重组体的筛选和鉴定
重组体的筛选方法
重组体的筛选方法重组体是一种重要的生物技术手段，它可以用于改良微生物、植物和动物的基因组，从而实现对目标基因的精准编辑和调控。
在进行重组体的筛选过程中，选择合适的筛选方法对于提高筛选效率和准确性具有重要意义。
本文将介绍几种常见的重组体筛选方法，帮助读者更好地理解和应用这一技术。
1. 抗生素筛选法。
抗生素筛选法是重组体筛选中最常用的方法之一。
通过将目标基因与抗生素抗性基因连接在一起，然后转化至宿主细胞中，能够通过对抗生素的耐受性来筛选出含有目标基因的重组体细胞。
这种方法简单易行，且操作方便，适用于微生物和植物等生物体的筛选。
2. 标记基因筛选法。
标记基因筛选法是利用标记基因与目标基因共转化至宿主细胞中，通过标记基因的表达情况来筛选出含有目标基因的重组体细胞。
常用的标记基因包括荧光标记基因、抗性标记基因等，通过检测标记基因的表达情况，可以快速准确地筛选出目标基因的重组体细胞。
3. PCR筛选法。
PCR筛选法是利用聚合酶链式反应（PCR）技术来筛选重组体。
通过设计特定的引物，可以扩增出含有目标基因的DNA片段，从而实现对重组体的筛选。
PCR筛选法具有高灵敏度和高特异性的优点，能够准确地检测出目标基因的存在，是一种常用的重组体筛选方法。
4. 免疫筛选法。
免疫筛选法是利用抗体对目标蛋白的特异性识别来筛选重组体。
通过将目标蛋白与标记蛋白连接在一起，然后转化至宿主细胞中，利用抗体对标记蛋白的特异性识别来筛选出含有目标蛋白的重组体细胞。
这种方法对于筛选蛋白重组体具有重要意义，能够快速准确地筛选出目标蛋白的重组体细胞。
5. 酶标记筛选法。
酶标记筛选法是利用酶标记技术来筛选重组体。
通过将目标基因与酶标记基因连接在一起，然后转化至宿主细胞中，利用酶标记基因的表达情况来筛选出含有目标基因的重组体细胞。
这种方法操作简便，能够快速准确地筛选出目标基因的重组体细胞。
总结。
重组体的筛选方法多种多样，每种方法都有其特点和适用范围。
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
基因工程重组体克隆的筛选和鉴定
基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组 等技术构建大规模突变体 库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有 特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突 变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察 生物体表型变化，以确定该基因的功 能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定 基因的表达，观察生物体表型变化， 以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突 变体，鉴定突变基因，以研究该基因 的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比 对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子 进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否 含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上， 培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳 性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显 色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等 方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除， 观察生物体表型变化，以确定该基因 的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测 特异的RNA转录本。
第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定第一节转化基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。
只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。
在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。
一、重组DNA分子转入原核生物细胞1. 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化（transformation）——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。
（1）CaCl2处理后的细菌转化或转染A、制备感受态细胞受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的 CaCl2（50～100 mmol／L）溶液处理后变成。
所谓感受态细胞，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源 DNA的能力。
转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程；转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程；好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。
B、细胞转化（或转染）的具体操作过程：①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分，回收细菌细胞；②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟，离心回收细胞，再用适量0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，以诱导感受态产生。
③加入适量DNA，于42 ℃热处理混合物90秒，使DNA分子被细胞吸收；④将混合物快速转到冰浴中，冷却1~2分，加入适当的培养基，在37 ℃培养45分，使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因；⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。
⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。
（2）电穿孔转化法基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。
基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
重组体筛选的方法
重组体筛选的方法
重组体筛选是一种用于寻找具有特定性质或功能的重组分子的方法。
下面列举了一些常用的重组体筛选方法：
1. 亲和筛选（Affinity screening）：利用目标蛋白与重组体之间的亲和力进行筛选。
可以通过将目标蛋白固定在固相材料上，然后将重组体溶液注入固相材料中，通过洗脱和分离来筛选出与目标蛋白相互作用的重组体。
2. 循环进化（Directed evolution）：采用类似于自然进化的方法，通过连续的基因突变和筛选来改进重组体的性能。
通常使用基因库构建、突变（例如误配PCR、DNA shuffling等）和活性筛选（例如细胞表面显示、酶活性测定等）等方法。
3. 细胞表面显示（Cell surface display）：利用细菌或酵母等微生物表面展示重组体，并通过流式细胞术（FACS）等方法筛选出具有目标性质的重组体。
4. 体外显示（In vitro display）：重组体通过与其DNA或RNA编码的蛋白质、磷酸盐结合或共价耦合，以形成重组体-核酸复合物。
然后通过结合亲和柱或筛选酶活性等方法对重组体进行筛选。
5. 亲和柱筛选（Column chromatography screening）：利用亲和柱固定目标蛋白，然后通过洗脱和分离来筛选具有亲和性的重组体。
6. 生物传感器筛选（Biosensor screening）：利用生物传感器的敏感性和选择性来筛选具有目标性质的重组体。
常见的生物传感器包括表面等离子体共振（SPR）传感器和电化学传感器等。
上述方法可能结合使用，根据具体的研究目标和条件来选择最合适的筛选方法。
重组体的筛选方法
重组体的筛选方法1、重组体的基本筛选概念重组体（recombinant）指从不同生物系统中获取的非天然表达载体，以用于表达特定蛋白质或DNA片段，通常为了检测某种生物活性，以改良生物机理或更改特定特性。
重组体的筛选是对重组体表达的非天然蛋白质进行筛选的过程，可以用来鉴定新的蛋白质、表达具有特定生物活性的蛋白质，或确定新的重组体表达载体。
表达系统筛选通常包括利用基因工程技术在指定载体上表达特定基因编码片段，然后使用分子生物学、免疫学和生物化学方法进行在细胞水平或分子水平上进行分析和筛选，以鉴定具有特定生物活性的重组体表达系统。
2、方法（1）载体筛选。
在大多数重组体表达系统中，筛选的首要任务是识别具有最佳表达能力的载体，其中也可能涉及到大量的载体类型。
可以分别从细胞系、染色体、质粒、全基因组、融合蛋白等不同类型的载体中选择重组体。
有些载体可能会更有效地表达特定基因，而有些可能会产生低产蛋白，因此需要进行大量的筛选才能有效地识别最佳的表达系统载体。
（2）表达率筛选。
在细胞中表达的蛋白质必须具有最大的表达量才能产生最佳的活性，因此对重组蛋白质的表达量非常重要。
在大多数情况下，使用多种不同的表达系统技术来评估重组体表达质量，例如利用Western和Northern blotting、Immunoprecipitation、活性测定和流式细胞术等技术。
（3）特异性筛选。
在获得足够数量的蛋白质之后，必须进一步确定表达体的特异性，特异性不仅取决于重组蛋白质可以被正确表达和结构功能完整，而且应该是特异性，以使其产生预期的生物活性。
因而，重组体的筛选过程还必须包括一项评估表达蛋白质的特异性的步骤，释放的生物活性水平是最重要的特征，在此筛选步骤中，可以使用酶抑制试验、衍生物筛选、细胞学剂量响应性试验或免疫学、化学、物理学方法来评估重组表达体的活性。
3、结论重组体表达是一种实用技术，它旨在确定特定生物学活性的最佳表达系统，以获得有价值的蛋白质或未知活性的分子。
重组克隆的筛选与鉴定
4、 选择得过程
(1)四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA,导致四环素 抗性基因失活,可用四环素﹢环丝氨酸 得平板,选择重组克隆。
Tetr插入失活得细菌,其生长可被四环素 抑制,不被环丝氨酸杀死,保留下来;
Tetr不失活得细菌,能抗四环素,正常生长, 但可被环丝氨酸杀死。
图 四环素抗性插入失活
二、利用抗生素抗性基因:pBR322
以pBR322为例,说明利用抗生素抗性基因得插 入失活得原理。
1、 原理
在pBR322上有多个单一得限制酶位点,如 BamH I位点,恰好在一个四环素抗性基因内。 如果有外源DNA插入BamH I位点,那么涉及 四环素抗性得基因就损坏,因此,带有重组 pBR322质粒得细胞,仍对氨苄青霉素有抗性, 但对四环素得抗性消失(敏感)。
pUC18/19得结构图
氨苄青霉素抗性基因 Lac Z基因:编码-半乳糖苷酶得部分肽
段。 Lac Z上有插入外源DNA得MCS位点。
4、 筛选得方法:蓝白斑法
利用蓝白斑法筛选pUC8/9重组子,就是 一种直接检测-半乳糖苷酶活性得方法。
①先将转化子涂于含有氨苄青霉素得培 养基,能合成-半乳糖苷酶。
该技术已广泛应用于基因得表达、基因 定位、克隆基因得筛选、酶切图谱得制
作、基因组中特定基因序列检测、遗传 病疾病得诊断及生物分类等方面。
一、核酸分子杂交得基础
1、 变性与退火 DNA以双链形式存在,在进行分子杂交
时,先将双链DNA分子解聚为单链,这一 过程称为变性。
两条单链通过碱基互补,聚合成稳定得 双链区得过程称为退火或复性。
图 表型筛选加酶切筛选
０
A
A
T T
TA AT
实验17-重组体筛选与鉴定
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
液。
6.感受态细胞分装成200μl的小份,暂且不用的贮存于-70℃可
保存半年。 取其中一份进行转化。
7. 向转化管中加入DNA（不超过10ul）,轻度摇晃混合后于冰上
放置30分钟。
8. 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90秒
(不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却1－2分钟。
重组体筛选与鉴定
重组质粒的转化
转化（transformation)：
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞 获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研 究领域的基本实验技术。
转化方法
1、化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl） 制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA 分子导入受体细胞；
不同抗生素基因筛选 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉 素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在 选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化 体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如 果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基 平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确 认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含 有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上 生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不 能确定哪个克隆含有插入片段。
受体菌：his外源基因：his+
16-重组体的筛选和鉴定
高度灵敏性 不影响碱基配对 不影响探针分子的主要理化特性 使用酶促方法时,不影响酶活性 检测方法的灵敏性和特异性高 化学稳定性高 操作的安全性
标记方法
内标记
切口平移法 随机引物法 单链DNA探针 cRNA探针标记
末端标记
切口平移法：dsDNA，掺入率高，最常用
37℃ 15min 限速步骤 37℃ 2～3h
含有完整标记基因的λ-载体进入受体细胞后， 建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；
当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活， λ-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。
①筛选植物细胞报告基因（reporter gene)：NPTⅡ, HPT, LUC 报告基因：是某种生物的特定基因，装配在载体上成为载体结 构的一部分，具有指示的功能；常与目的基因融合表达，以示 踪目的基因的表达和位置。
•以tk－为受体，载体中加入tk基因， •HAT选择培养基中tk+细胞成活，tk-细胞不能成活 •则阳性重组子可在HAT中成活。
1、快速裂解菌落直接电泳检测法
原理：有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分 子量大。
方法：从转化后的菌体克隆中分 离质粒，电泳、比较其分子量。
凝胶电泳分离：质粒DNA的电 泳迁移率与其相对分子质量大 小成反比。
4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷 类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。
抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。
77
重组质粒DNA携带抗药性基因，转化后受体菌在含有相应抗生 素的培养基上生长，而不含此载体DNA的受体菌不能存活。 88
重组体的筛选方法
重组体的筛选方法重组体是指通过DNA技术将来自不同来源的DNA片段重组而构建的新的DNA 分子。
重组体技术被广泛应用于基因工程、遗传学研究和生产实践中。
重组体的筛选是确保所需目标DNA片段被正确重组的关键步骤。
以下是几种常用的重组体筛选方法。
1. 纤维素酶切筛选法纤维素酶切筛选法是一种原理简单、操作方便的筛选方法。
通过将重组体与纤维素酶一起处理，纤维素酶能够选择性地降解未重组的DNA片段，而保留重组体。
重组体可通过琼脂糖凝胶电泳分离，然后使用DNA杂交技术来确认重组体的存在。
2. 改性PCR筛选法PCR（聚合酶链式反应）是一种能够在体外扩增特定DNA片段的技术。
在重组体筛选中，可以通过设计特定引物，使得PCR只能扩增包含目标DNA片段的重组体，而无法扩增未重组的DNA片段。
PCR扩增后，可以使用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，确认是否存在所需目标DNA片段。
3. 限制性内切酶和DNA连接酶筛选法限制性内切酶是能够识别特定DNA序列并在特定位置切割DNA链的酶。
在重组体筛选中，如果所需目标DNA片段被正确重组，限制性内切酶将无法切割形成的DNA链，而能够切割未重组的DNA片段。
通过对重组体和未重组DNA使用相应的限制性内切酶进行酶切反应，可以通过琼脂糖凝胶电泳分离并观察DNA片段的断裂情况，确定重组体的存在。
4. 荧光标记筛选法荧光标记筛选法利用荧光染料标记目标DNA片段，通过荧光检测的方式进行筛选。
一种常用的方法是将重组体的目标DNA片段与荧光基团结合，形成荧光标记的重组体。
然后，通过荧光检测技术，如荧光凝胶电泳、荧光显微镜观察等，可以检测到荧光信号，确认重组体的存在。
此外，还有其他一些筛选方法，如互补性DNA杂交、DNA测序、南方印迹、北方印迹等，可以根据具体实验需要选择合适的方法进行重组体的筛选。
总结起来，重组体的筛选方法多种多样，可以根据实验的目的和具体条件选择适合的方法。
需要注意的是，在筛选过程中，实验者需要仔细操作，严格控制实验条件，以确保筛选结果的准确性和可靠性。
第七章 重组体克隆的筛选和鉴定
第一节 利用遗传标记的表型特征筛选
利用载体上的携带的选择性标记基因筛选转化子或重组子
一、抗药性筛选法 1. 原理： 原理： 载体上携带有受体细胞敏感的抗生素抗性 基因。
质粒上有两个抗菌素性基因: 如：pBR322质粒上有两个抗菌素性基因 质粒上有两个抗菌素性基因 Tetr和Ampr。
选择过程： 3. 选择过程： （1）四环素抗性插入失活 ） 如果在Tet 上插入外源DNA，导致四 如果在 r上插入外源 ， 环素抗性基因失活，可用四环素加环 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 平板培养基选择重组克隆 Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 失活的菌生长被四环素抑制， 丝氨酸杀死，保留下来； 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。 反而被环丝氨酸杀死。
最好用单克隆抗体（ 最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）。 ）。
blotting） 四、免疫印迹（western blotting）法 免疫印迹（ 在蛋白质凝胶电泳以后， 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方 法检测胶上的蛋白质泳带。 法检测胶上的蛋白质泳带。 1.原理： 1.原理： 原理 （1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 ） 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）： ）： ① SDS: 是蛋白质的变性剂， 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的 蛋白质维持线性状态， 蛋白质维持线性状态，并与蛋白质 结合，使蛋白质带上负电荷。 结合，使蛋白质带上负电荷。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
基因工程-第8章-重组子的筛选与鉴定
2、根据插入序列的表型特征选择重
组体分子的直接选择法
转化进来的外源DNA编码的基因，能够 对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变体发 生体内抑制或互补效应，从而使被转化 的寄主细胞表现出外源基因编码的表型 特征。
Example:
λ gt.λ B噬菌体（由于C片断的缺失而造成重 组缺陷的λ red－噬菌体），在大肠杆菌lig ts菌株上生长不能形成噬菌斑，在有连接酶功 能的大肠杆菌lig＋菌株上形成噬菌斑。 将具有连接酶基因的重组体噬菌体λ gt. λ B，涂布在大肠杆菌lig ts菌株上时，通过 寄主细胞的互补作用，能够形成噬菌斑。根据 形成噬菌斑这种表型特征，直接选择具野生功 能的重组体噬菌体。
缺点： 不单要求克隆的DNA片断必须大到足 以包含一个完整的基因，而且还要求所 编码的基因能够在大肠杆菌中实现功能 表达。 （对于真核基因很难达到要求）
二、物理检测法
1、凝胶电泳检测法 从宿主细胞中提取重组子分子，利用凝胶 电泳的方法，鉴定外源片断是否插入及其 长度。 优点：简便、快速。 缺点：只能提供克隆片段大小的信息。
抗药性标记插入失活
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r
Tcr
转化
Amp r Tc s
外源DNA
Amp r பைடு நூலகம்cr
无菌落 筛选重组子 阳性菌落
Amp r Tc s
提取DNA 电泳
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
Amp r Tc s
重组DNA
（2）β-半乳糖苷酶显色反应选择法
外源DNA 有DNA插入
Apr
转化
Ap r
Ap r
筛选重组子 白色菌落
重组体的筛选和鉴定
二、利用插入序列提供的表型特征筛选
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。 一、原理： 1.弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。 受体菌： his外源基因： his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
GFP 老鼠
GFP- Kac的狗
GFP Alba 發青綠光 芒的 兔子
①新霉素磷酸转移酶基因（NPTⅡ）抗新霉素、卡 那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动 植物转化子的选择标记基因。 ②潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）赋予转化子能抗 潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物 转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。 ③氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）也被用于筛选动 植物转化子的标记基因。
PstI酶切
外源DNA 黏性末端 连接酶 PstI酶切
pBR322 4363
重组子(ampstetr) 空载体(amprtetr) 插入子(ampstets)
导 入
黏性末端
重组子转化子(ampstetr) 空载体转化子(amprtetr)
影印在含Ap的平板上
涂布在含Tc的平板上
野生型的E.coli (ampstets)
缺点：需要电镜！
2. Northern blotting
用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。 主要检测插入片 断是否被转录。 从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
Northern Blotting
Western Blotting
Southern和Western印迹法
32P-labled
重组体的筛选
合成某一aa的基因 连接
酶切
重组
转化 缺少该aa合成 酶基因的菌株
载体
重组子
生长、获得
筛选
只缺少该aa的 基本培养基
二、核酸分子的物理检测法
原理： 碱基配对
杂交双方： 待测的核酸序列 插入片段基因制备的DNA或RNA探针
核酸杂交方法：
菌落印迹原位（in situ）杂交
斑点（dot）印迹杂交
Southern印迹杂交
实验原理与步骤
提取
点样
加热
RNA或DNA
变性
NC膜
碱溶液
放射性探针
固定
杂交
X-底片
放射自显影
一定条件
显影、定影
标记斑点
检测
3、Southern 印迹杂交
★1975年，英国Southern创建 ★ DNA与DNA的杂交，即将DNA电泳、 转印到固相支持物上，用探针进行检测的 方法。
限制性酶切割
第一节 核酸分子的遗传学与物理检测法 一、遗传学检测法
1、根据载体表型特征的筛选
（1）抗药性标记插入失活筛选法
Kan
克 隆
抗 性 基 因
（2）β -半乳糖苷酶显色反应筛选法
蓝 白 菌 落
蓝白菌落
筛选白色菌落
2、根据插入基因遗传性状的筛选
重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞 之后，如果插入在载体分子上的外源基因能够 实现其功能性的表达，而且表达的产物能与大 肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补，那么就 可以利用营养突变株进行筛选。
限制片段
DNA分子
琼脂糖电泳
带有DNA片段的凝胶
实 验
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
重组子的筛选与鉴定
一、遗传学检测法
无环丝氨酸培养基
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程 （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基
因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 （2） 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有终止密码子；
（不破坏 肽）。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。
（只在特定条件下）。 1.原理 （1）弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型
缺陷。
受体菌： his
-
外源基因： his
+
阳性克隆才能在不 含组氨酸的培养基 中生长
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 1.原理
（2）增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例：小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二
优点：简便、快速，结果较可靠。
缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。 （一） 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法
1. 抗药性标记插入失活选择法 2. β-半乳糖苷酶显色反应选择法 （二）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所 具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表 现出外源基因编码的表型特征。
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转入萤火虫 的luciferase 的烟草
GFP- Kac的狗
GFP 老鼠
GFP Alba 發青綠光 芒的 兔子
①新霉素磷酸转移酶基因（NPTⅡ）抗新霉素、
卡那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选 动植物转化子的选择标记基因。
外源DNA
PstI酶切
黏性末端
pBR322 4363
PstI酶切 黏性末端
连接酶 重组子(ampstetr) 空载体(amprtetr) 插入子(ampstets)
导 入
重组子转化子(ampstetr) 空载体转化子(amprtetr)
涂布在含Tc的平板上
野生型的E.coli (ampstets)
影印在含Ap的平板上 空载体转化子(amprtetr)
（3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
质4-甲基伞形花酮，以此筛选含GUS基因的转化
子。 由于植物细胞GUS本底非常低，因此广泛地应用
于筛选植物转化子。
尤其是GUS基因的3’端与其他结构基因连接产生
的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍 有GUS活性，可用于外源基因在转化生物体中的 定位分析。
⑤萤火虫荧光素酶基因（LUC）
LUC表达产物萤火虫荧光素酶（LUC）在Mg2+的
重点：
常用的抗菌素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶联免 疫吸附测定（ELISA）
难点：
免疫印迹（Western Blotting）法的原理
转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。 非转化子：未接纳载体或重组分子的转化细胞。 重组子：含有重组DNA分子的转化子。 非重组子：仅含有空载载体分子的转化子。 期望重组子：含有目的基因的重组子。 非期望重组子：不含有目的基因的重组子。
筛选植物转化细胞常用的报告基因
报告基因（reporter gene）：系指其编码产物能 够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经 成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表 达活性的一类特殊用途的基因。
报道基因（reporter gene)
（1）大肠杆菌的β-D-葡萄糖苷酸酶 （β-D-glucuronidase，GUS）；
作用下，可以与荧光素和ATP底物发生反应，形 成与酶结合的腺苷酸荧光素酰化复合物，经过氧 化脱羧作用后，该复合物转变成为处于激活状态 的氧化荧光素，可以用荧光测定仪快速灵敏地检 测出产生的荧光，是目前研究动植物转基因很好 用的一种报告基因。
Luc基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不 存在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所 造成的危害，也没有内源荧光产生的背景干扰， 因此，Luc是一种理想的报告基因。
选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有 中止密码；（不破坏肽）。
β-半乳糖苷酶显色反应筛选法
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
蓝白菌落
筛选白色菌落
3.噬菌斑筛选法
噬菌斑(plaque)
噬菌斑是指在 宿主细菌的菌 苔上，噬菌体 使菌体裂解而 形成的空斑。
4.载体提供选择动植物转化细胞常用的标记基因
（2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）；
（3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。
（4）其它
几种报道基因的作用原理
紫外光照
GFP
发绿色荧光
4-甲-β-D-葡萄糖苷酸 GUS 荧光产物
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸 GUS
8.1 遗传学检测法
一、利用载体提供的表型特征筛选重组体
1 抗药性标记及其插入失活选择法
原理： pBR322质粒上有两个抗生素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
因插入外源DNA而导致基因失活的现象称之为插入失活效应。
对比两个平板上的菌落，凡在Tc平板上生长而在Ap平板上不能生长的菌落则是 重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。
pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素抗性基因 Tetr ： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因 Ampr ： 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为 青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KIAampicillin）（蓝灰色）褪色。
②潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）赋予转化子能
抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植 物转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。
③氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）也被用于筛选
动植物转化子的标记基因。
④β-葡萄糖酸酶基因（GUS）
GUS的基因产物β-葡萄糖酸酶（GUS）能够催化
4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，产生荧光物
无环丝氨酸培养基
氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
2.蓝白斑筛选法
乳糖 Xgal
-半乳糖苷酶
原理：
半乳糖 半乳糖
+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因 组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
8 重组体的筛选和鉴定
筛选（Screening） 遗传表型（phenotype）：是生物体遗传组成同环境 相互作用所产生的外观或其他特征。
本章教学目的和要求：
掌握常用的抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶 联免疫吸附测定（ELISA）和免疫印迹（Western blotting）法的原理；了解转译筛选法和真核生物的报道 基因筛选法。