ELISA 原理、方法及操作细节
ELISA原理方法操作及注意事项
ELISA原理方法操作及注意事项ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测目标分子的存在和浓度。
ELISA方法基于抗原-抗体反应的原理，通过酶标记的二抗或底物来标记和检测特定抗原或抗体的结合。
1.涂覆：将特异性抗体或抗原溶液加入微孔板的孔中，使其在孔壁上吸附，形成“涂覆抗原”或“涂覆抗体”的微孔板。
孔顶部通常需要使用一个覆膜或负压干燥来防止蒸发。
2.阻断：将孔中添加阻断剂如牛血清白蛋白（BSA）或乳糖，以防止非特异性结合。
3.样品加入：将待测样品加入微孔板，并充分搅拌孔内溶液，以使潜在的目标分子与涂覆的抗原或抗体结合。
4.洗涤：使用缓冲溶液洗涤孔内溶液，以去除未结合的物质。
5.次级抗体加入：加入酶标记的二抗，以与结合到涂覆抗原或抗体的目标分子结合。
这种二抗可以是对目标物质抗体的抗体，也可以是对使用的抗原的抗体。
6.洗涤：使用缓冲溶液洗涤孔内溶液，以去除未结合的物质。
7.底物加入：加入底物（通常为染色底物），以使酶标记的二抗产生可观察的信号。
底物反应产生的颜色或荧光强度与目标分子的浓度成正比。
8.停止反应：加入停止剂如酸，以停止底物反应，并防止进一步的信号增加。
此步骤通常在一定时间后进行。
1.注意对ELISA试剂的保存和使用条件，避免试剂的过期或不适当的保存导致结果偏差。
2.样品收集和处理方面要仔细。
避免样品的污染和交叉污染。
根据检测的目标分子选择适当的样品收集方法和处理方法。
3.在操作过程中，严格控制操作温度和时间。
不同的ELISA方法和试剂可能需要不同的温度和时间条件。
4.遵循相关的操作规程和实验室安全准则，使用个人保护装备，确保实验室安全。
5.在操作过程中，要准确记录每个步骤的时间、温度和取样量等信息，以便进行准确的数据分析和结果解释。
6.ELISA的结果通常是通过测量光密度或荧光强度来表达的，因此在结果分析时需要针对每个样品和对照进行准确的光度或荧光测量。
ELISA方法的基本原理和操作步骤
ELISA方法的基本原理和操作步骤基本原理：1.直接ELISA：直接将酶标记的抗体与待测样品中的抗原结合。
该方法简单，适用于检测高浓度抗原，但不适用于低浓度抗原检测。
2.间接ELISA：先将待测样品中的抗原与特异性抗体结合，随后再加入酶标记的二抗与该特异性抗体结合。
该方法适用于特异性抗体较多的情况，能够提高检测灵敏度。
3.夹心ELISA：利用两种抗体分别与待测样品中的抗原结合，形成夹心复合物。
酶标记抗体与第二个抗体结合的复合物逐渐积累，从而实现对目标分子的定量检测。
4.竞争ELISA：利用酶标记抗体与待测样品中的抗原竞争结合，根据酶标记物对底物的催化反应产生的信号强度来反映待测样品中抗原的浓度。
操作步骤：1.酶标板涂布：取出96孔的酶标板，在每孔中加入特异性抗体，通常用于检测的是抗原，也可以是抗体。
将酶标板在4°C下孵育数小时或过夜，使抗体吸附在孔壁上。
2.冲洗：倒掉孔内液，用PBS-T洗涤缓冲液冲洗3-4次，去除未结合的抗体。
3.阻断：加入阻断缓冲液如5％的牛血清白蛋白(BSA)或非脂乳粉，防止非特异性结合。
4.样品加入：加入待测样品、标准品或对照样品，使待测物质与固相抗体结合。
5.洗涤：冲洗孔内液，去除未结合的样品。
6.酶标记抗体：加入酶标记的二级抗体，即酶联检测剂。
7.洗涤：冲洗孔内液，去除未结合的酶标记抗体。
8.底物加入：加入底物，底物受到酶标记的物质的催化，会产生信号。
9.反应停止：加入反应停止液，终止底物的反应。
10.读取结果：通过酶催化底物反应的产物颜色的变化，利用酶标仪读取OD值，反映抗原或抗体的浓度。
ELISA方法的基本原理和操作步骤
ELISA方法的基本原理和操作步骤自己收藏的觉得很有用故上传到百度与大家一起分享！ELISA方法的基本原理和操作步骤基本原理1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assayELISA）用于IgG定量测定的文章使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面并保持其免疫活性②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性又保留酶的活性在测定时把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例加入酶反应的底物后底物被酶催化变为有色产物产物的量与标本中受检物质的量直接相关故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析由于酶的催化频率很高故可极大地地放大反应效果从而使测定方法达到很高的敏感度方法类型和操作步骤ELISA可用于测定抗原也可用于测定抗体在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体②酶标记的抗原或抗体③酶作用的底物根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件可设计出各种不同类型的检测方法（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合形成固相抗原复合物洗涤除去其他未结合的物质（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合彻底洗涤未结合的酶标抗体此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量根据同样原理将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体（二）双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）这种双位点一步不但简化了操作缩短了反应时间如应用高亲和力的单克隆抗体测定的敏感性和特异性也显著提高单克隆抗体的应用使测定抗原的ELIS在一步法测定中应注意钩状效应（hookeffect）类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象当标本中待测抗原浓度相当高时过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合而不再形成夹心复合物所得结果将低于实际含量钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果（三）间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体故称为间接法操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体连接形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合形成固相抗原抗体复合物经洗涤后固相载体上只留下特异性抗体其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合在洗涤过程中被洗去（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合从而使该抗体间接地标记上酶洗涤后固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量例如欲测人对某种疾病的抗体可用酶标羊抗人IgG抗体（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量本法只要更换不同的固相抗原可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体（四）竞争法竞争法可用于测定抗原也可用于测定抗体以测定抗原为例受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比操作步骤如下：（1）将特异抗体与固相载体连接形成固相抗体洗涤（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液使之与固相抗体反应如受检标本中无抗原则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合如受检标本中含有抗原则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会使酶标抗原与固相载体的结合量减少参考管中只加酶标抗原保温后酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量洗涤（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多故颜色最深参考管颜色深度与待测管颜色深度之差代表受检标本抗原的量待测管颜色越淡表示标本中抗原含量越多（五）捕获法测IgM抗体血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在后者会干扰IgM抗体的测定因此测定IgM抗本多用捕获法先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上在去除IgG后再测定特异性IgM操作步骤如下：（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上形成固相抗人IgM洗涤（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合洗涤（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合洗涤（5）加底物显色：如有颜色显示则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在是为阳性反应（六）应用亲和素和生物素的ELISA亲和素是一种糖蛋白可由蛋清中提取分子量60kD每个分子由4个亚基组成可以和4个生物素分子亲密结合现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）生物素（biotin）又称维生素H分子量244.31存在于蛋黄中用化学方法制成的衍生物生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimideBNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物亲和素与生物素的结合虽不属免疫反应但特异性强亲和力大两者一经结合就极为稳定由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置可以连接更多的生物素化的分子形成一种类似晶格的复合体因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来就可大提高ELISA的敏感度亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式可用于间接包被亦可用于终反应放大可以在固相上先预包被亲和素原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量而且使其结合点充分暴露另外在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代然后连接亲和素－酶结合物以放大反应信号ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色一、ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性又保留酶的活性在测定时受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开再加入酶标记的抗原或抗体也通过反应而结合在固相载体上此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例加入酶反应的底物后底物被酶催化成为有色产物产物的量与标本中受检物质的量直接相关故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析由于酶的催化效率很高间接地放大了免疫反应的结果使测定方法达到很高的敏感度二、ELISA的类型ELISA可用于测定抗原也可用于测定抗体在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体称为"酶联物"、"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件可设计出各种不同类型的检测方法用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：（一）双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体联结形成固相抗体洗涤除去未结合的抗体及杂质（2）加受检标本保温反应标本中的抗原与固相抗体结合形成固相抗原抗体复合物洗涤除去其他未结合物质（3）加酶标抗体保温反应固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合彻底洗涤未结合的酶标抗体此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关（4）加底物显色固相上的酶催化底物成为有色产物通过比色测知标本中抗原的量在临床检验中此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等只要获得针对受检抗原的异性抗体就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法如抗体的来源为抗血清包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物如应用单克隆抗体一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗分别用于包被固相载体和制备酶结合物这种双位点夹心法具有很高的特异性而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应作一步法检测在一步法测定中当标本中受检抗原的含量很高时过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合而不再形成"夹心复合物"类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同如按常法测读所得结果将低于实际的含量这种现象被称为钩状效应（hook effect）因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落钩状效应严重时反应甚至可不显色而出现假阴性结果因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时应注意可测范围的最高值用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇例如HBsAg的a决定簇也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物但在HBsAg的检测中应注意亚型问题HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性这也是用单抗作夹心法应注意的问题双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰RF是一种自身抗体多为IgM型能和多种动物IgG的Fc段结合用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF它可充当抗原成份同时与固相抗体和酶标抗体结合表现出假阳性反应采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂由于去除了Fc段从而可消除RF的干扰双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原因其不能形成两位点夹心（二）双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似用特异性抗原进行包被和制备酶结合物以检测相应的抗体与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体此法中受检标本不需稀释可直接用于测定因此其敏感度相对高于间接法乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法本法关键在于酶标抗原的制备应根据抗原结构的不同寻找合适的标记方法（三）间接法测抗体(我公司分装TORCH及传染病试剂盒大多采用本法)间接法是检测抗体常用的方法其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体故称为间接法（见图2-3）操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体联结形成固相抗原洗涤除去未结合的抗原及杂质（2）加稀释的受检血清保温反应血清中的特异抗体与固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物经洗涤后固相载体上只留下特异性抗体血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去（3）加酶标抗抗体可用酶标抗人Ig以检测总抗体但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合从而间接地标记上酶洗涤后固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关（4）加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法间接法成功的关键在于抗原的纯度虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果但应尽可能予以纯化以提高试验的特异性特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质例如以E.Coli为工程酶的重组抗原如其中含有E.Coli成份很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质例如来自人血浆或人体组织的抗原如不将其中的Ig去除试验中也发生假阳性反应另外如抗原中含有无关蛋白也会因竟争吸附而影响包被效果间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分IgG的吸附性很强非特异IgG可直接吸附到固相载体上有时也可吸附到包被抗原的表面因此在间接法中抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次以封闭（blocking）固相上的空余间隙另外在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200）以避免过高的阴性本底影响结果的判断（四）竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去或不易得到足够的纯化抗原时可用此法检测特异性抗体其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合标本中抗体量越多结合在固相上的酶标抗体愈少因此阳性反应呈色浅于阴性反应如抗原为高纯度的可直接包被固相如抗原中会有干扰物质直接包被不易成功可采用捕获包被法即先包被与固相抗原相应的抗体然后加入抗原形成固相抗原洗涤除去抗原中的杂质然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应竞争法测抗体有多种模式可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合抗HBc ELISA一般采用此法另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合洗涤后再加入酶标抗体与结合在固相上的抗原反应抗HBe的检测一般采用此法（五）竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点因此不能用双抗体夹心法进行测定可以采用竞争法模式其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合标本中抗原量含量愈多结合在固相上的酶标抗原愈少最后的显色也愈浅小分子激素、药物等ELISA测定多用此法（六）捕获包被法测抗体（经典方法）IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上因此如用抗人IgM作为二抗间接测定IgM抗体必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理以除去IgG的干扰在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法先用抗人IgM抗体包被固相以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）然后加入抗原此抗原仅与特异性IgM相结合继而加酶标记针对抗原的特异性抗体再与底物作用呈色即与标本中的IgM成正相关此法常用于病毒性感染的早期诊断甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测模式见图2-7.类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体导致假阳性反应因此中和IgG的间接法近来颇受青睐用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功（七）ABS-ELISA法ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语亲和素是一种糖蛋白分子量60000每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成生物素为小分子化合物分子量244.用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物标记方法颇为简便生物素与亲和素的结合具有很强的特异性其亲和力较抗原抗体反应大得多两者一经结合就极为稳定由于一个亲和素可与4个生物素分子结合因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）在LAB中固相生物素先与不标记的亲和素反应然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度在早期亲和素从蛋清中提取这种卵亲和素为碱性糖蛋白与聚苯乙烯载体的吸附性很强用于ELISA中可使本底增高从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点在ELISA应用中有替代前者的趋势由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂增加了操作步骤在临床检验中ABS-ELISA应用不多科研项目中检测微量的成分如细胞因子常采用本法ELISA试剂的临床质量评价点击次数：48 发表于：2008-08-04 13:25 转载请注明来自丁香园来源：丁香园ELISA试剂的评价（evaluation）分两个方面：一是试剂本身的质量评价符合一定要求后才能生产供应；一是在临床应用中效果的评价以肝炎ELISA诊断试剂为例首先必须通过中国药品生物制品检定以得到生产的许可检定内容除包装、标签、说明书等外对试剂的性能如特异性、灵敏度、精密度和线性等均需逐项检定通过对一系列参比品的检测结果符合要求者才为合格ELISA试剂的临床质量评价是用该试剂对临床样本进行检测以观察其实际应用价值部临检中心对乙肝ELISA诊断试剂在这方面进行了工作通过质量评价促进了试剂质量的提高一、诊断试剂临床质量评价要点从临床应用角度考核检验试剂的可靠性是以其能否区分健康与疾病的能力作为依据的目前还很难找到100%可靠的试验任何试验都会出现假阳性或假阴性判断试验的可靠性常以其灵敏度及特异性作为考核标准临床应用的灵敏度用疾病患者试验阳性的百分率表示特异性以无病者试验阴性的百分率表示进行这种评价首先需要收集有关的病人血清然后用公认的检测该项标志物最可靠的试剂进行测定以确定其为阳性或阴性这一组表明测定物为阳性或阴性的血清组成"血清盘"（panel）被评价的试剂测定此血清所得结果与血清盘标明的结果的关系如下表：血清盘结果合计＋－受检试剂结果＋ a b a+b － c d c+d 合计a+c b+d A+b+c+d 表中a为真阳性b为假阳性c为假阴性d为真阴性被评价试剂的各项性能指标按以下分式计算：灵敏度(%)=a/(a+c)×100%特异性(%)=b/(b+d)×100%符合率(%)=(a+d)/(a+b+c+d) ×100%一般认为灵敏度或特异性>90%为良好符合率是综合灵敏度和特异性的指标二、临床考核血清盘的制备要求1、采用人的原血清；2、血清盘应具有相应的稳定性；3、血清盘中样本不含防腐剂或只含极微量的、不影响检验结果的防腐剂；4、血清盘所包含的阴性样本和阳性样本约各占一半；5、阳性样本中应有一定数量的强阳性和弱阳性样本；6、血清盘中应有一定数量的临界值上、下含量的样品以检验试剂的灵敏度7、血清盘中应包含与该项检验相关的病种样本和已积知具有干扰物质（RF因子）的样本以检验试剂的特异性三、临床考核血清盘的建议以抗-HBc-IgM为例部临检中心收集近百例临床肝炎病人的样本经美国abbott公司抗-HBc-IgM试剂反复检验筛选选出血清70份其中阳性29份阴性41份组成抗-HBc-IgM临床考核血清盘在70份样本中除7份为无病历的质控血清外抗-HBc-IgM阳性的22份样本中含临床诊断急性肝炎16例、慢性活动性肝炎5例、重症肝炎1例；抗-HBc-IgM阴性的40份样本中含临床诊断慢性迁延性肝炎24例、急性肝炎例（均为恢复期采的血样）、慢性活动性肝炎8例（其中5例为恢复血样）因此这套抗血清盘用于商品试剂的临床考核可以将临床上乙肝急性期、慢性活动期病人区分开具有临床诊断意义。
ELISA原理、方法、操作及注意事项解析
双抗原夹心法测抗体
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竞争法检测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去 ，或不易得到足够的纯化抗原时，可 用竞争法检测特异性抗体。
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竞争法测抗体
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竞争法测抗体
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竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可 作夹心法的两个以上的位点，因此 不能用双抗体夹心法进行测定，可 以采用竞争法模式。小分子激素 、 药物等ELISA测定多用此法。
（1） 标本 可用作ELISA测定的标本十分 广泛，大部分ELISA检测均以血清 为标本。血清标本按常规方法采集， 应注意避免溶血，红细胞溶解时会 释放出具有过氧化物酶活性的物质， 以HRP为标记的ELISA测定中， 溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体 中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如 在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法 ELISA中可使本底加深。 一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃， 超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白 质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气 泡，可上下颠倒混和 ，不要在混匀器上强烈振荡。 混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再 检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血 清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存 血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐 剂。
ABS-ELISA法
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3. ELISA的操作
在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。 完整的ELISA试剂盒包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制 血清 （定量测定中）； （5）标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液。
ELISA干货实验原理+实验步骤+注意事项
ELISA干货实验原理+实验步骤+注意事项ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
在检测时，受检标本（测定其中的抗原）与固相载体表面的抗体反应。
洗涤后加入酶标记的抗体，通过反应结合在固相载体上。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
一、ELISA样本的处理ELISA的检测目的是为了实验提供准确的实验依据，为了保证实验数据的可靠性，在实验过程中必须坚持全面的质量控制和全过程质量控制，在收集标本前都必须有一个完整的计划注意事项1、每个样本量收集体积=100ulx检测种类，如果要做复孔，标本量收集体积=100ulx检测种类x22、样本收集后若在一周内进行检测可保存于2-8°C，若不及时检测，请进行分装，冻存于-20°或-80°C，避免反复冻融3、试剂盒的检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本。
4、血清标本采集是应注意避免溶血，红细胞溶解是会释放出具有过氧化物酶活性的物质，溶血标本可能会增加非特异性显色5、为了保证尿液检测的准确性，必须正确收集尿液标本和保存，收集尿液的容器必须要清洁干燥，最好使用一次性的容器，避免因用药并清洁不到而造成的污染，尿液样本必须新鲜，留取后，应及时检测或保存6、标本宜在新鲜是检测如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。
如在冰箱中保存过久，其中可能发生聚合，间接法ELISA中乐视本底加深，7、反复冻融会使蛋白效价降低，所以待测样本如需多次检测，宜少量分装冻存二、标本类型01、ELISA的常见标本液体类标本：血清、血浆、尿液、细胞上清、脑脊液等培养细胞组织标本02、ELISA标本的保存一般来说，再5天内测定的血清标本可放置于4°C，标本再冰箱中保存时间过长会导致血清IgG聚合，是间接法的试剂本底加深，超过一周测定的需-20°C保存，冻结血清溶解后，蛋白质局部浓缩，分不均，应充分混匀并避免产生气泡，浑浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。
ELISA方法详细过程及步骤
ELISA方法详细过程及步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一) 原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二) 操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1. 包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+ ”、“-”号表示。
ELISA方法详细过程及步骤
ELISA方法详细过程及步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immuno sorbn ent Assay)的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一) 原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELI SA间接法。
(二) 操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1. 包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
ELISA方法详细过程及步骤
ELISA方法详细过程及步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一)原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二)操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度) 0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
ELISA原理方法及操作细节
ELISA原理方法及操作细节一、ELISA的原理1.直接ELISA：将抗原直接附着在固相载体上，通过特异性抗体的结合来检测抗原的存在和浓度。
2.间接ELISA：将已知的抗原附着在固相载体上，再加入待测样品，通过特异性抗体和二抗的结合来检测抗体的存在和浓度。
3.夹心ELISA：分别在固相载体上附着抗原和特异性抗体，再加入待测抗原，通过特异性抗体和二抗的结合来检测抗原的存在和浓度。
4.竞争ELISA：将已知抗原和酶标记的抗原竞争与待测抗原中的特异性抗体结合，通过酶标记抗体的含量来反映待测抗原的浓度。
二、ELISA的方法以下以间接ELISA为例进行详细介绍ELISA的方法步骤：1.固相吸附：将已知抗原溶液加入微孔板孔中，使抗原吸附在孔壁上。
然后用PBS或BSA溶液冲洗孔板孔，以去除未结合的抗原。
2.阻断：加入BSA或牛血清蛋白溶液等阻断剂，封闭孔壁上的非特异性结合位点。
3.添加待测样品：加入待检测的抗体样品，经过适当的孵育后，将孔板洗涤，去除未结合的抗体。
4.加入检测抗体：加入与待测抗体特异性结合的二抗，如抗人IgG的辣根过氧化物酶（HRP）二抗，HRP会与抗体特异性结合，形成复合物。
5.反应缓冲液：加入含有HRP底物的反应缓冲液，允许HRP催化底物，产生荧光或颜色反应。
6.反应停止：加入止反应剂，停止酶反应，停止颜色的产生。
7.读取结果：使用酶标仪或光密度计测量各孔中的荧光或颜色的强度，根据强度值的差异来判断样品中抗原或抗体的存在和浓度。
三、ELISA的操作细节1.实验前准备：准备所需试剂、材料和设备，并确保其干净和无菌。
2.微孔板处理：在操作前检查微孔板的孔是否完整，边沿是否正常。
可事先进行热处理或使用已经处理好的微孔板。
3.孔的布置：根据需要设置对照孔和待测孔，每种样品应设置多个孔位，以保证实验的可靠性。
4.液体处理：液体的加入和去除要注意均匀和充分，特别是在液体去除时需要彻底排空。
5.孔板洗涤：洗涤液的选择要注意是否会影响特异性结合和反应的准确性，同时洗涤液的温度和洗涤次数也需要严格控制。
elisa原理、方法及操作细节ppt课件
成本较高
高质量的抗体和酶标仪等设备 的成本较高，限制了其在一些
领域的应用。
2024/1/24
30
技术挑战与发展趋势
提高自动化程度
开发自动化ELISA检测系统，减 少人为操作误差，提高检测效 率。
2024/1/24
发展多重检测技术
在同一反应体系中同时检测多 种目标分子，提高检测通量。
提高特异性
通过改进抗体设计和筛选方法 ，提高抗体的特异性，减少交 叉反应。
优点
适用于检测大分子抗原，如病毒 、细菌等。
缺点
需要针对每种抗原制备特异性抗 体，成本较高。
2024/1/24
9
竞争法
1 2
原理
将特异性抗体与固相抗原竞争结合待检抗原，形 成抗体-抗原复合物，再加入酶标二抗与复合物 结合，最后加入底物显色。
优点
适用于检测小分子抗原或半抗原，如激素、药物 等。
3
缺点
抗原与抗体的特异性结合
免疫记忆
抗原表位与抗体超变区互补，形成稳 定的抗原-抗体复合物。
免疫系统对再次遇到的相同抗原产生 更快、更强的应答。
免疫应答
机体对抗原的识别、应答和清除过程 ，包括细胞免疫和体液免疫。
2024/1/24
4
ELISA技术原理
01
02
03
酶标记抗体/抗原
利用酶的催化作用放大抗 原-抗体结合的信号，提高 检测灵敏度。
2024/1/24
28
优点分析
高灵敏度
ELISA技术能够检测到非 常低浓度的目标分子，
适用于痕量分析。
2024/1/24
特异性
通过使用特定的抗体-抗 原反应，可以实现高特 异性的检测，减少假阳
ELISA原理方法及操作细节
ELISA原理方法及操作细节ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学实验方法，用于定量或定性检测特定抗原或抗体的存在。
ELISA方法简单、灵敏、高效，并且可以在多个领域应用，如医学诊断、药物筛选等。
下面将详细介绍ELISA的原理、方法及操作细节。
一、原理：1.涂布：将待检测的抗原或抗体溶液均匀地涂布在固相载体（如96孔板）上。
2. 靶抗体结合：将Biotin标记的靶抗体加入孔内，与涂布的抗原或抗体特异性结合。
3.洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的物质。
4. 标记物-酶结合：将辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）加入孔内，与靶抗体的生物素标记位点结合。
5.再次洗涤：用洗涤缓冲液洗去未结合的标记物-酶。
6.底物反应：加入底物，酶催化底物发生颜色反应。
7.反应停止：加入反应停止液，停止底物的反应，生成的颜色与待测抗原或抗体的浓度成正比。
8.检测：用酶标仪测定反应产生的颜色强度，根据已知标准曲线得出待测样品中抗原或抗体的浓度。
二、方法及操作细节：1.准备实验材料：包括96孔板、洗涤缓冲液、稀释缓冲液、标准品、抗原或抗体、探针和底物等。
2.板涂布：将待测抗原或抗体溶液加入96孔板中，保持平衡涂布，可以在4℃下过夜或室温下孵育2小时。
3.洗涤：将洗涤缓冲液加入孔内，轻轻振动去除非特异性结合物。
4.添加靶抗体：将靶抗体加入孔内，孵育一定时间，通常为1小时，用稀释缓冲液来稀释靶抗体。
5.再次洗涤：将洗涤缓冲液加入孔内，洗去未结合的靶抗体。
6. 加入标记物-酶：将Streptavidin-HRP加入孔内，与靶抗体的生物素标记位点结合，孵育一定时间。
7. 再次洗涤：将洗涤缓冲液加入孔内，洗去未结合的Streptavidin-HRP。
8.底物反应：将底物加入孔内，酶催化底物发生颜色反应，孵育一定时间。
9.反应停止：加入反应停止液，停止底物的反应，生成的颜色停止变化。
elisa原理及实验操作
3
加酶时污染
4
恒温箱温度过高 整个操作时间过长、造成反应时间不同 （第一孔与最后一孔反应时间相差很 悬殊）。气温高时更明显。
5
6
洗板次数不够
按试剂要求，不可任意减少洗板次数
显色浅，灵敏度低
序号 原因 解决方法 所有组分都应当在4℃冷藏，未使用完的 板条要密封保存。。 过期试剂不可以使用。 严格按照说明书操作。 注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在 37±0.5℃。尽量避免频繁开关恒温箱 门。 经常注意水箱中合适的水位。 在保证水不没过酶标板的前提下，使水位 尽量高，以保证反应温度。 经常校正移液器。注意吸头要与移液器吻 合。移液不宜过快，排放要完全。
间 接 夹 心
将一种种属来源的特异性抗体包被于固相载体上（作为捕 获抗体），封闭，加入待检抗原，温育，洗涤后加入另一种种属来 源的特异性抗体（非酶标，作为检测抗体），最后加入酶标二抗 （特异性识别检测抗体：增加体系特异性）。
竞争抑制 ELISA
直 接 竞 争 抑 制
间 接 竞 争 抑 制
洗涤过程就可以洗掉被竞争下的 酶标抗体，最后加底物显色。最 终显色的结果与待检原（或抗体） 量成反比。 用途：只有一个抗原表位的物质（多肽、小分子物质、小 分子激素等）、乙肝标志物（e抗原不稳定）等。
直接 ELISA
• 亲和纯化的单抗包被在酶标板上，封闭后加入酶标分型二 抗，最后加底物显色即可。 • 这种ELISA中只经过了一步信号放大（酶的放大），所以其 灵敏度不是很高，另外其测定的对象也非常有限，只能测 定酶标记的分子。 • 可用于检测抗原和抗体。
间接 ELISA
间接ELISA 中与包被好的抗原结合的不是酶标抗体，而是非酶 标的，再引入二抗（酶标）与一抗特异性结合，最后加入底物显色 并判读结果。 二抗一般为多抗，一个一抗分子上可以结合多个二抗分子，同 时一个二抗分子上可以标记上多个酶分子，所以当待测抗体为多抗 时（可以由多个一抗分子与抗原结合），信号经过两步放大，提高 灵敏度。 检测抗体的效价、血清的效价、单克隆抗体的筛选以及在临床 诊断中检测标志性抗体。
ELISA原理及步骤
ELISA原理及步骤ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶联免疫吸附法）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的分析技术。
它基于免疫学原理，通过检测特定抗原和抗体的结合来定量测定目标物。
1.直接ELISA的原理及步骤：直接ELISA方法适用于已知抗体，且目标物的抗原性较好的情况。
该方法将特异性的抗原通过硫酸盐或其他方法固定于微孔板上，然后用荧光素标记的抗体与其结合，最后通过测量荧光素的荧光强度来进行定量测定。
步骤：1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。
2）将非特异性结合位点封闭，以防止非特异性结合。
3）加入荧光素标记的抗体，与抗原特异性结合。
4）洗涤净化微孔板以除去未结合的荧光素标记的抗体。
5）加入底物，并进行发光强度测定。
6）测量荧光素的荧光强度，利用标准曲线计算样品中目标物的浓度。
2.间接ELISA的原理及步骤：间接ELISA方法适用于已知抗原，但目标物的抗原性较差的情况。
该方法在抗原固定之后，加入绕行适体素标记的次级抗体，通过该次级抗体与目标物特异性结合，最后通过测量标记抗体的发光强度来进行定量测定。
步骤：1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。
2）将非特异性结合位点封闭，以防止非特异性结合。
3）加入特异性的初级抗体与目标物结合。
4）洗涤净化微孔板以除去未结合的初级抗体。
5）加入绕行适体素标记的次级抗体，使其与初级抗体结合。
6）洗涤净化微孔板以除去未结合的次级抗体。
7）加入底物，并进行发光强度测定。
8）测量标记抗体的发光强度，利用标准曲线计算样品中目标物的浓度。
3.竞争ELISA的原理及步骤：竞争ELISA方法适用于已知抗体和已知抗体与抗原的结合关系的情况。
该方法将标记抗原与固定抗原共同加入到微孔板中，通过测量标记抗原与抗体的竞争情况来进行定量测定。
步骤：1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。
2）将标记抗原共同加入到微孔板中。
ELISA的概念原理操作步骤
ELISA的概念原理操作步骤ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附试验）是一种常用于检测抗原或抗体的高度敏感和特异性的实验技术。
ELISA基于抗原和抗体之间的特异性结合反应，借助酶催化对这种结合反应进行增强，并且可以通过分析底物的酶活性来定量检测分析物的含量。
1.抗原固定：将待测抗原固定在试验板上，可以通过直接吸附或间接固定，例如，在试验板上吸附荧光素偶联的抗体作为捕获抗体，再通过另外的抗原与之结合。
2.阻断：用非特异性蛋白质（如牛血清白蛋白）封闭未吸附的潜在结合位点，以防止干扰物和试剂的非特异吸附。
3.抗体结合：加入试验液中的样品和检测抗体一起加入到试验板中，待检测抗原与固相捕获抗体结合形成复合物，再用洗涤液洗去非特异吸附物。
4.二抗结合：加入与待测抗体免疫球蛋白特异性结合的标记（如HRP酶标记的抗人免疫球蛋白）二抗，形成"抗原-一抗-二抗酶标纯化物"复合物。
5.洗涤：将非特异性吸附的试剂彻底洗净。
6.酶底物反应：加入酶底物（如TMB底物）反应，形成可呈色的产物。
7.酶停止反应：加入酶停止液中的酸，停止酶的活性，颜色转变为黄色。
8.光度计测定：用光度计测定所生成的黄色产物的吸光度，与待检测抗原的浓度成正比关系。
1.准备试验板：选择适宜的试验板（通常为96孔或384孔的微孔板），吸附待测抗原于试验板上，封闭非特异吸附位点。
2.建立标准曲线：将一系列已知浓度的标准物质添加到试验板上，用于后续的定量测定。
3.添加样品和检测抗体：将待测样品添加到试验板中，同时加入检测抗体。
确保足够的洗涤步骤以去除非特异吸附物。
4.添加标记二抗：加入标记的二抗，该二抗对待测抗体免疫球蛋白进行特异性结合。
5.洗涤：将试验板洗涤数次，以去除未与特异抗体结合的非特异抗体。
6.酶底物反应：加入酶底物，观察产生的可呈色产物。
7.酶停止反应：加入酶停止液停止酶底物反应。
elisa 调零 空白孔
elisa 调零空白孔摘要：1.ELISA原理简介2.调零的重要性3.空白孔的作用4.操作步骤及注意事项5.总结正文：ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种广泛应用于生物学研究的实验技术，通过检测抗原与抗体之间的相互作用来分析样品中特定蛋白质或其他生物分子的含量。
在ELISA实验中，正确地进行调零和设置空白孔至关重要，因为这有助于减少实验误差，并获得更可靠的结果。
一、ELISA原理简介ELISA实验主要分为三个步骤：首先，将抗原或抗体固定在聚合物载体（如酶标板）上；其次，将待检测样品中的抗原或抗体与酶标二抗结合；最后，通过底物显色反应，根据颜色深浅判断待测样品中抗原或抗体的含量。
二、调零的重要性调零是指在ELISA实验中，将未添加待测样品的空白孔的吸光度值归零。
这样做的目的是消除实验过程中仪器和试剂本身的吸光度干扰，确保实验数据的准确性。
调零可以通过扣除背景值或使用自动调零功能来实现。
三、空白孔的作用空白孔在ELISA实验中起到对照作用，用于检测实验过程中可能产生的非特异性吸附和试剂本身的吸光度。
空白孔的设置可以消除实验误差，提高检测结果的可靠性。
通常，空白孔中不添加待测样品，但会加入其他试剂，如酶标液、底物液和终止液，以模拟实际实验条件。
四、操作步骤及注意事项1.在进行ELISA实验前，应充分了解实验原理、试剂盒说明书和实验流程，确保实验操作的准确性。
2.正确设置空白孔，按照实验要求加入相应试剂，注意避免试剂污染和交叉反应。
3.在操作过程中，遵循实验顺序，严格控制每步操作的时间和温度，确保实验条件的一致性。
4.检测空白孔的吸光度值时，应选用合适的波长和光程，以减少误差。
5.分析实验结果时，应将空白孔的吸光度值进行校正，以消除非特异性吸附和试剂本身的影响。
五、总结在ELISA实验中，正确进行调零和设置空白孔是获得可靠实验结果的关键。
通过消除实验过程中的干扰因素，我们可以更准确地检测待测样品中的目标分子含量，为生物学研究提供有力支持。
ELISA 原理、方法及操作细节.
包被物
针对IgM的第二抗体
待测物 其中含有IgM和IgG
IgG等无关物质
被洗脱
特异性抗原与IgM结合
酶标抗体
具体步骤
包被 封闭 加待测物 加一抗，二抗 ，或抗原等 显色
包被
用包被液稀释包被抗体至合适浓度，包被酶 联板（聚乙烯微量反应板），每孔100μ。
用保鲜膜包好 ，4℃过夜。
如急用，包被2h后，清洗也可用，但最好 过夜。
封闭液
10 % 小牛血清 （1ml小牛血清加到9ml 1×PBS中混匀）。
5%脱脂奶粉（用洗液稀释）
加标准样及样品
待测样或标准一抗：
用PBST洗液进行稀释到适合浓度，每孔 100μl，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器 上孵育2小时。清洗。
二抗：
用PBST洗液进行稀释到适合浓度，每孔 100μl，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器 上孵育1小时。清洗。
ELISA 就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反 应相结合而建立的一种新技术。
该技术应用非常广泛，几乎所有的可溶性抗原-抗 体系统均可用以检测。
酶和抗体或抗原结合后，既不改变抗体与抗原 免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学 活性，即在相应而合适的作用底物参与下，使 基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型 变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼、 光学显微镜和电子显微镜观察，也可用分光光 度计加以测定。呈色反应显示了酶的存在，从 而证明发生了相应的免疫反应。
所有血清学试验要注意
为了达到定量检测的目的，所用的检测试剂 中必须至少有一个试剂是可检测的纯品 必须有一种分离方法使得结合的标记物与没 有结合、游离的成分分开，这样才能测定特异 性结合的百分比。
谢谢大家！
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包被物
针对IgM的第二抗体 待测物 其中含有IgM和IgG
IgG等无关物质 被洗脱 特异性抗原与IgM结合
酶标抗体
具 体 步 骤
包被
封闭
加待测物
加一抗，二抗 ，或抗原等
显色
包
被
用包被液稀释包被抗体至合适浓度，包被酶 联板（聚乙烯微量反应板），每孔100μ。
用保鲜膜包好 ，4℃过夜。
应
用
ELISA 法由于测定灵敏、特异、操作简便、 酶标记试剂比较稳定、易于自动化、无反 射性污染，且易与其他相关技术偶联，使 其成为目前应用最广泛而且发展最快的一 种免疫测定技术。市场上符合质量要求的 商品试剂盒（提供有包装好的固相载体、 酶标记物及其底物和洗涤液等全套试剂成 分）和自动或半自动检测仪不断研究发明 问世，极大地促进了ELISA测定技术的普及。
加蒸馏水至1000ml
PBST 洗 液
2000ml PBS PBS： NaCl 8g ； KCl 0.2g ； Na2HPO4 1.42g；KH2PO4 0.27g； + 1ml Tween-20
加1000ml蒸馏水定容，调PH至7.4
洗板机
封
闭
用封闭液封闭，每孔100μ。
室温下，在微量振荡器上，封闭2h。
显色液
A液：0.2mol ／L Na2HPO4
Na2HPO4· 12H2O 71.7g加水至1000ml
B液：0.1 mol ／L 柠檬酸 柠檬酸 19.2g 柠檬酸，加水至1000ml
结 果 判 定
酶标测定仪检测（429nm），
测定OD值：
待测孔（P）与对照孔（N）的比值（P： N）大于1.5或2者为阳性 注意：要有阴性，阳性对照。
应相结合而建立的一种新技术。
该技术应用非常广泛，几乎所有的可溶性抗原-抗
体系统均可用以检测。
酶和抗体或抗原结合后，既不改变抗体与抗原 免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学 活性，即在相应而合适的作用底物参与下，使 基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型 变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼、 光学显微镜和电子显微镜观察，也可用分光光 度计加以测定。呈色反应显示了酶的存在，从 而证明发生了相应的免疫反应。 所以，这是一种特异而敏感的技术，可以在细 胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位， 或在微克，甚至纳米水平上对其进行定量。
1，双抗体夹心法： 此法常用于检测抗原
它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B 分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结 合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物， 复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非 竞争性反应类型。
包被物
抗体A
待测抗原
酶标抗体
2，间接法测定抗体 此法常用于测定抗体
将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与 抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待 测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量 与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。
包被物
限量的的抗体 酶标抗原 样品抗原
酶标多于样品
样品多于酶标 显色程度浅
显色程度深
显色程度与待测物含量成反比
4，捕获法（反向间接法） 主要用于测定血清中某种抗体亚成分
以目前最常用的IgM测定为例，因血清中针对某 种抗原的特异性IgM和IgG同时存在，而后者可 干扰IgM的测定。因此，先针对IgM的第二抗体 (如羊抗人IgMμ链抗体）连接于固相载体，用以 “捕获”样品中所有IgM；洗涤除去IgG等无关 物质，然后加入特异性抗原与待测IgM结合；再 次加入抗原特异的酶标抗体；最后形成固相二 抗-IgM-抗原-酶标抗体复合物，加酶底物显色后， 即可对待IgM进行定性和定量测定。
用PBST洗液进行稀释到适合浓度，每孔 100μl，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器 上孵育1小时。清洗。
注 意
抗体抗原反应比较快，一般1~2个小时就 达到峰值。延长反应时间容易出现非特异 结合，但反应时间不能少于1.5小时。 二抗的使用浓度（一般，1：10000稀释） 应当进行预实验确定，二抗的反应时间不 能过长，容易出现非特异反应。一般，反 应40~60分即可。
包被物
抗 原 待测抗体 酶标二抗
3，竞 争 法 此法既可用于检测抗原和半抗原， 也可以用于检测抗体
用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原 （抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体 （抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形 成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就 少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程 度与待测物含量成反比。
如急用，包被2h后，清洗也可用，但最好 过夜。 次日弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。
用PBST洗液，洗4~5次。
每次在洗板机清洗酶联板上震荡2~3min后， 在面巾纸上拍干后进行下一次清洗或下一步。
包被液
0.05M PH 9.6 磷酸盐缓冲液
Na2CO3 1.59 g ；
NaHCO3 2.93g ；
基 本 原 理
先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上， 并保持其免疫活性。
测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步 骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。 用洗涤的方法分离抗原-抗体复合物和游离成分。
然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定 量。
方 法 类 型
酶联免疫吸附试验的主要技术类 型有双抗体夹心法、间接法、竞 争法、捕获法等。
OPD
显
色
临用前取A液5.14ml，B液 4.86ml加入 OPD (邻苯二胺，在-20℃中保存） 0.0040g（约4小片），溶解后加入50μl的 30%H2O2，配成显色液。（OPD要充分混 匀，否则容易出现个别孔颜色太深）
显色液每孔100μl。避光显色15~20min。 用2mol／L H2SO4终止反应，每孔50μl
ELISA
酶联免疫吸附试验
主讲人：刘 畅 研究生
导 师：马学恩 教 授
ELISA （酶联免疫吸附试验）
Enzymes linked immunosorbent assay
简
试验。
介
1971年，瑞典学者Engvail和Perlmann、荷兰学者 Van Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中 微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附 ELISA 就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反
弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。 用PBST洗液，洗4~5次。（同包被）
用保鲜膜包好，4℃可保存一个月。
封闭液
10 % 小牛血清 （1ml小牛血清加到9ml 1×PBS中混匀）。 5品
待测样或标准一抗： 用PBST洗液进行稀释到适合浓度，每孔 100μl，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器 上孵育2小时。清洗。 二抗：
所有血清学试验要注意
为了达到定量检测的目的，所用的检测试剂 中必须至少有一个试剂是可检测的纯品
必须有一种分离方法使得结合的标记物与没 有结合、游离的成分分开，这样才能测定特异 性结合的百分比。
谢谢大家！