SYBRGreen实时定量PCR检测转基因大豆中外源基因拷贝数
实验三 PCR-荧光探针法鉴定转基因大豆
实时荧光定量PCR Quantitative Real-Time PCR
（一）Real-time qPCR原理
实时定量PCR原理
• 实时定量PCR技术（real-time quantitative PCR） 是指在PCR反应体系中加入荧光染料，实时监测 荧光染料 整个PCR过程中荧光信号的累积强度，并利用特定 数学原理对未知模板进行定量分析的方法。
基因组DNA分离纯化中的注意事项
保证基因组DNA的完整性和纯度 提高DNA的洗脱效率 DNA的储存
（二）转基因大豆鉴定 — CaMV35S基因核酸检测试剂盒杂交试剂盒
• 采用实时荧光PCR技术，针对CaMV35S基因核 酸序列设计特异性引物和荧光探针，通过实 时荧光PCR（Taqman探针法）对转基因成分 CaMV35S基因进行检测。
特异性高 多重PCR检出
要求反应的特异性 不能进行多重PCR
Probe设计要求高 Probe合成费用高
常用于mRNA表达量分析等
常用于SNP解析，病毒、病原菌检测
（三）Real-Time qPCR主要概念
非探针 扩增曲线
化学原理
实时定量PCR
两个重要图形
探针
熔解曲线
Real-Time qPCR曲线的意义
106 105 104 103 102 10
荧光强度---循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
三、实验内容
• 大豆DNA提取 • PCR-荧光探针法检测CaMV35S基因
四、实验材料和用品
大豆 大豆DNA提取试剂盒 CaMV35S基因核酸检测试剂盒 仪器：荧光定量PCR仪 台式离心机等
DePure Plant DNA Kit 基于硅胶 柱纯化方式。样品经液氮或研磨仪匀 浆后，在裂解液中裂解，DNA 释放到 裂解液中。经高盐溶液沉淀去除多糖 等杂质后，加入乙醇，转移至柱子中 过滤，DNA 被吸附到柱子的膜上，而 蛋白质则不被吸附而去除。柱子经 Buffer GW2 洗涤去除盐分，最后 DNA 经 Buffer AE洗脱。
SYBRGreen实时定量PCR检测转基因大豆中外源基因拷贝数
SYBRGreen实时定量PCR检测转基因大豆中外源基因拷贝数的影响[J].土壤,2004,36(1):56-60.[31]彭诚.土壤施硒对白菜和堇叶碎米荠生理指标的影响[J].湖北民族学院学报,2007,25(1):88-90.[32]院金渴,王朴,刘正兴,等.土壤施硒对大蒜生理特性、含硒量及产量的影响[J].新疆农业大学学报,2010,33(1):19-22.[33]周大寨,唐巧玉,陈建英,等.土壤施硒对花椰菜硒质量分数及主要营养成分的影响[J].湖北民族学院学报,2005,23(2):121-123.[34]冶军,单维东,褚贵新.叶面喷施硒肥对大豆产量和质量效应的初步研究[J].新疆农业科学,2009,46(3):506-509.[35]郁飞燕,寇太记,张联合,等.硒对植物生理功能影响的研究进展[J].安徽农业科学,2008,36(26):11202-11204.[36]邵志慧,林匡飞,徐小清,等.硒对小麦和水稻种子萌发的生态毒理效应的比较研究[J].生态学杂志,2005,24(12):1440-1443.[37] 贾宏昉,宋家永,王海红,等.硒对作物生理、生长发育及产量、品质的影响研究进展[J].河南农业大学学报,2006,40(4):449-454.[38]苏爱国,陈大清,李亚男.植物硫转运蛋白及其硒盐胁迫响应研究进展[J].长江大学学报,2008,5(1):70-73.[39]王晋民,赵之重,沈增基.叶面施硒对青花菜含硒量及产量与品质的影响[J].西北农林科技大学学报,2006,34(3):127-130.[40]Wang H L,Zhang J S,Yu H Q.Elemental selenium at nano sizepossesses lower toxicity without compromising the fundamental effect on selenoenzymes:Comparison with selenomethionine in mice[J].Free Radical Biology and Medicine,2007,42:1524-1533.[41]Huang B,Zhang J S,Ho J W,et al.Free radical scavengingefficiency of nano-se in vitro [J].Free Radical Biology andMedi-cine,2003,35(7):805-813.[42]周毅峰,吴永尧,唐巧玉.硒对大豆叶片谷肤甘肤过氧化物酶和过氧化氢酶歧化酶活的影响[J].湖北民族学院学报,2005,23(2):127-129.SYBR Green 实时定量PCR 检测转基因大豆中外源基因拷贝数冀志庚，高学军*，敖金霞，张明辉，霍楠（东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，哈尔滨150030）摘要：采用SYBR Green Ιreal-time PCR 方法检测转基因大豆中外源基因35S 边界基因的拷贝数，以大豆凝集素基因（Lectin ）作为内参照基因，以转基因大豆基因组DNA 为内参照基因标准品，初始浓度为0.43μg ·μL -1，进行5倍梯度稀释得到内参照基因C T 值与起始模板量的相关性标准曲线：y =-2.9915x +22.3321，R 2=0.996；以含35S 边界序列的质粒DNA 为目的基因为标准品，初始浓度为0.64μg ·μL -1，同样进行5倍梯度稀释，建立目的基因C T与起始模板量的相关性标准曲线：y =-3.4021x +17.7219，R 2=0.999。
SYBRGreen实时定量PCR检测转基因大豆中外源基因拷贝数
基金项 目：国家转基因重大专项课题 （０ ８ Ｘ ８ １ — ０ ） ２０Ｚ ００２０ １ 作者简介 ：冀志庚（ ９ ４ ） １８ 一 ，男 ，硕士研究生 ，研究方 向为转基因作物检测 。Ｅ ｍ ｉ ｈｎ ｏ０ ＠１３ｃ ｍ — ａ ： ａｂ ０ １ ６ ．０ ｌ 通讯作者：高学军 ，教授 ，博士生导师 ， 研究方向为转基因检测。Ｅ ｍ ｉ ｇｏｊ ９ ＠ ｉ ． ｏ － ａ ：ａｘ ３ ０ ｓ ａｃｎ ｌ ５ ｎ 的影响【 ． Ｊ 土壤， ０４ ３ （ ： ６ ６ ． 】 ２ ０ ， ６１ ５ — ０ ） 彭诚． 土壤施硒 对白菜和堇 叶碎米 荠生理指标 的影 响『 ． Ｊ 湖北 １ 民族学院学报， ０ ７ ２ （ ： ８ ９ ． ２ ０ ， ５１ ８ — ０ ） 院金渴， 王朴， 刘正兴， 土壤 施硒对大蒜生理 特性 、含硒量 等．
周大寨， 唐巧玉， 陈建英， 土壤 施硒对花椰菜硒质 量分数及 等．
ｐ ｓ ｅ ｓ ｓ ｏ ｒ ｔ ｘ ｃ ｔ ｗ ｔ ｏ ｔ ｃ ｍｐ ｏ ｓｎｇ ｔ ｅ ｕ ｄ ｍｅ ｔ ｌ ｏ ｓ ｓ ｅ ｌｗｅ ｏ ｉ ｉ ｙ ｉｈ ｕ ｏ ｒ ｍｉ ｉ ｈ ｆ ｎ ａ ｎ ａ ｅｆ ｃ ｏ ｓ ｌ ｎ ｅ ｚ ｍｅ ：Ｃｏ ａ ｉｏ ｔ ｓ ｌ ｎ ｍｅ ｈ ｏ ｉ ｅ ｉ ｆ ｔ ｎ ｅｅ ｏ ｎ ｙ ｓ ｅ ｍｐ ｒｓ ｎ ｗｉ ｈ ｅｅ ｏ ｔ ｉｎ ｎ ｎ
第 ４ 卷 第 ｌ 期 ２ ０
２ １ 年 ｌ 月 ０１ ０
东
北
农
业
大
学学报 源自４ （０： ～ ５ ２１ ）１ ｌ １
０ｃ ． ０ｌ ｔ２ １
Ｊｕ ｎ ｌ ｆ ｏｔｅ ｓ Ａ ｒ ｕｔｒ ｌ ｎｖ ｒｉ ｏ ｒａ ｏ ｒ ａｔ ｇｉ ｌ ａ Ｕ ｉｅｓ ｙ Ｎ ｈ ｃ ｕ ｔ
REAL-TIMEPCR方法测定转基因小麦中外源基因拷贝数
ｗ ｘ ０ １ ２ｐ ｒ ｉ ｍ ｅ ｕ ｐ ｐ ｅ ｒ５ ′ ｇ ｔ ｃ ｇ ｃ ｇ ｇ ｇ ａ ａ ｃ ａ ｇ ａ ｇ ｇ ｔ ｇ ｔ ３ ′ ｗ ｘ ０ １ ２ｐ ｒ ｉ ｍ ｅ ｌ ｏ ｗ ｅ ｒ５ ′ ｇ ｇ ｔ ｇ ｔ ｔ ｃ ｃ ｔ ｃ ｃ ａ ｔ ｔ ｇ ｃ ｇ ａ ａ ａ ３ ′ ｐ ｔ ａ ２ｐ ｒ ｉ ｍ ｅ ｕ ｐ ｐ ｅ ｒ ５ ′ ａ ｇ ｃ ａ ｇ ｇ ｇ ｔ ｇ ａ ｃ ｔ ａ ｃ ｇ ｔ ｃ ｔ ｔ ｃ ３ ′ ｐ ｔ ａ ２ｐ ｒ ｉ ｍ ｅ ｌ ｏ ｗ ｅ ｒ ５ ′ ｔ ｃ ｇ ｃ ｔ ｔ ａ ｔ ｔ ｔ ｃ ａ ｃ ｃ ｔ ｔ ｃ ｔ ｃ ｃ ３ ′
收稿日期： ２ ０ ０ ９ １ ２ ０ １ 修回日期： ２ ０ １ ０ ０ １ １ ３ ２ Ｇ Ｓ ０ ３ ５ Ａ ４ １ ０ ０ １ ０ ３ ） 资助项目 甘肃省科技攻关计划项目（ 通讯作者， 电子信箱： Ｋ ｅ ｇ ｃ ８ ＠ｓ ｉ ｎ ａ ． ｃ ｏ ｍ
中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， ２ ０ １ ０ ， ３ ０ （ ３ ） ： ９ ０ ９ ４ ?
Ｒ Ｅ Ａ Ｌ Ｔ Ｉ ＭＥＰ Ｃ Ｒ方法测定转基因 小麦中外源基因拷贝数
李淑洁 张正英 （ 甘肃省农业科学院生物技术研究所 兰州 ７ ３ ０ ０ ７ ０ ）
取小麦基因组 Ｄ Ｎ Ａ ， 用碱裂解法提取质粒 Ｄ Ｎ Ａ ， Ｄ Ｎ Ａ 浓度和纯度用紫外分光光度法测定， 使Ｏ Ｄ Ｏ Ｄ ２ ６ ０／ ２ ８ ０≈ １ ． ８ ， Ｏ Ｄ Ｏ Ｄ ２ ， 备用。 ２ ６ ０／ ２ ３ ０＞ 内 参 基 因 标 准 品 选 用 未 转 基 因 的 小 麦 基 因 组 Ｄ Ｎ Ａ ， 浓度为 ０ ． ６ ５ ｇ ／ ｌ 。采用 ５倍倍比稀释， 稀释倍 μ μ ５， ５， ５， ５。 数分别为 ５， 以 含 ｐ ｔ ａ基 因 的 质 粒 Ｄ Ｎ Ａ 为 标 准 品， 浓度为 １ ． ５ ３× １ ０μ ｇ ／ ｌ 。采用 ５倍倍比稀释， 稀释倍数分别为 μ ５， ５， ５， ５， ５。 以 ｗ ｘ ０ １ ２作为小麦的内参基因， 以含 ｐ ｔ ａ基因的质 粒Ｄ Ｎ Ａ为阳性对照， 未转基因小麦为阴性对照， 水为 空白对照。 １ ． ２ ． ２ 引物设计及合成 转基因小麦内、 外源基因的 ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ公司合成。引物序列见表 １ 。 引物由 Ｉ
利用实时荧光定量PCR法检测转基因水稻外源基因拷贝数的研究
利用实时荧光定量ＰＣＲ法检测转基因水稻外源基因拷贝数的研究摘要：转基因植物中外源基因拷贝数是影响目的基因表达水平和遗传稳定性的重要因素，因此外源基因拷贝数的检测成为转基因研究的关键，利用高通量、快速、灵敏的SYBR Grcen I荧光定量实时PCR法，检测了转大麦烟酰胺合成酶基因(NAS1)水稻中外源基因拷贝数，以蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)作为水稻的内源参照基因，通过梯度稀释法，分别获得了NA51和SPS基因的Ct值与起始模板数的相关性标准曲线，相关系数分别为0.99976和0.99571，相关性高，通过目的基因NASl和水稻內源参照基因SPS起始模板数的比较，获得了目的基因在转基因水稻中的拷贝数，在8株转基因株系中，1株为假阳性，1株拷贝数为1，3株拷贝数为2，其余3株拷贝数分别为3、4和7，而阴性对照拷贝数为0，这种方法快速、简便、准确，可以满足转基因育种工作中对后代优良株系的选择。
关键词：SYBR Creen I实时荧光定量PCR；烟酰胺合成酶基因；转基因水稻；拷贝数植物遗传转化是作物改良和新基因功能鉴定的常用方法，但在转基因植物中外源基因拷贝数常影响目的基因的表达水平和遗传稳定性，因此，转基因研究中关键的一步就是检测外源基因的拷贝数，以筛选出拷贝数少或单拷贝的转基因植株供进一步的研究或育种利用，传统的转基因植株拷贝数检测主要是Southern 杂交法，但该方法工作量大，需要的DNA材料较多，费时费力，并且经常要用到放射性同位素等具有潜在危险的药品，近年来，利用高通量、快速、灵敏的定量PCR方法检测转基因拷贝数逐渐受到科研人员的青睐。
SYBR Green I实时荧光定量PCR法是在PCR反应体系中加入SYBR Green I 荧光染料，该染料能够结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域并具有受激发产生绿色荧光的能力，当它与PCR合成的双链DNA结合，在激发光照射下产生荧光，由于荧光信号强度的增加与PCR产物的增加完全同步，因此通过对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时检测，就可间接的获得PCR扩增数据，根据Ct(cycle thresholds)值与起始模板数的对数值成反比线性关系的原理，制作标准曲线，获得Ct值与起始模板数的相关性方程，将样品的Ct值代人该方程就可获得目的基因的起始模板数，通过与水稻内源参照基因起始模板数的比较，就可知道基因组中该外源基因拷贝数，内源参照基因一般选择拷贝数少，同一物种内的不同生态类型间具有稳定的序列结构和拷贝数的一类基因，Ding等通过对水稻、小麦、玉米、大麦等十几种作物的研究发现，蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，SPS)基因是水稻特有的基因，并且为单拷贝，可以作为水稻的内源参照基因。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用
实时荧光定量PCR技术的原理及应用在PCR扩增反应结束之后，可对扩增产物进行定性和定量的分析。
但是无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。
但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR扩增之前的起始模板量。
例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。
在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。
1.实时荧光定量PCR技术的基本原理在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
所谓实时荧光定量PCR技术，是指通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。
在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。
在扩增曲线中：荧光阈值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光本底信号(baseline)标准差的10倍；Ct值的含义是指在PCR循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数；Rn+表示每点测量的荧光强度,代表反应管含有模板DNA ;Rn-表示荧光基线强度,代表反应管不含有模板DNA,其在理想情况下是一条平线,只具有背景荧光数值;ΔRn表示PCR过程中,探针降解的量,也即PCR产物的量；基线( baseline)是背景曲线的一段,范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定,到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。
Taqman定量PCR技术检测转基因大豆中外源基因拷贝数
Taqman定量PCR技术检测转基因大豆中外源基因拷贝数仇有文;张明辉;高学军;曲波;敖金霞;袁肖寒;刘营;霍楠【摘要】[目的[采用Taqman定量PCR技术检测转基因杂交大豆中外源nos终止子基因的拷贝数.[方法]以大豆凝集素基因为内参照基因,以非转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,通过梯度稀释法分别求取了内参照基因和质粒DNA的Ct值与拷贝数对数值的相关性标准曲线方程,并通过将得到的Ct值代入标准曲线方程求取了样品的拷贝数.[结果]内参照基因标准曲线方程为y=-3.422x+35.201,R2=0.998;外源基因标准曲线方程为y=-3.348x+34.890,R2=0.999.nos终止子基因及其下游边界序列在转基因杂交大豆中为单拷贝.[结论]为确定转基因大豆外源基因拷贝数提供了理论依据.%[ Objective ] It is to adopt Taqman quantitative PCR technique to detect the copies of foreign nos terminator in transgenic hybrid soybean. [ Method ] With endogenous reference gene of soybean lectin, and endogenous reference standard of gene complex DNA in non-GMO soybeans, the method of gradient dilution was used to separately calculate Ct value of endogenous reference gene and plasmid DNA and relevance standard curve equation of logarithm of copies, and then to calculate the copies of samples through substituting thus-obtained Ct into standard curve equation. [ Result ] The standard curve equation of endogenous reference gene isy = - 3.422x + 35. 201 , R2 = 0. 998; and the standard curve equation of foreign gene is y = - 3. 348x + 34. 890, R2 = 0.999. Nos terminator and its lower boundary sequences in transgenic soybean is ofsingle copy. [ Conclusion] The study has provided a theoretical basis for determining foreign gene copies in transgenic soybean.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)017【总页数】3页(P10150-10152)【关键词】Real-time PCR;转基因杂交大豆;拷贝数;Lectin;nos终止子基因边界序列【作者】仇有文;张明辉;高学军;曲波;敖金霞;袁肖寒;刘营;霍楠【作者单位】东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030【正文语种】中文【中图分类】S188+.1实时荧光定量PCR技术是一种新的DNA定量方法[1]。
实时荧光PCR技术定量检测转基因大豆方法的研究
实时荧光PCR技术定量检测转基因大豆方法的研究吴影;宋丰顺;陆徐忠;赵伟;杨剑波;李莉【期刊名称】《作物学报》【年(卷),期】2007(33)10【摘要】以转基因大豆Roundup Ready为材料,通过特异性引物和探针,对转基因大豆中外源基因cp4-epsps进行了定量检测.研究发现Taqman荧光探针法和SYBR荧光染料法均可作为转基因大豆定量检测的方法,但前者比后者具更高的检测灵敏度和精确度,其检测阈值可降到0.05%,变异系数为0.09%～0.53%.在此基础上,建立和优化了Taqman探针实时荧光定量PCR检测技术体系,有助于提高转基因作物及产品的生物安全性定量检测的准确度和可靠性.【总页数】5页(P1733-1737)【作者】吴影;宋丰顺;陆徐忠;赵伟;杨剑波;李莉【作者单位】安徽省农科院水稻研究所,安徽合肥,230031;安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥,230036;安徽省农科院水稻研究所,安徽合肥,230031;安徽省农科院水稻研究所,安徽合肥,230031;安徽省农科院水稻研究所,安徽合肥,230031;安徽省农科院水稻研究所,安徽合肥,230031;安徽省农科院水稻研究所,安徽合肥,230031【正文语种】中文【中图分类】S5【相关文献】1.实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立 [J], 陈颖;徐宝梁;苏宁;王媛;王丙武;葛毅强2.实时荧光PCR技术定量检测转基因豆粉的研究 [J], 白卫滨;孙建霞;程国灵;罗云波;姜桂传;黄亚东3.TaqMan MGB实时荧光PCR对转基因大豆定量检测的研究 [J], 黄东东;翁少萍;吕玲;常迪;何建国4.实时荧光定量PCR技术检测腐乳中大豆转基因成分 [J], 许银叶;许佩勤;庄俊钰;冯志强5.应用实时荧光PCR技术定性定量检测改良品质的转基因小麦 [J], 栾凤侠;张洪祥;白月因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数
在毕赤酵母中，外源基因能够在基因组的同一位点进行多次同源重组，从而插入多个拷贝的外源基因。
而高拷贝的外源基因通常会导致其在毕赤酵母中的高表达［1］。
比较外源基因在毕赤酵母中表达量的差异时，如比较不同启动子的转录活性时，往往需要检测外源基因的拷贝数，筛选单拷贝整合外源基因的毕赤酵母菌株。
目前，在毕赤酵母的研究中，Southern blot 是运用最多的检测外源基因拷贝数的方法［2］。
但该方法需要大量的DNA ，工作量大，操作要求高。
近年来，荧光定量PCR 技术不断成熟，并已开始用于检测外源基因的拷贝数，如在转基因植物研究领域，已利用该项技术检测外源基因的拷贝数［3］。
但相关文献报道较少。
本文以毕赤酵母中的看家基因GAP （Glycer －aldehyde -3-phosphate dehydrogenase ）为内参，绿色荧光蛋白（GFP ）基因为报告基因，采用双标准曲线实时荧光定量PCR 法，建立了一种测定毕赤酵母中外源基因拷贝数的方法，现报道如下。
1.材料与方法1.1菌株及质粒大肠杆菌Top10、毕赤酵母GS115及质粒pPIC3.5K 均购自Invitrogen 公司；含GFP 基因的毕赤酵母GS115-KDR -P 菌株由本室保存；pMD19-T Simple 载体购自TaKaRa 公司。
1.2主要试剂及仪器Premix Taq （Ex Taq TM Version ）和连接试剂DNA作者单位：华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室（上海200237）.通讯作者：周祥山，E -mail ：xszhou@中国图书分类号Q789文献标识码A文章编号1004-5503（2009）12-1236-05【实验技术】实时荧光定量PCR 检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数宣姚吉周祥山张元兴【摘要】目的建立实时荧光定量PCR 检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的方法。
方法采用双标准曲线法，分别利用含有GAP 基因和绿色荧光蛋白（GFP ）基因的质粒，进行实时荧光定量PCR 反应，建立标准曲线。
实时荧光定量PCR技术在转基因检测中的应用_敖金霞
实时荧光定量PCR 技术在转基因检测中的应用收稿日期：2008-03-05基金项目：东北农业大学创新团队项目（CXT004-3-2）作者简介：敖金霞（1977-），女，黑龙江人，博士研究生，助研，主要从事转基因作物基因检测技术方面研究。
*通讯作者：教授，博士生导师，E-mail:gaoxj5390@敖金霞1，高学军1*，仇有文1，郭士成2（1．东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心，哈尔滨150030；2．东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）摘要：实时荧光定量PCR 技术是一种新型的核酸定性、定量检测、分析技术。
随着转基因产品大规模商业化，转基因生物的环境安全和食用安全性问题引起了全球范围内广泛的争论和关注。
实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及PCR 反应后不需电泳检测等优点，使RQ-PCR 逐步成为转基因检测的重要工具。
关键词：实时荧光定量PCR ；Taq Man 探针法；SYBR Green I 染料法；转基因检测中图分类号：TS207.3文献标识码：A随着有关转基因成分标签法的建立和对于转基因食品的重视程度及量化要求的提高，定性PCR 因其在转基因检测中的高敏感性差易造成假阳性现象，以及操作误差和一些反应抑制因素带来的假阴性现象，使其已经不能再满足人们的需要。
在这种基础之上实时荧光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction ，RQ-PCR ）发展起来，RQ-PCR 技术不仅实现了对DNA 模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点。
目前实时荧光定量PCR 已广泛应用于分子生物学、农业、医学等学科的应用和基础研究领域，并已经在转基因检测中发挥了不可替代的作用[1-2]。
1R Q -PC R 的基本原理实时荧光定量PCR 技术是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线，对待测样品中的未知模板进行定量分析的方法。
实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立 (1)
测内源特异参照基因 (内源基因) ,可以判定
DNA 是否被提取出来 ,或所提 DNA 是否适
合于进行 PCR 扩增 ,从而可以避免检测结果
的假阴性 。因此 ,对大豆内源基因 Lectin[5 ]
的检测即是对被检测样品 DNA 提取质量的
检测 。
本研究通过采用特异引物首先对转基因
大豆中的内源基因进行了定性 PCR 检测 ,以 确定所提取的 DNA 是否适合于 PCR 扩增 。 PCR 电泳显示 :转基因成分含量分别为 5 %、 2 %、1 %、015 %、011 %、0 %的转基因大豆 ,均 扩增出了 118 bp 片断 (电泳结果未显示) ,该 结果表明 ,所提取的 DNA 数量和质量均适 合于 PCR 扩增 。 212 标准曲线的建立
2 结果与分析
Y = - 31176 X + 261006 , 相 关 系 数 R2 为 01991 。这样 ,将待测样品扩增得到的 Ct 值
211 大豆内源 Lectin 基因定性
( Y 值) 代入公式 ,即可得到待测样品的转基
提取出一定数量的高质量 DNA 是进行 因成分的百分含量 。
转基因成分 PCR 检测的前提条件 。通过检
015 %、011 %、0 % 的 转 基 因 大 豆 Roundup
大豆内源基因 Lectin 检测的引物如表 1
Ready 标准品购自 Fluka 公司 ( Fluka ,Buchs , 所示 ,反应在 50μL 的反应体系中进行 ,其中
Switzerland) 。
PCR 反应缓冲液 5μL , 脱氧核苷酸三磷酸
66
Ready 转 基 因 大 豆 标 准 品 ( 5 %、2 %、1 %、 015 %、011 %、0 %) 的测定 ,计算机自动生成 标准曲线 ,纵坐标为临界循环值 Ct ,横坐标 为百分含量 。根据标准曲线所得的线性计算 公式 ,将样品的 Ct 值代入公式 ,即可得到待 测样品的转基因成分的百分含量 。 1121412 检测低限的测定
利用实时荧光定量PCR技术检测转基因烟草
3. 2 扩增曲线的形成 在定量 PCR 过程中, 以荧光值 Rn 和临界循
环值作图, 系统自动得到扩增曲线, 如图 2. 图中可 以看出相同样品的重复性还是比较好的. 这时需 要设置基线 ( base line) 和阈值, 实验表明, 基线要
基因定量分析是未来检测手段的一个重要发 展方向, 虽然他还存在着一定的技术性问题, 但是 随着分子生物学技术的不断发展会日趋完 善, 在 生命科学技术领域会有很大的应用前景.
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哈尔滨师范大学自然科学学报
2005年
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样品 S8, 4. 84 ( 4. 32 % 105, 5. 12 % 105, 5. 09 % 105 ), 以上数据 ( 如图 4) 表明, 相同样品 ( 3 个重 复 ) 的重复性还 是比较吻合 的, 进 一步说明 定量 PCR 技术具有良好的检测准确性. 虽然相同条件 相同样品时, 实验结果会有差别, 但它为精确定量 检测提供了基础.
ct值与拷贝数示意图4讨论试验所用染料sybrgreenpcr产物的特异性要求特别高它的多少可能决定检测的灵因为sybrgreeni可以和双链dna小沟结无论是起始模板还是非特异性产物引物二聚体都会结合上所以要优化反应体系尽量减少引物二聚体非特异性产物由此也可以看出它不比常规pcr有更高特异性有试验表明使用双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针方法获得荧光信号在很大程度上提高了检测的灵敏度特异性和精确度sybrgreen使用时要避光操作时要快
抗除草剂转基因作物实时荧光定量PCR检测
应用与环境生物学报 2009，15 ( 6 ): 866~870Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X2009-12-25DOI: 10.3724/SP.J.1145.2009.00866随着转基因技术的日趋成熟，各种转基因农作物由实验室走向环境释放，其中不少农作物已进行商品化生产，且种植面积急剧扩大. 根据国际农业生物技术应用咨询服务中心（ISAAA ）2007年的报告，95%的转基因农作物集中在大豆、玉米、棉花和油菜籽4种植物上，抗各种杂草和抗虫害的两个转基因类型占主导地位. 由此带来的转基因生物及产品的安全性问题已经成为人们讨论的热点问题. 世界多数国家和国际组织的普遍做法是对转基因产品实施标识管理，大部分实施转基因产品标识管理政策的国家都规定了各自不同的标识阈值. 例如：欧盟（2002）规定转基因产品成分高于0.9%，巴西为4%，澳大利亚和新西兰为1%，俄罗斯、中国香港和中国台湾地区都为5%时，就必须进行标识. 我国2001年颁布实施《农业转基因生物安全管理条例》，其中第四章第二十八条明确规定，在中华人民共和国境内销售列入农业转基因生物标识目录的农业转基因生物，应当有明显的标识. 因此，为转基因产品实施标签制度的定量检测技术显得尤为重要.近年来，对转基因生物产品进行定量分析的主要方法是荧光定量PCR 技术. 由于该技术不仅实现了PCR 从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR 相比，具有特异性强和灵敏度高的特点，避免了PCR 产物进行后期处理，克服了以往PCR 技术中存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点[1]，极大地提高了检测速度和自动化程度. 荧光定量PCR 技术是指在普通PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累监测整个PCR 反应的进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法. 荧光定量PCR 的荧光基团包括探针类和染料类两种. 本文所用染料类如SYBR Green I 是一种非饱和菁类荧光素，利用与双链DNA 小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加，其处于游离状态时，检测不到荧光信号，当结合dsDNA 后荧光强度明显增强，即被荧光探测系统检测到，荧光强度的增加与初始模板量相关. 目前实时荧光定量PCR 中抗除草剂转基因作物实时荧光定量PCR 检测*王恒波 陈如凯 陈平华**（福建农林大学农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室 福州 350002）Detection of Genetically Modi fi ed Herbicide–tolerant Crops by Real-timeFluorescent Quantitative PCR Assay*WANG Hengbo, CHEN Rukai & CHEN Pinghua **(Key Laboratory of Genetic Improvement for Sugarcane, Ministry of Agriculture, Sugarcane Research Institute ofFujian Agriculture and Forestry University , Fuzhou 350002, China )Abstract A rapid and sensitive SYBR Green I-based real-time PCR method was developed for quantitative detection of CP4-EPSPS and PAT genes from the genetically modi fi ed (GM) herbicide-tolerant crops. The target genes from transgenic soybean and maize references were ampli fi ed to make standard curves. The transgenic ratios were then calculated according to the standard C t -copies linear graphs of these two genes. The reproducibility and melting curves of the genes were also analyzed. The results showed that the standard equations of CP4-EPSPS and PAT genes had higher R 2 values of 0.993 9 and 0.992 4, respectively. The difference in transgenic ratios between the known standards and measured crops was only 6.52%~7.90%. These results suggest that the real-time PCR assay with SYBR Green I dye is suitable for detecting the ratios of GM crops and their derivates. Fig 5, Tab 2, Ref 11 Keywords genetically modi fi ed herbicide-tolerant crop; SYBR Green I dye; real-time fl uorescent quantitative PCR; meltingcurve; detection CLC Q943.2摘 要 建立了一种以SYBR Green I 为结合染料、快速准确检测转抗除草剂基因成分的实时荧光定量PCR 方法. 以转基因大豆与转基因玉米标准品为材料，通过使用特异性引物和SYBR Green I 结合染料实时荧光定量PCR 技术，对转基因农作物中外源抗除草剂基因进行了定量检测，绘制了两种基因扩增的标准曲线图，根据标准曲线方程计算外源基因含量；并作了溶解曲线、检测方法检测灵敏度和精密度的分析. 研究发现，两者标准曲线方程线性关系良好，R 2值分别达到0.993 9与0.992 4. 通过已知标准品进行验证，实测值与真值接近，与实际含量的相对偏差是6.52%和7.90%. 结果表明，SYBR Green I 结合染料法完全可以用于转基因农作物定量PCR 检测. 图5 表2 参11关键词 抗除草剂转基因作物；SYBR Green I 荧光染料；实时荧光定量PCR ；溶解曲线；检测CLC Q943.2收稿日期：2008-12-15 接受日期：2009-03-17*国家“863”计划项目（No. 2007AA100701）和福建省科技计划重点项目（No. 2007I0036）资助 Support by the National “863” Project of China (No. 2007AA100701) and the Major Research Projects of the Department of Science & Technology of Fujian, China (No. 2007I0036)**通讯作者 Corresponding author (E-mail: phcemail@)867 6 期王恒波等：抗除草剂转基因作物实时荧光定量PCR检测使用特异性的荧光探针较多，但由于反应体系中荧光探针能与靶序列特异性杂交，同时存在猝灭不彻底、合成和标记复杂、成本较高等缺陷[2~4]. SYBR Green I荧光染料成本较低，但尚未在定量检测转抗除草剂基因作物中应用. 为了降低检测成本，本研究利用SYBR Green I荧光染料代替价格昂贵的TaqMan探针进行定量检测，分别建立了两种商品化程度最高的转基因大豆CP4-EPSSPS和转基因玉米（TC1507）PAT两种抗除草剂基因的定量PCR检测体系，以期为我国转基因定量标识检测体系提供技术支持.1 材料与方法1.1 材 料转基因大豆标准品（Roundup Ready TM soya beans）（ERM-BF410f、ERM-BF410d、ERM-BF410a），其中转基因成分含量分别占5%、1%、0%；转基因玉米标准品（TC1507 Maize），转基因成分含量分别占0%、1%、10%，以上标准品均由国际标准物质收藏中心（IRMM）制备，均购自Fluka公司. 阴性对照材料大豆为鲁豆4号、玉米吉单275，系本实验室保存.1.2 酶及试剂PCR反应试剂（包括ExTaq酶、SYBR Premix ExTaq、dNTPs、buffer）购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；CTAB提取液[200 mmol/L Tris-HCl，2 mol/L NaCl，25 mmol/L EDTA，0.5% SDS，pH 8.0]；沉淀缓冲液[2% CTAB，100 mmol/ L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，1% PVP]；100 μg/mL蛋白酶K；酚 : 氯仿 : 异戊醇（25 : 24 : 1）；氯仿 : 异戊醇（24 : 1）；异丙醇；75%乙醇.1.3 主要仪器定量PCR仪：美国BIO-RAD公司生产；离心机：德国Eppendorf 5810型；PCR仪：德国Eppendorf公司Master Cycler gradient 96；核酸蛋白分析仪：瑞典APBiotech产品；生物安全柜：上海力新有限公司.1.4 PCR引物引物由上海生工生物工程有限公司合成，其核苷酸序列和扩增片段长度见表1. 引物采用中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1195-2003、SN/T1196-2003.1.5 基因组DNA的提取采用SN/T1195-2003标准提取基因组DNA，用核酸蛋白分析仪测定核酸提取液中DNA的浓度，稀释到400 ng/μL 备用. 1.6 定性PCR对内源基因的检测与定量PCR对CP4-EPSPS和PAT外源基因的检测大豆和玉米的内源基因分别是Lectin、IVR，其检测引物如表1中所示，定性PCR反应在25 μL体系中进行. 反应体系：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，引物（10 pmol/L）各0.5 μL，ExTaq酶（5 U/μL）0.125 μL，模板DNA（100 ng/μL）1 μL，加灭菌双蒸水使总体积为25 μL. 扩增条件为预变性95℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，35个循环；最后72 ℃延伸4 min.采用TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司提供的试剂盒，在25 μL的反应体系中进行，其余按照说明书进行. 定量PCR反应条件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 5 min；60 ℃ 40 s；40个循环. 反应结束后，记录参照样品和待测样品的Ct值，熔解曲线温度范围设置为65.0 ℃至95.0 ℃，每间隔0.5 ℃读数一次，每次1 s，并且连续记录荧光信号的变化，将温度的变化与荧光信号的变化求负倒数后对温度作图，可得到产物的 Tm值. 除特别注明外，每个试样均做3个重复，并同时设立空白对照和非转基因样品的阴性对照.1.7 DNA模板的制备提取转基因大豆含量（转基因大豆基因组量/大豆总基因组量）为5%的标准参照物质的DNA样品，利用核酸蛋白分析仪检测DNA的浓度，稀释到400 ng/μL. 用双蒸水分别将其DNA稀释1倍、5倍、25倍、125倍制作标准曲线，为了验证生成的标准曲线，特别将浓度为400 ng/μL、1%的转基因大豆标准品作为待测样品. 取不同稀释倍数的DNA待测样品进行实时荧光PCR检测，建立合适的标准曲线，用于待测转基因大豆样品的定量检测. 将转基因玉米TC1507含量为10%的参照物质提取的DNA样品稀释到400 ng/μL. 用双蒸水分别将其DNA稀释1倍、2倍、10倍、50倍、250倍制作标准曲线，用于待测转基因玉米TC1507样品的定量检测.1.8 定量标准曲线的建立和验证及溶解曲线分析通过对模拟不同转基因含量的转基因大豆和转基因玉米样品的测定，计算机自动生成标准曲线，纵坐标为Ct，横坐标为百分含量的对数. 根据回归曲线方程，将样品的Ct值代入公式，即可得到该转基因作物的百分含量.荧光染料的优势在于能检测各种双链DNA序列的扩增，无需设计探针，检测过程简便，成本低廉. 然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合，对DNA模板没有选择性，因此也能与非特异的dsDNA结合，使实验容易产生假阳性信号，目前引物二聚体的问题可以通过溶解曲线分析加以解决.表1 大豆Lectin、玉米IVR内源基因和转化的CP4-EPSPS、PAT基因的PCR引物序列及产物大小Table 1 List of PCR primers designed for Lectin, CP4-EPSPS in RR soybean and IVR, PATin maize TC1507, and the sizes of their products基因 Gene引物序列 Primer sequence产物片段大小 Amplifi ed fragment (bp)Lectin Forward 5’-GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C-3’Reverse 5’-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG-3’′118CP4-EPSPS Forward 5’-CCA CTA TCC TTC GCA AGA CCC TTC C-3’Reverse 5’-CTT CTG TGC TGT AGC CAC TGA TGC-3’320IVR Forward 5’-CCG CTG TAT CAC AAG GGC TGG TAC C-3’Reverse 5’-GGA GCC CGT GTA GAG CAT GAC GAT C-3’226PAT Forward 5’-GTC GAC ATG TCT CCG GCG AG-3’Reverse 5’-GCA ACC AAC CAA GGG TAT C-3’19186815 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol1.9 检测方法精密度分析[5]本实验在讨论以上两种标准品的基础上分别选择了3个不同转基因含量的浓度（0.04%、1.00%、5.00%），分别进行10次重复测定，通过统计分析方法计算两者的精密度.2 结果与分析2.1 大豆和玉米DNA的质量及其内源基因的扩增经过核酸蛋白测定仪测定，提取的基因组D N A的D260 nm /D280 nm在1.7~2.0之间，稀释DNA的浓度为400 ng/μL. 提取高质量的DNA是进行转基因成分检测的前提条件. 通过检测内源特异参照基因，可以判定DNA是否被提取出来，或所提DNA是否存在抑制PCR扩增的物质，从而可以避免检测出现的假阴性结果. 首先通过对大豆和玉米基因组中内源单拷贝Lectin基因与IVR基因进行定性PCR检测，验证所提取的基因组DNA能够适合于PCR扩增. 图1、图2分别显示Lectin基因与IVR基因扩增结果，由图可以看出，分别扩增出了预期的118 bp内源Lectin基因片段和226 bp的内源IVR基因片段，表明提取的基因组DNA质量完全符合PCR扩增的要求.2.2 定量标准曲线的建立和验证将转基因大豆含量为5%和转基因玉米含量为10%的DNA标准品，通过5倍稀释模拟5%、1%、0.2%、0.04%不同含量的转基因样品建立标准曲线，将待测样品扩增得到的Ct 值代入公式，即可得到待测样品的转基因成分的百分含量的对数，进而计算转基因成分的含量，最后通过已知百分含量的标准品进行验证所建立的标准曲线是否适合对转基因大豆和转基因玉米TC1507的定量检测. 研究表明：Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系[6]. Ct值越小，模板DNA的起始拷贝数越多；Ct值越大，模板DNA的起始拷贝数越少. 图3与图4分别是两个基因实时荧光定量扩增图. 由图可以看出，虽然两个基因的起始含量（大豆为5%和玉米为10%）不同，但是由于拷贝数/基因组的差异，它们在25个循环左右开始进入指数扩增期，且两个基因扩增稳定，浓度较低的样品用较多的循环次数才能产生较高的荧光信号，其Ct值也相应增大.检测转基因大豆得到的标准曲线方程为y = -2.9429x + 20.918，r2 = 0.9939. 其中：x为外源基因的百分含量的对数，y为Ct值，r2为线性相关系数；检测转基因玉米TC1507得到的标准曲线方程为y = -3.4394x + 23.193，r2=0.9924.以上定量PCR检测的标准曲线相关系数达到了0.99以上，具有较好的线性关系和可以接受范围内的SD值，检测灵敏度为0.04%，该灵敏度是目前国际上设定的转基因最低标识限量的25倍，已经完全能满足转基因产品标识检测的需要. 将已知转基因含量的待测样品Ct均值代入方程，得出0.9348%和1.079%，与实际含量的相对偏差是6.52%和7.9%，可以看出，线性方程完全可以满足转基因抗除草剂大豆和玉米的定量PCR检测需要.2.3 溶解曲线分析在SYBR GreenⅠ染料法检测中，染料与所有的双链DNA图1 大豆内源Lectin基因的定性检测 Fig. 1 Qualitative detection of the endogenous gene Lectin of soybean M：100 bp DNA ladder marker（Tiangen）；泳道1、2、3为5%转基因大豆标准品；4、5、6为1%转基因大豆标准品；7：阴性对照（pBI121）；8：阳性对照（鲁豆4号）；9：提取空白对照；10：试剂空白对照M: 100 bp DNA ladder marker; Lanes 1, 2, 3: Transgenic soybean reference of 5%; Lanes 4,5,6: Transgenic soybean reference of 1%; Lane 7: Negative control (pBI121); Lane 8: Positive control (Ludou No. 4); Lane 9, Environment control; Lane 10: Reagent control图2 玉米内源IVR基因的定性检测Fig. 2 Qualitative detection of the endogenous gene IVR of maizeM：100 bp DNA ladder marke（Tiangen）；1、2、3为10%转基因玉米标准品；4、5、6为1%转基因玉米标准品；7：阴性对照（鲁豆4）；8：阳性对照（非转基因玉米）；9：提取空白对照；10：试剂空白对照M: 100 bp DNA ladder marker; Lanes 1, 2, 3: Transgenic maize reference of 10%; Lanes 4, 5, 6: Transgenic maize reference of 1%; Lane 7: Negative control (Ludou No. 4); Lane 8: Positive control (Jidan No. 275); Lane 9: Environment control; Lane 10: Reagent control图3 转基因大豆标准品CP4-EPSPS基因SYBR Green I染料荧光定量PCR扩增曲线Fig. 3 Quantitative real-time PCR detection of CP4-EPSPS in GM soybeanreferences with SYBR Green I dye图4 转基因玉米TC1507标准品PAT基因SYBR Green I染料荧光定量PCR扩增曲线Fig. 4 Quantitative real-time PCR detection of PAT in GM maize referenceswith SYBR Green I dye8696 期王恒波等：抗除草剂转基因作物实时荧光定量PCR 检测相结合，不需要探针，检测方法简便；但其特异性完全依赖于引物，对引物设计要求特别高. 引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物都将引起假阳性的出现[7]，这将严重影响到定量检测的精确性和可靠性. 但利用荧光染料可以指示双链DNA 熔点的性质，通过温度的变化进行熔解曲线（Tm ）分析[8]，可识别扩增产物和引物二聚体，然后在检测的过程中通过提高退火温度，区分非特异扩增，从而降低非特异产物的影响. 一般通过熔解曲线来分析其扩增特异性. 理想的熔解曲线应该是单峰型曲线，如果出现两个或两个以上的峰，说明有引物二聚体等非特异性扩增产生. 本实验根据CP4-EPSPS 和Lectin 的扩增产物特点确定的读板温度分别为83.5 ℃和82 ℃，生成的溶解曲线如图5（A 、B ），可以看出，这两个基因的溶解曲线都是单峰型，说明PCR 扩增过程中没有出现非特异性扩增，由此推断定量PCR 扩增所获得的数据是可靠的.2.4 检测方法灵敏度和精密度的分析 对于不同检测方法来讲，其检测的灵敏度在很大程度上决定了检测结果的可信度，尤其是对于特异性不强的SYBR Green I 荧光染料法. 如果本实验的检测灵敏度不高，就很可能将阳性结果判为阴性. 本实验以模拟的转基因大豆和转基因玉米1%、0.2%、0.04%的模板进行扩增. 结果如图3、图4，所有不同含量的标准品均能够正常扩增，由此可以确定此荧光定量PCR 方法的检测灵敏度为0.04%，完全满足国际上对转基因含量检测的最低标识（欧盟2003）0.9%的要求.精密度表征测定过程中随机误差的大小，表示测量的再现性，是保证准确度的先决条件. 一般说来，精密度不高，就不可能有高的准确度；反之，精密度好，准确度不一定高. 这种情况表明测定中随机误差小，但系统误差较大. 本实验选择不同水平0.04%、1.00%和5%转基因大豆和玉米TC1507样品，进行10次重复测定，通过统计分析方法计算该检测方法检测的精密度. 从表2可知，0.04%、1.00%和5%的转基因大豆和玉米TC1507样品的最终实际测定值分别为0.040 3%、1.085 5%、5.079 7%和0.040 6%、1.051 4%、5.034 4%；变异系数分别在1.948 4%~3.711 8%，说明本实验建立的方法准确可靠，具有良好的重现性.3 讨 论3.1 实时荧光PCR 技术进行定量的方式随着转基因标签制度的实施，对转基因产品检测的要求不仅是要能够给出是或否的定性检测结果，更要能够对农作物及其产品中的转基因成分进行精确定量，因此实时荧光定量PCR 检测技术正日渐成为转基因产品检测的热点问题. 利用实时荧光PCR 技术进行定量的方式有3种：第1种方式是目前国际上采用的质量百分比（m /m ）对转基因产品进行定量，标准品是将不同质量百分比的转基因与非转基因干粉混合后提取DNA 定量检测；第2种方式是转基因产品（纯品）DNA 与非转基因产品DNA 的百分比，即将转基因产品纯品提取DNA 后，与非转基因产品的DNA 进行不同梯度的稀释，用所得的C t 值绘制出标准曲线：第3种方式是计算样品中的基因初始拷贝数，这需要将阳性质粒DNA 溶液作不同拷贝数的稀释，绘制出不同拷贝数的标准曲线[9]. 本实验采用的是第一种方式，探讨进行定量的可行性，通过标准曲线可以得出待检样品中外源基因DNA 的含量.3.2 荧光染料的优缺点由于FQ-PCR 是指在PCR 反应体系中加入能够特异标记PCR 产物的荧光物质，利用荧光信号积累实时监控整个PCR 进程，得到S 型的扩增曲线. 这种荧光物质可分为特异性荧光探针和嵌入荧光探针两大类. 本研究选用了嵌入荧光染料即SYBR Green I ，它是一种成本较低的结合染料的PCR 检测方法. 在反应体系中，加入过量SYBR 荧光染料，SYBR荧光染图5 使用SYBR Green I 染料测得标准品与待测样品的溶解曲线Fig. 5 Melting curve resulting from FQ-PCR analysiswith SYBR Green I dyeA 为引物CP4-EPSPS 特异扩增的溶解曲线；B 为引物PAT 特异扩增的溶解曲线A: Melting curve of the CP4-EPSPS gene; B: Melting curve of the PAT gene表2 转基因大豆Roundup Ready 和转基因玉米TC1507定量检测精密度结果分析Table 2 Precision analysis of quantitative detections of transgenic RR soybean and maize TC1507精密度分析Precision analysis转基因成分检测值 Quantity (% of content)转基因大豆Roundup ReadyGM soybean转基因玉米TC1507GM maize TC15070.04%1%5%0.04%1%5%平均值（10次重复）Average value (AV)标准偏差 Standard deviation (SD)变异系数 Coef fi cient of variation （CV/%）0.04030.00193.71181.08550.04753.06085.03970.05082.93890.04060.00173.20171.05140.06942.60115.03440.09811.948487015 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol 料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步. 其优点是对模板没有选择性，使用非常方便，但也易与非特异性双链DNA 结合并产生荧光信号，从而产生假阳性，引物二聚体是最常见的假信号源，而且任何非特异的双链DNA 的存在都会产生信号，这些荧光信号有可能被当作来自目标扩增序列的信号，特别是当目的序列的扩增量很少或者根本没有的时候，但是这些不足之处可以通过融解曲线的分析[10]，优化反应条件，降低或者消除引物二聚体的干扰. 因为引物二聚体的片段一般很小，融解温度通常都比目标PCR 产物的融解温度低. 如果在高于引物二聚体的T m 但低于特异产物的T m 的温度下读板，由于引物二聚体已经变性，与之结合的SYBR Green I （SGI ）都脱离下来，因此这个时候检测到的荧光都来自目标扩增序列，这就消除了因引物二聚体而产生的荧光信号. 而在这个温度下，大部分的特异产物仍然保持双链形式与SGI 结合. 此时检测到的荧光信号，就没有了因引物二聚体而产生的干扰信号，荧光信号就与特异扩增产物量的关联性更加紧密.3.3 定量检测存在的问题在荧光定量PCR 技术中仍存在一些有待解决的问题. 在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程. 目前由于无统一标准，各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性. 另外，与传统的PCR 技术相比，FQ-PCR 的不足之处[11]是：(1) 由于运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小；(2) 因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制了FQ-PCR 的复合式（Multiplex ）检测的应用能力；(3) 目前FQ-PCR 实验成本比较高，从而限制了其广泛的应用. 随着技术不断改进和发展，目前FQ-PCR 已成为转基因检测技术的主要工具，该技术未来的应用前景是令人鼓舞的，一方面FQ-PCR 技术与其它分子生物学技术相结合使定量极微量的基因表达或DNA 拷贝数成为可能. 另一方面荧光标记核酸化学技术和寡核苷酸探针杂交技术的发展以及Real Time 技术的应用，使定量PCR 技术有一个足够的基础为广大检测室所接受，将有助于对转基因生物产品成分进行准确、快速的检测.References1 Zhang LG (张立国), Zhang J (张琚). 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实时荧光定量PCR技术在转基因食品检测领域中的应用
实时荧光定量PCR技术在转基因食品检测领域中的应用
摘要：转基因技术给全球的食品行业带来了巨大的经济效益，随着世界上各国不断对转基因技术和转基因农产品的开发利用，人们开始广泛关注食用转基因产品对人类健康的影响以及种植转基因农产品对生态环境的影响。各国政府和国际机构都十分重视对转基因作物及转基因食品进行综合评价，对转基因作物及转基因食品的综合评价需要一套科学合理的安全评价体系，也应该建立一套完善、严格的法律法规。本文分析了实时荧光定量PCR技术在转基因食品检测领域中的应用。
如何确定转基因拷贝数(Southern Blot法和荧光定量PCR方法)
如何确定转基因拷贝数（Southern Blot法和荧光定量PCR方法）发布: 2010-01-22来自: 易生物实验阅读数：5391次鉴定转基因植物的第一步就是要确定被转基因已经稳定的整合到了染色体上。
第二步任务就是评估有多少个转基因拷贝，以及每个转基因的表达水平如何。
一般经过上游表达载体的设计构建以及下游转化体系的建立、转化品系的筛选鉴定等一系列步骤后，即获得T 0 代转基因植物。
在转化过程中，外源DNA 随机插入植物内，插入的拷贝数和位点都不固定。
插入外源基因的拷贝数低（1或2个）能较好的表达，插入的拷贝数多则会导致表达的不稳定甚至基因沉默现象。
因此，检测T0代植物的外源基因的拷贝数是研究其分子特性的基础步骤之一。
1、Southern Blot法Southern Blot是一种常用的DNA定量的分子生物学方法。
其原理是将待测的DNA 样品固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA 的位置上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数。
Southern法准确性高、特异性强，但存在费时费力的缺点。
另外，由于Southern法检测不经过靶片段的扩增（PCR），一般每个电泳通道需要10-30 μg的DNA ，在实际操作中就需要较大量的植物材料来提取DNA ，而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后一般都比较细弱，不宜大量取样。
如果外源基因在插入时发生基因重组，造成限制性酶切位点丢失，Southern 法也无法检测到。
这些因素都制约了Southern法在T0代植物中检测外源基因拷贝数的应用。
2、荧光定量PCR方法利用新型、灵敏、高通量的实时荧光定量PCR方法可以用于测定原始品系中转基因的绝对拷贝数。
实时荧光定量PCR技术是一种较新的DNA 定量方法。
其定量的基本原理是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如：SYBR GREEN I）或特异性的荧光探针（如：Taqman 探针），实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数：CT值（Cycle Threshold）；通过将已知浓度标准品的CT值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。
实时荧光定量PCR技术在转基因食品检测领域中的应用
实时荧光定量PCR技术在转基因食品检测领域中的应用发布时间：2022-10-10T08:40:31.342Z 来源：《中国科技信息》2022年第11期作者：苏莎莎[导读] 近年来，随着植物基因工程技术在农业生产行业中得到越来越广泛的应用,苏莎莎中鼎检测技术（天津）有限公司天津 300308【摘要】近年来，随着植物基因工程技术在农业生产行业中得到越来越广泛的应用,更多的带有改良育种特性基因的新型转基因育种品种也随之在世界范围内进行了广泛种植栽培,所以随之而来的就是转基因食品迅猛地发展,与转基因农业产品规模的商业化比较更引发了人们对农产品质量安全问题的忧虑。
为了能确保转基因商品管理检测制度建设的进一步顺利推行,那么建立一个迅速、正确、高通量度的定量管理检验制度手段已十分必要。
该文着重阐述了实时荧光定量PCR技术及在转基因食品定量检测过程中的运用,同时展望了建立质粒标准分子的技术来进行对较高转基因植物产品的定性检验。
【关键词】实时荧光定量PCR技术;转基因食品检测;应用前言由于农业转基因相关技术应用的深入推进,转基因食物目前已逐步广泛的渗入于人类食物链系统中。
近年来,食品制造相关领域中应用转基因分离技术方法进行的食品原料的直接商业化制造与加工转基因分离食品原材料的应用种类迅速日益增多,生产量规模和年销售额等也一直在持续急剧增加。
所以仅靠目前的物理、化学以及仪器等检验食品方式,存在着很大的局限性,已无法完成现代的食品安全检测的要求。
1.实时荧光定量PCR技术的涵义荧光定量PCR技术,是一种指通过实时在检测整个荧光PCR样品的反应检测系统中随机添加荧光基团,并利用其荧光信息强度的即时变化情况来进行对检测材料的荧光反应的过程结果进行定量的即时化监测,从而能够通过跟踪荧光信息强度的连续强弱和变化趋势来较为准确地快速掌握荧光特异性扩增的物质分子的相对含量,进而达到通过标准曲线分析来有效实现快速定量分析效果的定量检测手段方式。
SYBR Green实时定量PCR检测外源基因拷贝数
Ｓ Ｂ ｅ ｎ实 时 定 量 Ｐ Ｒ检 测 外 源 基 因 拷 贝 数 Ｙ Ｒ Ｇｒｅ Ｃ
庄 强， 钱 程 ，刘 立
（ 浙江理 工大学生命科 学院 ， 州 ３ ０ １ ） 杭 １ ０ ８
摘 要 ：以 Ｓ Ｒ Ｇｒｅ ＹＢ ｅｎ为 荧光 染料 ， 过 携 带 双 基 因 ＧＦ 通 Ｐ和 Ｉ－４的 质 粒 标 准 品 绘 制 双 标 准 曲 线 ， 以 绝 对 Ｌ２ 并
量口 ， 该方 法测 定时需 满 足两 大前 提条 件 ： 标 准品 的制作 ， ｊ用 ① 由于标 准 品通常 是通 过 Ｓ ｕｈｒ ｌｔ 来 确 ｏ ｔｅｎｂｏ 法
立的， 因此 这一前 提 条件 已经 在很 大程度 上 限制 了该方 法 的广 泛应 用 ； 基 因组 Ｄ ② ＮＡ 的准确 定 量［５， ４］ 而通 － 过测定 ＤＮＡ 的质量 来确 定基 因组 的总数 总是增 大 了操作 上 的误差 。另一 种 则是 以基 因组 上 已知拷 贝数 的 内源基 因作 为 内参 ， 过相 对 定量法 来 确 定 外源 基 因 的拷 贝数 ］ 通 。即 建 立 内参 基 因 的 Ａ 法 就 能 克 服第 Ｃｔ
０ 引 言
利用 实时荧 光定 量 Ｐ Ｒ 的方法 来检 测外 源基 因 的拷 贝数 是 近 几 年迅 速 发 展起 来 的新 方法 ， 以快速 、 Ｃ 它 安全 、 成本 低等优 点 渐渐取 代 了价格 昂贵 、 时 费力 的 Ｓ ｕｈ ｒ ｌｔ 口 ］ 费 ｏ ｔ ｅｎｂｏ 法 。 。在 实 际应用 中该方 法 主要 体 现 在两种 方式 上 ： 种 是 利 用 已知 外 源 基 因 拷 贝数 的 基 因组 作 为标 准 品 ， 过 建 立 标 准 曲 线 来 进 行 绝 对 定 一 通
第 ２ 卷 ７
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的影响[J].土壤,2004,36(1):56-60.[31]彭诚.土壤施硒对白菜和堇叶碎米荠生理指标的影响[J].湖北民族学院学报,2007,25(1):88-90.[32]院金渴,王朴,刘正兴,等.土壤施硒对大蒜生理特性、含硒量及产量的影响[J].新疆农业大学学报,2010,33(1):19-22.[33]周大寨,唐巧玉,陈建英,等.土壤施硒对花椰菜硒质量分数及主要营养成分的影响[J].湖北民族学院学报,2005,23(2):121-123.[34]冶军,单维东,褚贵新.叶面喷施硒肥对大豆产量和质量效应的初步研究[J].新疆农业科学,2009,46(3):506-509.[35]郁飞燕,寇太记,张联合,等.硒对植物生理功能影响的研究进展[J].安徽农业科学,2008,36(26):11202-11204.[36]邵志慧,林匡飞,徐小清,等.硒对小麦和水稻种子萌发的生态毒理效应的比较研究[J].生态学杂志,2005,24(12):1440-1443.[37]贾宏昉,宋家永,王海红,等.硒对作物生理、生长发育及产量、品质的影响研究进展[J].河南农业大学学报,2006,40(4):449-454.[38]苏爱国,陈大清,李亚男.植物硫转运蛋白及其硒盐胁迫响应研究进展[J].长江大学学报,2008,5(1):70-73.[39]王晋民,赵之重,沈增基.叶面施硒对青花菜含硒量及产量与品质的影响[J].西北农林科技大学学报,2006,34(3):127-130.[40]Wang H L,Zhang J S,Yu H Q.Elemental selenium at nano sizepossesses lower toxicity without compromising the fundamental effect on selenoenzymes:Comparison with selenomethionine in mice[J].Free Radical Biology and Medicine,2007,42:1524-1533.[41]Huang B,Zhang J S,Ho J W,et al.Free radical scavengingefficiency of nano-se in vitro [J].Free Radical Biology and Medi-cine,2003,35(7):805-813.[42]周毅峰,吴永尧,唐巧玉.硒对大豆叶片谷肤甘肤过氧化物酶和过氧化氢酶歧化酶活的影响[J].湖北民族学院学报,2005,23(2):127-129.SYBR Green 实时定量PCR 检测转基因大豆中外源基因拷贝数冀志庚，高学军*，敖金霞，张明辉，霍楠（东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，哈尔滨150030）摘要：采用SYBR Green Ιreal-time PCR 方法检测转基因大豆中外源基因35S 边界基因的拷贝数，以大豆凝集素基因（Lectin ）作为内参照基因，以转基因大豆基因组DNA 为内参照基因标准品，初始浓度为0.43μg ·μL -1，进行5倍梯度稀释得到内参照基因C T 值与起始模板量的相关性标准曲线：y =-2.9915x +22.3321，R 2=0.996；以含35S 边界序列的质粒DNA 为目的基因为标准品，初始浓度为0.64μg ·μL -1，同样进行5倍梯度稀释，建立目的基因C T与起始模板量的相关性标准曲线：y =-3.4021x +17.7219，R 2=0.999。
通过SYBR Green Ιreal-time PCR 获得样本中目的基因和内参基因的C T 值，将C T 值分别代入标准曲线计算该样本中内参基因和目的基因起始模板量，目的基因与内参基因起始模板量比值即是目的基因在该转基因中的拷贝数。
计算结果为4份样品中，2个拷贝的1个，3个拷贝的3个。
关键词：real-time PCR ；SYBR Green Ι；转基因大豆；拷贝数；Lectin ；35边界序列中图分类号：S565.1；Q78文献标志码：A文章编号：1005-9369（2011）10-0011-05Establishment of SYBR Green-base quantitative real-time PCR assay for determining transgene copy number in transgenic soybean/JI Zhigeng,GAO Xuejun,AO Jinxia,ZHANG Minghui,HUO Nan(Life Science and Biotechnique Research Center,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)收稿日期：2010-10-28基金项目：国家转基因重大专项课题（2008ZX08012-001）作者简介：冀志庚（1984-），男，硕士研究生，研究方向为转基因作物检测。
E-mail:hanbo001@ *通讯作者：高学军，教授，博士生导师，研究方向为转基因检测。
E-mail:gaoxj5390@ Journal of Northeast Agricultural University东北农业大学学报第42卷第10期42(10):11~152011年10月Oct.2011实时荧光定量PCR 技术是一种新的DNA 定量方法[1]。
其定量的基本原理是在PCR 反应体系中加入非特异性的荧光染料（如SYBR Green ）或特异性的荧光探针（如Taqman 探针）[2]，实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数—C T 值（Cycle threshold ）；根据C T 值与起始模板数的对数值成反比线性关系的原理，制作标准曲线，就可知道基因线，获得C T 值与起始模板数的相关性方程，将样品的C T 值代入该方程就可获得目的基因的起始模板数，通过与大豆内源参照基因起始模板数的比较，就可知道基因组中该外源基因拷贝数[3]。
本研究以抗草甘膦（CP 4-EPSPS ）转基因大豆为材料，以CaMV35S 边界序列为外源基因，避免以CaMV35S 和nos 为外源基因出现假阳性。
选择大豆凝集素基因（Lectin ）作为内源参照基因进行拷贝数估算，通过SYBR Green Ι实时荧光定量PCR 法检测转基因大豆中CaMV35S 基因的拷贝数。
1材料与方法1.1材料转基因杂交大豆（由东北农业大学大豆研究所提供），非转基因大豆（购自某超市）；阳性质粒（本实验室构建）；TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit （Code No.:DRR015）SYBR Premix EX Taq TM （Code No.:DRR041S ）购自大连宝生物工程有限公司；ABI实时定量荧光PCR 仪（ABI7300），96孔扳（AXYG-EN ）。
1.2方法1.2.1DNA 提取转基因大豆基因组DNA 采用CTAB 法提取[4]，用分光光度计检测DNA 含量及纯度。
内参基因标准品选用转基因大豆基因组DNA ，浓度为0.43μg ·μL -1，稀释倍数分别为50、5-1、5-2、5-3和5-4。
以含35S 边界序列的质粒DNA 为标准品，浓度为0.64μg ·μL -1，稀释倍数分别为50、5-1、5-2、5-3和5-4。
以Lectin 作为大豆的内参基因，以含35S 边界序列的质粒DNA 为阳性对照，未转基因大豆为阴性对照，水为空白对照。
1.2.2CaMV35S 边界序列的获得以转基因大豆基因组DNA 为模板，利用染色体步行法（TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit ）扩增CaMV35S 上游序列。
通过测序获得CaMV35S 上游大豆基因组序列。
根据获得的序列设计特异性引物，构建pMD18-T 阳性质粒载体。
1.2.3引物设计及合成转基因大豆内、外源基因的引物由Invitrogen公司合成。
引物序列见表1。
1.2.4PCR 反应体系和程序定量PCR 反应体系：SYBR Premix EX Taq TM（2×）10μL ，PCR 上游引物（10μmol ·L -1）0.4μL ，PCR 下游引物（10μmol ·L -1）0.4μL ，ROX Re-ference Dyer （50×）0.4μL ，模板2.0μL ，灭菌蒸馏水6.8μL ，总体积20μL 。
PCR 程序（采用两步法PCR 扩增程序）：预变性95℃30s ；95℃5s ，60℃31s ，40个循环。
5个不同稀释度的内参照基因标准品，5个不同稀释Abstract:SYBR Green Ιreal-time PCR was developed to determine copy number of exogenous 35S/plantgene in transgenic soybean.A conserved soybean housekeeping gene,Lectin was used as an internal contral and 5times diluted soybean genome DNA was used as an initial template copy of Lectin .So y =-2.9915x +22.3321,R 2=0.996,the standard curves of the cycle threshold (C T )relative to the log of each initial template copy of Lectin was obtained.In the same way,the standard curves of 35S/plant y =-3.4021x +17.7219,R 2=0.999,was obtained using 5times diluted plasmid DNA which contains 35S/plant gene.By SYBR Green Ιreal-time the C T values of Lectin and 35S/plant gene in each transgenic soybean was got,the transgene copy number was calculated by comparing the initial template copy of 35S/plant to Lectin gene in the same transgenic soybean.It concluded that among four PCR putative transgenic plants:one had two copies,and the other had three copies,respectively.Key words:real-time PCR;SYBR Green Ι;transgenic soybean;copy number;Lectin ;injection sequence of35S东北农业大学学报·12·第42卷度带有目的片段的质粒DNA ，空白对照同时进行扩增，均设3个平行。