实验二 革兰氏染色及真菌结构讲义教材
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细菌的革兰染色法ppt课件
紫色 仍为紫色 脱去紫色 红色
三、实验材料 1.菌种
（1）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） （2）大肠杆菌（Escherichia coli）
培养24h，用于革兰氏染色。 2.染色液和试剂
草酸铵结晶紫染液、卢革氏碘液、95%酒精、番红染液、 生理盐水、乙醚-乙醇溶液、香柏油。 3.器材 废液缸、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、显 微镜等。
实验二、细菌的革兰氏染色
一、实验目的 1. 掌握细菌革兰氏染色原理及方法、巩固油
镜的使用； 2. 初步掌握无菌操作技术。
二、实验原理 革兰氏染色法（Gram, 丹麦，1884年） （1）是细菌学上最常用的鉴别染色法，染色后，可将
细菌分为G+菌和G-菌。 （2）机理
主要因为两类细菌细胞壁结构和成分不同。 ➢ G+菌细胞壁：肽聚糖含量高（90％）、交联程度高、
肽聚糖层厚、脂类含量少→用乙醇不易脱色； ➢ G-菌细胞壁：肽聚糖含量低（10％）、交联程度低，
肽聚糖层薄、外壁层脂类含量较高→用乙醇易脱色。
革兰氏染色程序和结果
步骤 方法
结果 阳性（G+） 阴性（G-）
初染 结晶紫 30s
紫色
媒染剂 碘液 30s
仍为紫色
脱色 95％乙醇 30s
保持紫色
复染 番红（或复红）30～60s 仍显紫色
四、实验方法
1.革兰氏染色 （1）步骤
取一干净载玻片→→在两端各加一滴生理盐水→→无 菌操作取菌种→→涂于生理盐水中（成菌膜） →→自 然干燥→→火焰固定→→初染（结晶紫，1min） →→水洗→→媒染（碘液，1min） →→水洗→→脱 色（乙醇，20-30s） →→水洗→→复染（蕃红， 2min） →→水洗→→自然干燥→→观察。
三、实验材料 1.菌种
（1）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） （2）大肠杆菌（Escherichia coli）
培养24h，用于革兰氏染色。 2.染色液和试剂
草酸铵结晶紫染液、卢革氏碘液、95%酒精、番红染液、 生理盐水、乙醚-乙醇溶液、香柏油。 3.器材 废液缸、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、显 微镜等。
实验二、细菌的革兰氏染色
一、实验目的 1. 掌握细菌革兰氏染色原理及方法、巩固油
镜的使用； 2. 初步掌握无菌操作技术。
二、实验原理 革兰氏染色法（Gram, 丹麦，1884年） （1）是细菌学上最常用的鉴别染色法，染色后，可将
细菌分为G+菌和G-菌。 （2）机理
主要因为两类细菌细胞壁结构和成分不同。 ➢ G+菌细胞壁：肽聚糖含量高（90％）、交联程度高、
肽聚糖层厚、脂类含量少→用乙醇不易脱色； ➢ G-菌细胞壁：肽聚糖含量低（10％）、交联程度低，
肽聚糖层薄、外壁层脂类含量较高→用乙醇易脱色。
革兰氏染色程序和结果
步骤 方法
结果 阳性（G+） 阴性（G-）
初染 结晶紫 30s
紫色
媒染剂 碘液 30s
仍为紫色
脱色 95％乙醇 30s
保持紫色
复染 番红（或复红）30～60s 仍显紫色
四、实验方法
1.革兰氏染色 （1）步骤
取一干净载玻片→→在两端各加一滴生理盐水→→无 菌操作取菌种→→涂于生理盐水中（成菌膜） →→自 然干燥→→火焰固定→→初染（结晶紫，1min） →→水洗→→媒染（碘液，1min） →→水洗→→脱 色（乙醇，20-30s） →→水洗→→复染（蕃红， 2min） →→水洗→→自然干燥→→观察。
实验二细菌的革兰氏染色及芽孢染色法ppt课件
染色时，染料可进入菌体和芽孢； ➢ 进入菌体的染料经水洗后可被脱色； ➢ 当用对比度大、浅色的复染色剂（番红）染色后，
芽孢仍保留初染剂的颜色（绿色），而菌体呈复染 剂颜色（红色）。
（三）实验器材
1、活材料： ➢ 革兰氏染色：培养12h-16h枯草杆菌（Bacillus subtilis）
和培养24h大肠杆菌（Escherichia coli） ➢ 芽孢染色：培养28-36 小时 的蜡状芽孢杆菌（Bacillus
你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。
本次实验课结束
请确保油镜头擦拭干净！
擦油镜镜头方法： A）先用擦镜纸揩去镜头上的香柏油 B）用擦镜纸沾少许二甲苯，擦拭镜头； C）再用一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的二甲苯。
后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用
资料仅供参考，实际情况实际分析
（四）实验步骤——芽孢染色
改良的Schaeffer-Fulton氏染色法
❖制备菌悬液 ❖染色 ❖涂片固定 ❖脱色 ❖复染 ❖镜检
芽孢染色---制备菌悬液
1、滴生理盐水 生理盐水
2、制备菌悬液 挑取2-3环菌苔
在EP管中滴2 滴生理盐水
与生理盐水混匀
芽孢染色---染色
1、滴加孔雀绿染液 5%孔雀绿染液
（四）实验步骤——革兰氏染色
3.观察实验结果 待标本自干或用吸水纸吸干后，置显微镜
下检查。
革兰阳性菌（G+）， 被染成蓝紫色。
革兰阴性菌（G-）， 被染成红色。
实验程序Ⅰ（革兰氏染色的方法和步骤）
每人取大肠杆菌和枯草杆菌，做一块混合涂片，进行革兰氏染色。
蒸 馏 水
涂片
干
涂 片
芽孢仍保留初染剂的颜色（绿色），而菌体呈复染 剂颜色（红色）。
（三）实验器材
1、活材料： ➢ 革兰氏染色：培养12h-16h枯草杆菌（Bacillus subtilis）
和培养24h大肠杆菌（Escherichia coli） ➢ 芽孢染色：培养28-36 小时 的蜡状芽孢杆菌（Bacillus
你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。
本次实验课结束
请确保油镜头擦拭干净！
擦油镜镜头方法： A）先用擦镜纸揩去镜头上的香柏油 B）用擦镜纸沾少许二甲苯，擦拭镜头； C）再用一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的二甲苯。
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（四）实验步骤——芽孢染色
改良的Schaeffer-Fulton氏染色法
❖制备菌悬液 ❖染色 ❖涂片固定 ❖脱色 ❖复染 ❖镜检
芽孢染色---制备菌悬液
1、滴生理盐水 生理盐水
2、制备菌悬液 挑取2-3环菌苔
在EP管中滴2 滴生理盐水
与生理盐水混匀
芽孢染色---染色
1、滴加孔雀绿染液 5%孔雀绿染液
（四）实验步骤——革兰氏染色
3.观察实验结果 待标本自干或用吸水纸吸干后，置显微镜
下检查。
革兰阳性菌（G+）， 被染成蓝紫色。
革兰阴性菌（G-）， 被染成红色。
实验程序Ⅰ（革兰氏染色的方法和步骤）
每人取大肠杆菌和枯草杆菌，做一块混合涂片，进行革兰氏染色。
蒸 馏 水
涂片
干
涂 片
-实验二革兰氏染色及细菌特殊结构观察
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革兰氏（Gram）染色法
1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面水冲洗至无紫色。
3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲 去残水，而后用其覆盖涂面1分 钟，后水洗。
4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒 精进行脱色约15－20秒，后立即 用流水冲洗。
5. 复染：滴加番红染色液，染3－5 分钟，水洗后用吸水纸吸干。
细菌的特殊形态结构
芽孢：休眠体，不利环境下产生，耐受各 种极端环境。
荚膜：多糖，包裹在菌体外围，保护菌体 鞭毛：运动，菌落形态。
三、实验材料
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢 杆菌（24h培养物）
革兰氏染色液一套
四、实验步骤
革兰氏染色 枯草杆菌的芽孢观察 观看鞭毛、荚膜的示范片 绘图、写实验报告
革兰氏（Gram）染色法
1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面水冲洗至无紫色。
3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲 去残水，而后用其覆盖涂面1分 钟，后水洗。
4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒 精进行脱色约15－20秒，后立即 用流水冲洗。
5. 复染：滴加番红染色液，染3－5 分钟，水洗后用吸水纸吸干。
细菌的特殊形态结构
芽孢：休眠体，不利环境下产生，耐受各 种极端环境。
荚膜：多糖，包裹在菌体外围，保护菌体 鞭毛：运动，菌落形态。
三、实验材料
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢 杆菌（24h培养物）
革兰氏染色液一套
四、实验步骤
革兰氏染色 枯草杆菌的芽孢观察 观看鞭毛、荚膜的示范片 绘图、写实验报告
微生物实验二细菌的简单染色和革兰氏染色_图文_图文
染色结果
金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果
染色结果
大肠杆菌革兰氏染色结果
染色结果
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌样的革兰氏染色结果
四、实验结果
显微镜放大倍数＝物镜放大倍数×目镜放大倍数
绘图记录观察结果
思考题
1、在制作涂片中，为什么要进行固定这 一步？
2、革兰氏染色中哪一步关键，为什么？
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳 性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁 的结构和组成不同决定的。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂 结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用 乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红 )复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂 蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞 中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染 剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌 。
2、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。 3、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。 4、染色：待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上，覆盖涂
面染色1-2分钟。 5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的
水变无色为止（注：勿冲去菌体）。 6、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。 7、镜检：油镜观察并绘图。
二、实验原理---简单染色
染色前必须固定细菌。其目的有二：一是 杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增 加其对染料的亲和力。常用的有加热和化 学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原 有的形。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+） 和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染 色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
微生物实验 革兰染色(病原生物学与免疫学课件)
4、染色： 革兰染色过程： ▪ 初染： 结晶紫 1滴
1分钟
▪ 媒染： 碘液1滴
1分钟
▪ 脱色： 95%酒精2滴 半分钟
▪ 复染： 稀释复红1滴 半分钟
▪每步染色完后均需水洗。
5、镜检 结果： 呈紫色为G+菌； 呈红色为G-菌；
紫碘酒红 一一半半 球阳杆阴 阳紫阴红
思考题
1．在细菌染色涂片的制作过程中，固定 的目的和意义是什么？
1. 细菌蛋白质是两性电解质，等电点较低，在 pI2-5之间。故在近于中性的环境中，细菌多带负电 荷，易与带正电荷的碱性染料结合。
2. 细菌胞质中含有大量呈酸性的RNA，也与碱性 染料有亲和性。
单染和复染 ▪ 单染：一种染料 ▪ 复染：两种或两种以上染料进行染色
革兰染色 抗酸染色
革兰染色(Gram stain)
个细菌菌落，在玻片上涂成直径约为1.0cm 的菌膜。（Tip:菌量不宜过多，以免标本过 厚，影响染色结果）
2、干燥： 最好在室温中自然干燥，或放入37度培
养箱，也可在远离火焰上方微微烘干，但 切勿靠近火焰以免烤焦标本。（Tip:如烘干， 以玻片不烫手为宜。）
3、固定：
火焰固定。固定的作用一是杀死细菌，同 时可改变对染料的通透性（因为活的细菌一 般不让各种染料进入细胞内）。再者使细菌 与玻片粘附牢固，三是使细菌蛋白凝固后保 持其固有的外形。
2．革兰染色的意义。 3．革兰染色时，为什么会出现阳性菌阴
染的现象？
细菌是无色半透明的微小生物，肉眼看不到，必须 借助于显微镜才能够观察。然而，未经染色的细菌 标本，在普通光学显微镜下只能粗略地看见其形态 和大小，只有经过染色后才能观察清楚。染色后镜 检，不但可以识别细菌的各种不同结构，还可以辅 助鉴别细菌。
实验二细菌革兰氏染色ppt课件
兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。 （3）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。 （4）设定阴性和阳性对照，确保实验的可靠性。
五、思考题
1、讲述革兰氏染色的原理并指出E.C和B.S分别属于革兰 氏阳性或阴性？
2、观察细菌为什么要染色？为什么细菌染色多采用碱性 染料？
3、做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？革兰氏染色 成败的关键一步是什么？
crystal violet stain
wash with water
Counterstain wi在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀， 固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
（2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱 色
时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足， 革
占细胞壁干重的%
革兰氏阳性细菌
革兰氏阴性细菌
含量很高（50~90）
含量很低（~10）
含量较高（＜50）
无
一般无（＜2）
含量较高（~20）
无
含量较高
三、实验材料
1、菌种：大肠杆菌（E.C）、枯草杆菌（B.S） 2、染料：结晶紫、复红、碘液等 3、材料：95%酒精等
Heat fixing
Staining
实验二 细菌革兰氏染色
一、实验目的
学习微生物制片、染色的基本技术 掌握细菌革兰氏染色及无菌操作技术 进一步观察细菌的基本形态
二、实验原理
C.Gram（革兰）于1884年 发明的一种鉴别不同类型 细菌的染色方法。
革兰氏染色
1、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染
2、用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细 胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。
4、当对未知菌进行革兰氏染色时，怎样能证明你的染色 技术和结果的正确性？
五、思考题
1、讲述革兰氏染色的原理并指出E.C和B.S分别属于革兰 氏阳性或阴性？
2、观察细菌为什么要染色？为什么细菌染色多采用碱性 染料？
3、做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？革兰氏染色 成败的关键一步是什么？
crystal violet stain
wash with water
Counterstain wi在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀， 固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
（2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱 色
时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足， 革
占细胞壁干重的%
革兰氏阳性细菌
革兰氏阴性细菌
含量很高（50~90）
含量很低（~10）
含量较高（＜50）
无
一般无（＜2）
含量较高（~20）
无
含量较高
三、实验材料
1、菌种：大肠杆菌（E.C）、枯草杆菌（B.S） 2、染料：结晶紫、复红、碘液等 3、材料：95%酒精等
Heat fixing
Staining
实验二 细菌革兰氏染色
一、实验目的
学习微生物制片、染色的基本技术 掌握细菌革兰氏染色及无菌操作技术 进一步观察细菌的基本形态
二、实验原理
C.Gram（革兰）于1884年 发明的一种鉴别不同类型 细菌的染色方法。
革兰氏染色
1、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染
2、用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细 胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。
4、当对未知菌进行革兰氏染色时，怎样能证明你的染色 技术和结果的正确性？
革兰氏染色实验课件
手指皮肤细菌
菌落形态
教学目标：
1.巩固和掌握显微镜油镜的正确使用 2.学习细菌革兰氏染色的原理和方法 3.学会显微镜观察细菌的形态 3.对人体微生物染色检查，初步建立无菌操作的概念
显微镜的使用
油镜头的识别和重要参数 油镜的工作原理 油镜的使用方法和注意事项
油镜头的识别和重要参数
放大倍数 数值口径 工作距离
实验二 革兰氏染色
实验要求
坚持课前预习 不迟到，不早退，更不能无故缺课 严格按照正确规范实验方法进行实验，作好记录 保持实验室整洁 注意安全 实事求是、独立完成实验报告
课程导入
观察上次实验课细菌培养结果 菌落观察：37℃孵育18～24h后观察 1.大小 2.形状 3.表面（光滑？ 湿润？） 4.边缘（整齐？） 5.透明？ 6.颜色（色素？）
注意：操作过程中始终贯穿无菌操作观念，要把生物安全放在心 里。在新冠疫情的环境下，作为医学生更应该牢记生物安全。
方法与步骤
2.染色
初染
1min
（结晶紫） 水洗
媒染 1min （碘液） 水洗
脱色 （95%乙醇）
30s～1min 水洗
自然干燥 观察
30s 复染 水洗 （稀释石碳酸复红）
方法与步骤
实验报告
姓名、班级和学号 实验题目 实验原理（略写） 实验操作（略写） 实验结果
——画图 ——文字描述 分析和讨论 思考题
思考
1.影响实验结果的因素有哪些？ 2.为什么初染时间不能过长？
劳动教育
1.分组整理和打扫实验室 2.实验后废弃物的分类 3.生物安全（培养基灭菌，洗手）
3.观察 1）看颜色
2)看形态
紫色：G+
红色：G圆形：球菌 杆形：杆菌 弧形：弧菌
实验二-细菌的革兰氏染色
实验二-细菌的革兰氏染色摘要在本实验中，我们学习了细菌的革兰氏染色方法，它是一种常用的细菌分类技术。
通过革兰氏染色，可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
在实验中，我们将细菌样本进行了革兰氏染色，并观察了染色后不同类型菌落的变化。
背景细菌的革兰氏染色是细菌学中常用的分类技术，它可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏染色的原理是利用不同类型菌壁对染色剂的染色特性。
革兰氏阳性菌具有较厚的层状菌壁，菌壁数量较多且含有高量的肽聚糖和穿孔蛋白，故在革兰氏染色中易被靛基紫染色，即为紫色。
而革兰氏阴性菌菌壁较少，含有脂质多糖结构，靛基紫容易被脱色，失去颜色，再染上对比色——碘液后，在有机溶剂乙醇中去除结晶紫染料，洗净后再用第二种常规染色溶液（抗色素溶液）染色，为粉红色。
实验方法和步骤1.将郑重筛选发酵技术及纯化分离后的细菌分别进行涂片。
2.在涂片上滴上靛基紫染剂，静置1分钟，然后用水冲洗。
3.在涂片上滴上碘液，静置1分钟，然后再次用水冲洗。
4.滴上有机溶剂乙醇将片洗去结晶紫染料，然后再滴抗色素溶液在片上静置1~2分钟。
5.用水冲洗干净，然后把涂片放到显微镜下观察即可。
结果与分析在此次实验中，我们观察到了不同类型菌落的变化。
在涂片上的细菌，经过靛基紫的染色后，革兰氏阳性菌的细胞呈现出紫色颜色，而革兰氏阴性菌的细胞颜色并没有明显变化。
在加上碘液后，革兰氏阴性菌的细胞依旧没有变化，而革兰氏阳性菌的细胞则变得更加明显，呈现更深的紫色。
在使用有机溶剂乙醇将片洗去结晶紫染料后，再加上抗色素溶液，革兰氏阳性菌的细胞会继续呈现紫色，而革兰氏阴性菌的细胞则变成粉红色。
据此可知，我们通过革兰氏染色的方法，有效地将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
此外，我们还观察到不同类型菌落的变化，这对于后续实验中判断细菌种类及其特性非常有帮助。
细菌的革兰氏染色是一种常用的细菌分类技术，在本实验中我们成功地实现了对不同细菌样本的革兰氏染色及观察。
精华资料实验二普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色和革兰氏染色
精华资料实验二普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色和革兰氏染色实验二普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色和革兰氏染色普通光学显微镜的使用一、实验目的以染色玻片及活菌为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。
二、显微镜油镜使用的原理1 普通光学显微镜的基本构造(1)光学部分: 接目镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。
它使检视物放大, 造成物象。
(2)机械部分: 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。
它起着支持、调节、固定等作用。
2 显微镜的放大倍数和分辨率(1)放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数(2)显微镜的分辨率:表示显微镜辨析物体(两端)两点之间距离的能力，可用公式表示为:D=λ/2n?sin(α/2 )式中D:物镜分辨出物体两点间的最短距离。
λ:可见光的波长(平均0.55μm)n: 物镜和被检标本间介质的折射率。
a:镜口角(即入射角)。
3 油镜使用的原理油镜，即油浸接物镜。
当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。
若中间的介质是一层油(其折射率与玻片的相近)，则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。
三、实验材料1 显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、盖玻片、接种环、酒精灯等。
2 细菌三种形态的玻片染色标本。
3 培养12-18h的枯草芽孢杆菌。
四、实验方法与步骤1 染色细菌玻片的油镜观查(1)用前检查:零件是否齐全，镜头是否清洁。
(2)调节光亮度。
(3)低倍镜观察:先粗调再微调至物象清晰。
(4)转入中倍、高倍观察，每一不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。
(5)油镜观察:高倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。
6)绘出所观察到的细菌形态图像。
((7)、换片:另换新片观察，必须从(3)步开始操作。
实验二革兰氏染色及真菌结构
(二) 了解霉菌、酵母菌的特点 并观察其形态特征
三、实验材料
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（24h培养物） 革兰氏染色液一套 真核微生物标片
四、实验步骤
革兰氏（Gram）染色法
1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸
铵结晶紫染液，染1分钟，倾去 染液，流水冲洗至无紫色。
3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲 去残水，而后用其覆盖涂面1分 钟，后水洗。
观看根霉菌、青霉菌、曲霉菌与酵母菌 的示范片
绘图、写实验报告
六、问题与讨论
要得到正确的革兰氏染色结果必须注意 哪些操作？哪一步是关键？Why?
本次实验课结束
请确保油镜头擦拭干净！ 下周再见！
实验二 革兰氏染色及真菌形 态结构观察
一、实验目的
学习细菌的革兰氏染色原理和方法
了解霉菌、酵母菌的特点并观察其形态特征
二、实验原理
单染色法：只能观察微生物的大小、形状、 和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及 它的特殊构造等。
复染色法：用两种或两种以上染色液进行 染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称 鉴别染色法。常用的有： 革兰氏染色法、荚膜染色法、芽孢染色法、 鞭毛染色法等。
(一) 革兰氏染色
丹麦C.Gram创立，用于细菌分类学研究 细菌细胞壁的结构
G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂 质，故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了 类脂质，增加了细胞的通透性，使初染 的结晶紫和碘的复合物易于渗出，经沙 黄复染呈红色。
G＋细胞壁结构致密，用脱色剂处理后， 肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细 菌仍保留初染时的紫色。
2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后， 应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释 而影响染色效果。
3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h， E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死 亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴高倍镜观察啤酒酵母的 形态和出芽繁殖。
微生物实验二细菌的简单染色和革兰氏染色PPT文档共25页
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
微生物实验二细菌的简单染色和革兰 氏染色
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6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
7、心急吃不了热汤圆。
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8、你可以很有个性，但某些时候请收 敛。
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9、只为成功找方法，不为失败找借口 (蹩脚 的工人 总是说 工具不 好)。
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10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。
实验二 革兰氏染色及真菌结构
(二) 了解霉菌、酵母菌的特点 并观察其形态特征
三、实验材料
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（24h培养物） 革兰氏染色液一套 真核微生物标片
四、实验步骤
革兰氏（Gram）染色法
1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸
铵结晶紫染液，染1分钟，倾去 染液，流水冲洗至无紫色。
3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲 去残水，而后用其覆盖涂面1分 钟，后水洗。
2.染色过程中勿使染色液干涸用水冲洗后， 应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释 而影响染色效果。
3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h， E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死 亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
观察酵母菌形态和无 性繁殖：
用高倍镜观察啤酒酵母的 形态和出芽繁殖。
观察黑根霉菌丝情况和子囊孢子情
况（着重辨认孢子囊、包囊梗、假 根）：
观察青霉菌丝和分 生孢子着生情况：
1.单轮生青霉群；2.对称二轮 生青霉群；3.多轮生青霉群； 4.不对称生青霉群
观察黑曲霉菌丝分隔情况和分生孢子着
生情况（着重辨认分生孢子梗、足细胞 和分生孢子）：
五、实验结果
记录所观察到的二种菌革兰氏染色结果 的差别，并判断是阳性还是阴性
4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒 精进行脱色约15－20秒，后立即 用流水冲洗。
5. 复染：滴加番红染色液，染3－5 分钟，水洗后用吸水纸吸干。
6. 镜检：观察染色结果并绘图。
注意事项
1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色 过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性 菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被 染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂 片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以 严格规定。
革兰染色法及细菌形态和结构课件
干燥
将涂片自然干燥或用火焰 加热固定。
结晶紫初染
将涂片浸入结晶紫染液中， 染色30秒后水洗。
革兰染色法的操作步骤
碘液媒染
酸性酒精脱色
碱性酒精复染
干燥
将涂片浸入碘液中，媒 染1分钟，水洗。
将涂片放入酸性酒精中 脱色30秒，水洗。
将涂片放入碱性酒精中 复染30秒，水洗。
用吸水纸吸干涂片上的 水分，观察结果。
优点
快速
准确
革兰染色法是一种快速且有效的细菌鉴定 方法，可以在短时间内得出结果。
革兰染色法能够准确地鉴别出革兰氏阳性 菌和革兰氏阴性菌，对于临床诊断和治疗 具有重要意义。
简便
经济
革兰染色法的操作相对简单，不需要复杂 的设备和仪器，适合在基层医疗单位和野 外条件下使用。
革兰染色法成本较低，能够为实验室节约 一定的经费。
缺点
主观性 革兰染色法的结果很大程度上依赖于实 验人员的操作和判断，具有一定的主观
性。 对某些特殊细菌不适用 对于一些具有特殊染色特性的细菌， 革兰染色法可能无法准确鉴别，需要
采用其他方法进行鉴定。
局限性
革兰染色法只能对细菌进行大致的分 类，无法提供更详细的细菌属性和特 征信息。
对某些染料敏感度较低
有些细菌对革兰染色所使用的染料敏 感度较低，导致染色效果不佳，影响 结果的准确性。
05 革兰染色法的发展趋势和 未来展望
发展趋势
自动化与智能化
联合其他检测方法
随着科技的发展，革兰染色法的自动 化和智能化成为趋势，能够提高染色 效率和准确性。
将革兰染色法与其他检测方法结合使 用，如免疫学、分子生物学方法等， 以提高病原菌的检出率和鉴定准确性。
感染。对医院环境和医护人员手部进行革兰染色检测，可以及时发现并
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六、问题与讨论
要得到正确的革兰氏染色结果必须注意 哪些操作？哪一步是关键？Why?
本次实验课结束
请确保油镜头擦拭干净！ 下周再见！
铵结晶紫染液，染1分钟，倾去 染液，流水冲洗至无紫色。
3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲 去残水，而后用其覆盖涂面1分 钟，后水洗。
4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒 精进行脱色约15－20秒，后立即 用流水冲洗。
5. 复染：滴加番红染色液，染3－5 分钟，水洗后用吸水纸吸干。
6. 镜检：一、实验目的
学习细菌的革兰氏染色原理和方法
了解霉菌、酵母菌的特点并观察其形态特征
二、实验原理
单染色法：只能观察微生物的大小、形状、 和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及 它的特殊构造等。
复染色法：用两种或两种以上染色液进行 染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称 鉴别染色法。常用的有： 革兰氏染色法、荚膜染色法、芽孢染色法、 鞭毛染色法等。
(一) 革兰氏染色
丹麦C.Gram创立，用于细菌分类学研究 细菌细胞壁的结构
(二) 了解霉菌、酵母菌的特点 并观察其形态特征
三、实验材料
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（24h培养物） 革兰氏染色液一套 真核微生物标片
四、实验步骤
革兰氏（Gram）染色法
1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸
注意事项
1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色 过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性 菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被 染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂 片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以 严格规定。
2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后， 应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释 而影响染色效果。
1.单轮生青霉群；2.对称二轮 生青霉群；3.多轮生青霉群；4. 不对称生青霉群
观察黑曲霉菌丝分隔情况和分生孢子着
生情况（着重辨认分生孢子梗、足细胞 和分生孢子）：
五、实验结果
记录所观察到的二种菌革兰氏染色结果 的差别，并判断是阳性还是阴性
观看根霉菌、青霉菌、曲霉菌与酵母菌 的示范片
绘图、写实验报告
3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h， E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死 亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
观察酵母菌形态和无 性繁殖：
用高倍镜观察啤酒酵母的 形态和出芽繁殖。
观察黑根霉菌丝情况和子囊孢子情
况（着重辨认孢子囊、包囊梗、假 根）：
观察青霉菌丝和分 生孢子着生情况：