛从镜筒侧面注视油镜头，转动粗调节器上升载物台，直至油镜头浸入油中，并与玻片相接触。
（2）第二步眼睛观察目镜，转动粗调节器使载物台缓慢下降，待看到模糊物像后，换成细调节器微调（转动1-2圈即可），直至物像完全清晰。
先粗后细观察内容：形态、大小、颜色、排列，尝试手绘或用相机进行拍照。
5．保养（1）灯高度调至最低，关上电源和灯的开关；（2）取下标本片；（3）擦拭镜头 3步走（干→湿→干）：干净擦镜纸擦拭→加少量乙醇乙醚后擦拭→干净擦镜纸擦拭。
每次用2-3片擦镜纸。
（4）擦拭完毕，把低倍镜转至中央，高倍镜和油镜与通光孔成“八”字形。
（5）将电源线折叠好，放在载物台上。
（6）将显微镜用绸布包好，放回原处。
（7）填写使用记录本。
实验报告内容：1．显微镜的使用方法2．画出细菌的形态和排列方式，最好用彩笔或标明细菌颜色。
参考图片：。
实验一油镜的使用`革兰染色及特殊结构的观察
实验一油镜的使用、革兰染色及特殊结构的观察细菌个体微小，必须借助显微镜来观察其形态结构。
但是活细菌为无色半透明状态，在普通光学显微镜下不易观察清楚，常用染色的方法使细菌着色，使之与背景形成鲜明对比，再在显微镜下观察，可清晰的看到细菌的形态、大小、排列和某些特殊结构。
观察细菌的形态与结构是进行细菌鉴别的方法之一。
目的和要求：1、熟悉显微镜油镜的使用方法。
2、学习使用显微镜油镜观察细菌的特殊结构3、学习革兰染色法实验材料：标本片、显微镜、香柏油、擦镜纸、二甲苯。
实验原理：使用油镜时，需在玻片上滴加香柏油。
这是因为油镜的放大倍数较高，而透镜很小，光线通过不同密度的介质物体（玻片→空气→透镜）时，部分光线会发生折射而散失，进入镜筒的光线少，视野较暗，物体观察不清。
如在透镜与玻片之间滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），则使进入油镜的光线增多，视野亮度增强，物象清晰。
实验方法及注意事项：1、用油镜时，勿将镜臂弯曲倾斜，以免油滴或菌液流淌外溢，影响观察造成污染。
2、用低倍镜对光，自然光线用平面镜（光源不宜采用直射日光，因直射日光的强度太大容易刺激眼睛），人工光源用凹面镜，同时调节集光器和光圈以获得最适亮度。
染色标本油镜检查时，应将光圈完全打开，集光器上升至载物台相平，使光亮度很强。
3、标本片放在载物台上，用标本推进器或压片夹固定。
4、低倍镜找出标本的范围，然后在待检部位上加一滴香柏油，转动镜头转换器，将油镜头置于工作位置，从侧面观察并缓慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，然后眼睛移至目镜，缓慢向上移动粗调节器（只应上升，不能下降，以免压碎标本和损坏镜头），待看到模糊物象时，再用细调节器转动至物象完全清晰为止。
5、观察完毕，取下标本片，立即用擦镜纸顺一个方向旋转擦拭镜头上的油。
若油已干，应先用二甲苯滴在擦镜纸上擦净镜头，再用另一干净擦镜纸拭去镜头上沾有的二甲苯。
实验一 显微镜油镜的使用和细菌的革兰氏染色
实验一显微镜油镜的使用和细菌的革兰氏染色陈宝莲2010级生态学040212010002一、实验目的1 学习显微镜油镜的使用方法2 学习微生物的无菌操作技术3 学习细菌的革兰氏染色法二、实验原理1 显微镜及油镜物镜的使用原理1) 油镜头的标志油镜头上常刻有OI（oil immersion）或HI（homogeous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记。
在低倍物镜、高被物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numerical aperture）最大，而工作距离最短。
2 ) 显微镜的分辨率显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数，更重要的是看它的分辨率的大小。
分瓣率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。
D值愈小表明分辨率愈高。
D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比：D=λ/2NA从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。
数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积：NA=n×Sinα/2影响数值孔径大小的因素－是镜口角，二倍介质的折射率。
当物镜与玻片之间的介质为空气时，由于空气（n=1.0）与玻璃（n=1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。
当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃的相近，光线经过玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。
2 细菌的革兰氏染色原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创立的。
作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类.G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。
微生物学实验报告
微生物学实验报告(格式标准)(生命科学专业)教师:黎勇目录索引实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 3实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5实验三常用培养基的配制7实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8实验五、微生物大小的测定与显微计数10实验六环境中微生物的检测与分离纯化11实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12实验八(综合实验)化能异养微生物的分离与纯化13课程名称: 微生物学实验班级:化生系生命科学本科实验日期: 指导教师:黎勇实验一油镜的使用与细菌的简单染色法〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术;观察细菌的基本形态;学习观察细菌的运动性的基本方法。
〔基本原理〕1、 N·A=n·sinα2、 D=λ/2N、A3、目镜可提高放大倍数,但有效放大率取决于镜口率。
已经分辨的物体不放大瞧不清,未分辨物放得再大也瞧不清。
4、用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时,可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。
〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸;细菌、放线菌等固定装片;培养18小时左右的B、subtilis、 S、arueus 菌斜面培养物;无菌水、生理盐水。
〔方法步骤〕:(一) 油镜的使用镜检装片在中倍(或高倍镜)下找到目的物,并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置,虹彩光圈开到最大,镜头转开成八字形在玻片的镜检部位(光斑处)滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台(缩短镜头与装片距离,镜头浸入油中,至油圈不扩大为止镜头几与装片接触) 粗调器徐徐下降载物台(密切注视视野,当捕捉到物像时,立即用细调器校正) 仔细观察并绘图取出装片,清洗油镜:擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留(用手指辅助,迅速拭擦一、二次) 用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯(2-3次)。
(二) 细菌的简单染色法:涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察(三) 细菌运动性的观察取洁净盖玻片,四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察〔结果分析〕1、画一圆圈表示视野,选取所观察的微生物绘图,注意特殊结构、形状与排列。
实验一显微镜油镜的使用和细菌形态的观察
护的基本知识
使用油镜观察细菌的几种基本形态 用悬滴法在高倍镜或油镜下观察细菌的
运动
显微镜油镜使用的原理
普通光学显微镜 欧林巴斯（OLYMPUS）生物显微镜
欧林巴斯（OLYMPUS）相差显微镜
普通光学显微镜Ⅰ
显微镜的构造 1.光学部分:接目镜 、
接物镜 、 照明装置(聚光镜、 虹彩光圈、 反光镜等). 它 使检视物放大,造成物象. 2.机械部分:镜座、镜 臂、镜筒、物镜转换器、 载物台、载物台转移器、 粗调节器、细调节器等部 件.它起着支持 调节 固定 等作用.
普通光学显微镜Ⅱ
显微镜的放大倍数和分辨率 1.放大倍数=接物镜放大倍数× 接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 是表示显微 镜辨析物体（两端）两点之间距 离的能力，可用公式表示为： D=λ/2n·sin(α/2 ) 式中D：物镜分辨出物体两点间 的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折 射率。 ：镜口角（即入射角）。
2. 打开主开关。 3. 移动电压调整旋，使亮度 适中。 4. 把标本固定在再物台上。 5. 放松粗调锁挡。 6. 用低倍物镜，旋转粗调和 微控制钮来进行对焦。 7. 调节双目镜筒间距和视度 差。 8. 再适当调节照明度。 9. 使焦点正确地对准标本。
11. 调节孔径光栏。 12. 依次用低、中、高倍镜 观察。 13. 油镜观察：与普通光学 显微镜方法一致。 14. 观察完毕，复原：先将 电压调节旋钮复原，关闭主 开关，切断电源，放开粗调 锁挡。油镜的处理与普通光 学显微镜方法一致。 15. 放入保存箱中。
实验程序III
细菌三种基本形态的观察：
菌落形态观察和个体形态观察，这里主要指 个体形态的观察。 1. 结合油镜的使用，观察三张细菌染色片（球 状菌、杆状菌、和螺旋状菌），边观察边绘图。 2. 看示范镜：观察双球菌、四联球菌察（示范）： 一般采用水浸片法、悬滴法、 半固体培养法，常用水浸法 和悬滴法来观察细菌的运动 性。 1. 水浸片法 2. 悬滴法
微生物学实验教案 (2)
微生物实验教案实验一显微镜油镜的使用和细菌形态的观察一、实验目的以染色玻片为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。
二、实验原理圈、:镜座、a：镜口角（即入射角）。
3油镜使用的原理油镜，即油浸接物镜。
当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。
若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。
三、实验材料1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。
2枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的玻片染色标本。
四、实验方法与步骤（1）用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。
（2）调节光亮度。
油镜使用的原理绘制细菌形态六、思考题1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？2使用油镜时，为什么必须用镜头油？七、实验注意事项1不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。
2镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。
3观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。
当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以带正电荷的碱性染料。
染料适用于热固定的涂片，染料与菌体细胞质黏附使菌体着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比。
三、实验材料1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。
2、培养12-18h的枯草芽孢杆菌和大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌。
3、简单染色液（美蓝染色液、黑色素液或炭素墨水）四、实验方法与步骤1、活菌制片观察取一张干净的载玻片，在其中央滴上一滴干净的蒸馏水，取培养六、思考题1镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？2根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？七、教学反馈实验三细菌的革兰氏染色一、实验目的1掌握革兰氏染色。
实验一显微镜的使用和细菌的简单染色
实验程序——细菌简单染色
每位学生一人一组，取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，各做一块涂片。
蒸 馏 水
涂片
接 种 环
自然干燥
吕 式 美 兰
固定
擦拭
染色 1min
干
水
燥
洗
水洗时不要直接冲菌膜
染色注意事项
• 1.涂片过程中，去生理盐水和细菌不宜过多，
涂菌要均匀，不宜过厚。
• 2.固定时温度不可过高，以载玻片背面不烫
• 普通光学显微镜(NIKON) • 欧林巴斯（OLYMPUS）生物显微镜 • 麦克奥林生物显微镜
镜座 载物台
镜臂
机械装置 标本夹和标本移动尺
显 微
粗调螺旋和细调螺旋
镜 的
聚光镜升降螺旋
构 造
接目镜
接物镜及镜头转换器
光学系统 聚光镜
虹彩光圈
反光镜
显微镜的放大倍数和分辨率
• 1.放大倍数=接物镜放大倍数×接 目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 是表示显微 镜辨析物体（两端）两点之间距 离的能力，可用公式表示为： D=λ/2n·sin(α/2 ) 式中D：物镜分辨出物体两点间 的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折 射率。 ：镜口角（即入射角）。
• 镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用 高倍镜或油镜观察？
下周实验
实验二 细菌的革兰氏染色 （书中实验十四）
杆菌
炭疽杆菌
破伤风杆菌
肉毒芽孢杆菌
大肠杆菌
杆菌
变形杆菌 绿脓杆菌
大肠杆菌
螺菌
幽门螺杆菌
霍乱弧菌
钩端螺旋体
Spirulina sp. - Filamentous Cyanobacte
1油镜的使用、细菌的简单染色
镜口率(N.A.)
0.25
工作距离(mm)
7.0
40×
100×
0.65
1.30
0.65
0.15
与其他物镜不同，油镜需在载玻片与镜头之间加滴镜油，原 因有二： 1）.增加照明亮度
油镜的放大倍数可达100x，焦距很短，直径很小，但 所需要的光照强度却最大。为了不使通过的光线有所损失， 必须加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的镜油。通常用 香柏油（n=1.52）.
2）.增加显微镜的分辨率 油镜的分辨率可达到0.2μm左右。
显微镜保养和使用中的注意事项
1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。
2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁 度
3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。 当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调 节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单 手拿，更不可倾斜拿。 5.显微镜用完后，将载物台降至最低，并将最低倍数物镜 或物镜的空位正对载物台。
1）取一干净载玻片。 2）在载玻片中间滴一小滴生理盐水。 3）用牙签取少量牙垢，涂在生理盐水中，混匀并涂成薄膜。 4）自然干燥。 5）火焰固定。 6）染色：滴加染液（用结晶紫或番红），染色一分钟。
7）水洗：洗掉多余的染液（洗至流出液不带颜色为止）。
8）自然干燥。
染色中注意事项： 1、涂片不可太厚 2、固定时不能在火上烤的时间太长，否则菌体收 缩变形 3、染色后必须晾干后才能用油镜镜检。
教学计划
农学院 15学时 5个实验 生科院 30学时 9个实验
课堂纪律
严格遵守实验室规章制度 严肃课堂纪律 不允许无故旷课、早退、迟到，不准大声喧哗 实验服 按各人座号就座，按编号使用仪器，严禁私自挪 用他人仪器设备。 爱惜实验设备，损坏需按价赔偿。隐匿不报者， 一经发现，双倍赔偿。
微生物学实验报告
微生物学实验报告（格式标准）(生命科学专业)*****目录索引实验一油镜的使用和细菌的简单染色法 3实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5实验三常用培养基的配制7实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8实验五、微生物大小的测定与显微计数10实验六环境中微生物的检测和分离纯化11实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12实验八（综合实验）化能异养微生物的分离与纯化13课程名称：微生物学实验班级：化生系生命科学本科实验日期：指导教师：黎勇实验一油镜的使用和细菌的简单染色法〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术；观察细菌的基本形态；学习观察细菌的运动性的基本方法。
〔基本原理〕1. N·A=n·sinα2. D=λ/2N.A3. 目镜可提高放大倍数，但有效放大率取决于镜口率。
已经分辨的物体不放大看不清，未分辨物放得再大也看不清。
4. 用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时，可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。
〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸；细菌、放线菌等固定装片；培养18小时左右的B.subtilis. S.arueus 菌斜面培养物；无菌水、生理盐水。
〔方法步骤〕：（一）油镜的使用镜检装片在中倍（或高倍镜）下找到目的物，并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置，虹彩光圈开到最大，镜头转开成八字形在玻片的镜检部位（光斑处）滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台（缩短镜头与装片距离，镜头浸入油中，至油圈不扩大为止镜头几与装片接触）粗调器徐徐下降载物台（密切注视视野，当捕捉到物像时，立即用细调器校正）仔细观察并绘图取出装片，清洗油镜：擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留（用手指辅助，迅速拭擦一、二次）用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯（2-3次）。
（二）细菌的简单染色法：涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察（三）细菌运动性的观察取洁净盖玻片，四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察〔结果分析〕1、画一圆圈表示视野，选取所观察的微生物绘图，注意特殊结构、形状和排列。
实验三 显微镜油镜的使用和细菌的革兰氏染色
一、实验目的 了解并掌握油镜的原理和使用方法； 掌握细菌革兰氏染色的原理和方法，学会在 油镜下观察细胞和识别细菌的形态特征。
二、实验材料
1、菌种：大肠杆菌、葡萄球菌 2、仪器：显微镜 3、染色液：草酸铵结晶紫染色液、Lugol碘 液、95％乙醇、0.5%沙黄染色液 4、材料：载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜 纸
直接用高倍镜或油镜观察？ 4、革兰氏染色中哪一步是关键，为什么？你如
何控制这一步？
葡萄球菌
大肠杆菌
（1）涂片：：载玻片要洁净无油迹；滴生理 盐水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不可 过于浓厚
（2）固定： 染色前必须固定细菌，其目的是： 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。 二是增加其对染料的亲和力。常用加热固定
法。固定时尽量维持细胞原有的形态。
注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜， 温度过高会改变甚至破坏细胞形态。
（3）染色（先阅读p.31的注意事项）
革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色 是整个操作的关键环节，脱色不足，阴性 菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被 误染成阴性菌。
染色过程中勿使染色液干涸。用水冲 洗后，应摔去细胞上的残水，以免染色液 被稀释。
（4）镜检(p.24，用低倍、高倍、油镜 分别观察细菌)
D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰
（二）油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。当光 线由反光镜通过玻片与镜头 之间的空气时，由于空气与 玻片的密度不同，使光线受 到曲折，发生散射，降低了 视野的照明度。若中间的介 质是一层油（其折射率与玻 片的相近），则几乎不发生 折射，增加了视野的进光量， 从而使物象更加清晰。
以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过 于密集的细菌，常常呈假阳性。
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率。
：
镜口角（即入射角）。
普通光学显微镜Ⅲ
油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。当光 线由反光镜通过玻片与镜头 之间的空气时，由于空气与 玻片的密度不同，使光线受 到曲折，发生散射，降低了 视野的照明度。若中间的介 质是一层油（其折射率与玻 片的相近），则几乎不发生 折射，增加了视野的进光量， 从而使物象更加清晰。
5.观察完毕，取下标本片，立即用擦镜纸顺一 个方向旋转擦拭镜头上的油。若油已干，应 先用二甲苯滴在擦镜纸上擦净镜头，再用另 一干净擦镜纸拭去镜头上沾有的二甲苯;
6.显微镜擦净后，降低物镜并将其转成八字形， 集光器下降，光圈关上，关闭电源，罩上显 微镜罩
油镜使用注意事项
油镜的识别：油镜头上都有标记；标有100×；镜头 前端有黑、白或红色的圆圈；刻有“III”或Oil等，其 入光孔径也较其他物镜小；
普通光学显微镜Ⅱ
显微镜的放大倍数和分辨率
1.放大倍数=接物镜放大倍数×接目 镜放大倍数
2. 显微镜的分辨率 是表示显微镜
辨析物体（两端）两点之间距离的
能力，可用公式表示为：
D=λ/2n·sin(α/2 )
式中D：物镜分辨出物体两点间的
最短距离。
：可见光的波长（平均0.55m)
n: 物镜和被检标本间介质的折射
常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、石炭酸复红等。
实验材料
菌种 产气杆菌营养琼脂斜面培养物； 金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面培养物
试剂 结晶紫染液、石炭酸复红染液、香柏油、二甲苯、无菌 水
仪器及其它 显微镜、酒精灯，载玻片，接种环，擦镜纸等。
实验流程
制备细菌染色装片
油镜观察
实验步骤
1、 用简单染色法制备细菌染色装片 涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥
油镜的使用方法
1.用油镜时，勿将镜臂弯曲倾斜，以免油滴或 菌液流淌外溢，影响观察造成污染。
2.用低倍镜对光，同时调节集光器和光圈以获 得最适亮度。染色标本油镜检查时，应将光 圈完全打开，集光器上升至载物台相平，使 光亮度很强。
3.标本片放在载物台上，用压片夹固定。
4.低倍镜找出标本的范围，然后在待检部位上 加一滴香柏油，转动镜头转换器，将油镜头置 于工作位置，从侧面观察并缓慢转动粗调节器， 使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻 片时停止转动，然后眼睛移至目镜，缓慢向上 移动粗调节器,待看到模糊物象时，再用细调 节器转动至物象完全清晰为止;
实验一 油镜的使用和细菌的简单染色方法
目的
1、了解油镜的基本原理，掌握油镜的使用方法 2、掌握细菌的简单染色方法及原理示意图
光线从标本玻片经空气 进入镜头时，由于介质 密度不同而发生折射现 象，因此进入物镜中的 光线很少，结果视野很 暗，物像不清晰。如在 玻片上加上折光率和玻 片(n=1.52)相近的香 柏油(n＝1.515)，就可 避免光线的分散，加强 视野的亮度，获得清晰 的物像
2 使用油镜观察细菌染色装片 低倍镜 高倍镜 油镜
实验结果
绘图
问题与思考 油镜的使用就注意哪些问题？
普通光学显微镜Ⅰ
显微镜的构造
1.光学部分:接目镜 、 接
物镜 、 照明装置(聚光镜、 虹彩光圈、 反光镜等). 它使 检视物放大,造成物象.
2.机械部分:镜座、镜臂、
镜筒、物镜转换器、载物台、 载物台转移器、粗调节器、细 调节器等部件.它起着支持 调 节 固定等作用.
油镜头使用后应立即用擦镜纸擦净镜头上的油。注意 在擦拭时，要求顺一个方向旋转擦，不能两个方向来 回擦；
取送显微镜时，应右手持镜臂，左手托镜座，平端于 胸前。
不用时，将接物镜转开呈“八”字状，集光器下降， 罩上镜罩。对号归位。
原理
细菌简单染色法的原理
细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对 它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与 背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操 作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。