112细菌内毒素检查法研究中应注意的几个方面
浅析细菌内毒素检测方法及常见问题
凝胶
14
名词解释1—鲎及鲎试剂
鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物 门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一 带。
鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机 械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物， 能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应 的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体 外检测内毒素的敏感试剂。
5.吸附性
能被活性炭吸附剂吸附。内毒素在溶液中带有 一定的电荷，因而可被某些离子交换介质吸附。
精选课件
7
❖热原=内毒素 ？
热原指微生物产生的某些多糖蛋白复合物 等使人体发热的物质，不仅仅是细菌内毒素。
但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热 原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒
素就是控制热原。
精选课件
凝胶法：
内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；
故：灭菌注射用水≠细菌内毒素检查用水
光度法：
内毒素含量应小于0.005EU/ml；
精选课件
18
细菌内毒素检测之凝胶法
❖ 实验程序 1、试验准备：试剂、仪器及用具 2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度 3、鲎试剂灵敏度复核 4、供试品干扰试验（新药或新方法） 5、供试品细菌内毒素凝胶法检测
浅析细菌内毒素检测方法及常见 问题
精选课件
1
内容 ❖细菌内毒素简介
❖细菌内毒素检测方法
❖常见问题及解决方案
精选课件
2
一、细 菌 内 毒 素 简 介
❖ 主要内容
—— 来源 —— 特性 —— 与热源的关系 —— 在药检中应用
精选课件
3
❖ 主要来源
主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自 溶后便会释放出内毒素，其化学成分主要是脂多糖， 这是一种大分子物质，分子量约为106，其粒径约 在1~ 5纳米 。
细菌内毒素检查法应用指导原则
细菌内毒素检查法应用指导原则细菌内毒素检查法应用指导原则1. 引言在当前社会背景下，食品安全问题备受关注，并且细菌内毒素作为食品中的一种重要污染物质也越来越受到重视。
为了确保食品的安全性，细菌内毒素检查成为一项非常重要的工作。
本文将从深度和广度的角度来评估细菌内毒素检查法的应用指导原则，并根据该主题进行讨论。
2. 细菌内毒素检查法的概述细菌内毒素是由细菌产生的一种有毒物质，它们可以污染食品并对人体健康造成潜在威胁。
细菌内毒素检查法的应用非常重要。
该方法一般包括样品准备、提取和分析等步骤。
通过采用适当的检测技术和方法，可以准确可靠地检测细菌内毒素的存在和含量。
3. 细菌内毒素检查法的准备工作在进行细菌内毒素检查之前，必须进行一些准备工作。
需要确定检测的细菌种类和内毒素类型，以便选择适当的检测方法。
样品的收集和保存也是一项关键工作，应该注意避免污染或降解。
还需要准备相关的实验室设备、试剂和标准品等。
4. 细菌内毒素检查的主要技术方法目前，细菌内毒素检查主要采用生物学方法和化学方法两种主要技术。
生物学方法包括毒素制备、生物学活性试验和鉴定等步骤，通常用于细菌内毒素的初步筛查。
而化学方法则依靠物质的化学性质或光学性质来进行分析和检测，常用的方法包括高效液相色谱法、气相色谱法和质谱法等。
5. 细菌内毒素检查的应用指导原则为了保证细菌内毒素检查的质量和准确性，应遵循以下应用指导原则：5.1 样品选择：应根据实际情况选择适当的样品进行检测，要注意样品的来源、存储和处理方式。
5.2 样品制备：样品必须按照规定的方法进行提取和制备，确保细菌内毒素的稳定性和提取效率。
5.3 适当的检测方法：应根据细菌种类和内毒素类型选择适当的检测方法，确保检测结果的准确性和可靠性。
5.4 外部质量控制：在进行细菌内毒素检查时，应严格遵循外部质量控制的要求，包括使用标准品进行校准和内毒素的稀释等。
5.5 结果解释和评估：在得到检测结果后，需要对结果进行解释和评估，确保对检测结果的理解和使用是正确的。
《细菌内毒素检查》课件
其他检测方法
热原质鲎试剂盒法
利用鲎试剂与内毒素结合后加热，通 过凝胶形成或浊度变化来检测内毒素 的含量。该方法适用于注射剂、输液 等样品。
高效液相色谱法
利用高效液相色谱技术分离内毒素， 通过紫外吸收或荧光检测器来检测内 毒素的含量。该方法适用于生物制品 、血液制品等样品。
03
细菌内毒素检查的应用
实验后的处理和安全防护
废液的处理
实验后产生的废液应按照实验室规定进行处理， 不得随意倾倒或排放。
实验垃圾的处理
实验后产生的垃圾应按照实验室规定进行分类和 处理。
ABCD
仪器的清洗和维护
实验后应对使用的仪器进行清洗和维护，以确保 其性能和精度。
个人防护
实验人员应穿戴个人防护装备，如实验服、手套 、口罩等，以降低交叉污染和感染的风险。
饮用水监测
01
通过细菌内毒素检查，可以检测饮用水中的细菌内毒素含量，
确保饮用水安全。
污水处理监测
02
在污水处理过程中，对出水进行细菌内毒素检查，可以评估污
水处理效果和出水质量。
环境样品监测
03
对土壤、空气等环境样品进行细菌内毒素检查，可以了解环境
中的细菌污染状况，为环境治理提供依据。
04
细菌内毒素检查的注意事 项
开发新型检测方法和技术
开发多组分检测技术
将多种细菌内毒素相关分子同时纳入检测范围，实现多组分的同 时检测，提高检测效率和准确性。
开发新型免疫学检测方法
利用新型免疫学技术，如单克隆抗体、免疫磁珠等，提高检测的特 异性和灵敏度。
开发新型生物信息学技术
利用生物信息学手段，对细菌内毒素相关基因和蛋白质进行高通量 筛选和鉴定，为新型检测方法的开发提供有力支持。
血站细菌内毒素检测应注意的几个问题
血站细菌内毒素检测应注意的几个问题一．内毒素单位内毒素单位不能采用pg/ml在80年代以前，所有研究内毒素的报道，均使用重量单位表示内毒素的量。
随着人们对细菌内毒素生物活性的不断研究，认识到不同来源的内毒素，相同重量的内毒素，其生物活性相差很大。
•1980年，美国学者Hochstein完成了将重量单位转化为内毒素单位的工作。
•当时美国内毒素参考品为EC2，该参考品的家兔发热剂量ED50为1.04ng/kg，EC2与美国第四批鲎试剂参考品（美国FDA批准）的反应终点浓度为0.194ng/ml(四个试验室56批数据的几何平均值)， FDA规定该值为EC2的1个内毒素单位， EC2的量值为5EU/ng。
•1987年WHO建立第一批国际内毒素标准品(84/650,14000IU)。
•1996年WHO建立第二批国际内毒素标准品(94/580,10000IU)，规定1IU=1EU。
•981是用IS2为基准标定的我国第6批国家标准品。
2005年版中国药典《细菌内毒素检查法》中明确指出，细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
二．标准品的来源2005年版中国药典《细菌内毒素检查法》中明确指出：细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
2005年版中国药品检验标准操作规范《细菌内毒素检查法》中明确指出：细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品，除另有规定外，应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。
三．样品的稀释细菌内毒素实验中样品每步稀释的倍数不应大于10倍，否则会影响实验的准确性。
四．样品的预处理过程不同厂家生产的血液保存液PH会略有不同，举例：血液保存液ⅠPH范围是4.5～5.5，血液保存液ⅡpH值 4.5～5.5，红细胞保存液pH值范围是5.0～6.0。
浅析细菌内毒素检测方法及常见问题
故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡
❖ 主要特性（实验器材处理方法）
3.水溶性与不挥发性
热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸 气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。
故：不可用湿热灭菌法处理实验器具
❖ 主要特性（去除内毒素方法）
4.滤过性
原体积很小，约在1～5 nm之间，故能通过除 菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不 能通过半透膜。
名称
天平
电热干燥箱 恒温水浴箱
水银或酒精温度计
漩涡混合器
计时器
2、器具
器具分类
要求 感量0.1mg以下
～300℃ 37±1 ℃ ～100 ℃±1 ℃
/ 60min±1min
器具名称
反应试管
玻璃试管（外径10×75mm）、试管架、 小三角瓶或磨口瓶
移液器具 刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头
其他
酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、 封口膜、记号笔
❖ 与热源对比内毒素检查法优势
❖ 方便、快捷、经济； ❖ 重现性好、灵敏度高； ❖ 避免抗原的产生，克服生物测定的误差；
近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热源 法
❖ 在药检中的应用
细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法 ，已经广泛的被世界各国药典收载。
❖ 成品检查——药品安全性检查之一
3、加样：每列每支加入相应浓度的内毒素标准品溶液各0.1ml ，第五列加入BET水0.1ml。
2λ
λ
0.5λ
0.25λ
2λ
λ
0.5λ
0.25λ
2λ
λ
0.5λ
0.25λ
2λ
λ
0.5λ
《中国药典》9251 细菌内毒素检查法应用指导原则
《中国药典》9251细菌内毒素检查法应用指导原则《中国药典》9251细菌内毒素检查法应用指导原则包括以下几个方面：
1.细菌内毒素检查法主要用于临床诊断中，可以辅助判断细菌感染的程度和危险程度，对临床治疗方案的选择和预后评估具有重要意义。
2.在应用细菌内毒素检查法时，应考虑到各种药品的特性和使用方法，以确保结果的准确性和可靠性。
3.在进行细菌内毒素检查时，应严格遵守操作规程，确保实验过程的标准化和规范化。
4.对于细菌内毒素的检测结果，应结合其他实验室检查结果和临床表现进行综合分析，以得出正确的诊断结论。
以上信息仅供参考，建议查阅《中国药典》获取更全面准确的信息。
内毒素
旋涡混合器上混合15分钟，以后的每一步稀 释前要至少混合30秒，其他国家药典也有类 似要求； 具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均 匀分布 不按要求进行旋涡混合会使所稀释的内毒 素效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对 照不凝等不正确的实验结果
世界上现存鲎的种类
鲎是一种海洋无脊椎动物，蓝色的血液。
2 、本试验操作过程应 试验操作过程应防止微 防止微生物和内毒素的 生物的污染 污染
2010版
3 、1EU与1个内毒素国际单 位（IU）相当
2005年版
----
4、常用干热灭菌法（250℃、 常用的方法是在250 ℃干烤至少 30分钟以上）去除 60分钟 5、删除 对于过酸、过碱或本身有缓冲能 力的供试品，需调节被测溶液 （或其稀释液）的pH 值，可 使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂 家推荐的适宜的缓冲液调节pH 值。
实验基本流程图
供试品 限值确定
最大有效稀释 倍数确定
正式实验
供试品干扰实验
结果判断
2. 试剂、仪器设备等
细菌内毒素检查法所应用的 试剂，主要包括：鲎试剂、细菌 内毒素检查用水、细菌内毒素工 作标准品等。
国内鲎试剂的生产情况
安度斯生物技术有限公司 湛江海洋生物制品厂 福州新北鲎试剂厂 厦门鲎试剂厂 福州东方鲎试剂厂 福州平潭东方鲎试剂厂 广西北海鲎试剂厂
细菌内毒素工作标准品(CSE)
细菌内毒素工作标准品系以细菌内 毒素国家标准品为基准标定其效价， 用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干 扰试验及各种阳性对照。
仪器设备与实验器具
分析天平 超净工作台 细菌内毒素检查专用干式恒温器 电热恒温干燥箱 旋涡混合器
细菌内毒素检验注意事项
德州市药品检验所
简 介 实验介绍：凝胶法 光度测定法 实验涉及内容及相关要
简介
细菌内毒素具有： 耐热性： 不易灭活（180℃、2小时；250℃、 30分钟） 分子极性： 易聚集、吸附，需充分混合 高致热性： 作用于人体，会引起发热、寒战、 休克、甚至死亡
细菌内毒素检查方法的分类
凝胶限度试验
凝胶限度试验
凝胶法
干扰作用
凝胶法
凝胶法
鲎试剂灵敏度复核：当使用新批号的鲎试剂或 实验条件发生了任何可能影响检验结果的改变 时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 干扰试验：当进行新药的内毒素检查试验前， 或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查时， 须进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的处方、 生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能 影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
鲎试剂灵敏度复核试验
鲎试剂灵敏度复核试验
试验有效
鲎试剂灵敏度复核试验
鲎试剂灵敏度复核试验
鲎试剂灵敏度复核试验
凝胶限度实验—日常检查
1、限值的确定
1、计算最大有效稀释倍数
2、供试品溶液的制备
3、检查法—凝胶限度试验
度试验
凝胶限度试验
凝胶限度试验
细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题重点
细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题摘要：本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。
在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。
以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法，对于早期研发阶段的药物，应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。
此外，在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量，为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。
一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时，首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径，计算和确定样品的内毒素限值，选择合适的鲎试剂，根据临床规格，计算最大有效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。
可以采用凝胶法，也可以采用终点法或动态法。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。
1、细菌内毒素限值的确定一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值的要求？样品的内毒素含量具体是多少？这些问题不但关注用药安全，还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息，为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。
尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程，但其最终目的还是要为控制药品质量服务。
因此，在方法建立时，不但要阐明限值的合理性，考虑技术可能达到的限值，同时还要满足相关药品管理法规的要求。
研究人员在建立方法的早期，一般会按照临床建议的最大人用剂量确定一个非正式的限值，这个限值可以根据实验室可以达到的最低检测水平，把限值订的相对比较严格，但往往由于早期的临床剂量会比最终上市的临床剂量高几倍，所以严格的限值，可能会使得正式生产时很多产品不能通过检查，从而造成不必要的浪费；因此参按照法规允许的最高水平，酌情确定样品的限值。
细菌内毒素检查法研究中应注意的几个方面
细菌内毒素检查法研究中应注意的几个方面摘要：本文通过审评中发现的一些问题，结合药品检验的工作实际，对细菌内毒素进行方法学验证的重要性、必要性以及在技术审评中应关注的几个方面进行了全面阐述。
关键词：细菌内毒素、药品申报、技术审评热原检查法和细菌内毒素检查药典附录并没有统一的给药剂量和标准限度，均在各品种项下具体规定，故是否能有效地保证临床用药的安全性，其标准限值是我们在制订质量标准时首先要关注的。
对于内毒素限值的确定，药典附录有相应计算公式，即当今世界各国普遍采用的细菌内毒素计算公式，即：L=K/M，式中K为按规定给药途径，人每公斤体重每小时可以接受的不产生任何不良反应的细菌内毒素剂量（亦称致热阈），它基本上是一固定值，药典上对每一给药途径的K值都有具体的规定。
M为按规定的给药途径，人每公斤体重每小时给药的最大剂量。
这一个值的确定实际上才是计算限值的关键。
原则上一般根据药品使用说明书来确定最大剂量。
通常以一次剂量为准，如注明输2小时，则除以2，否则均以1小时为准；不足1小时的，也以1小时计；如未给出一次剂量，而是一日剂量，如一日2～4g，分2～4次用，这种情况以计算后的最大剂量，即2 g/次计算。
用法用量中有成人剂量、儿童剂量、重症剂量时，要体现出最大剂量。
通常儿童剂量以Kg计算时大于成人剂量，所以，此时应用儿童剂量，因为儿童与重症病人更易出现问题，故应更严格。
用于感染、肿瘤、心血管、中枢疾患易感的药物建议加上安全系数。
复方、输液、工艺易污染者从严，大输液一般计为0.5EU/ml。
有时候，细菌内毒素限值也以国外药典为参考，甚至就直接采用国外药典的限值。
这一点在实际应用的时候，必须从中国的临床用药的实际出发，不能不加区分地把同品种中国外药典规定的限值移至中国药典，总的原则是，对这一类国外药典已建立细菌内毒素检查法的品种，原则上要求将国外药典规定的限值与按公式计算出的数值进行比较，一般应以严格者为该品种的限值。
细菌内毒素检测方法建立
细菌内毒素检测是确保药品、生物制品和医疗器械等产品安全的重要环节。
在建立细菌内毒素检测方法时，需遵循国家相关药品检测标准，如《中国药典》等规定，确保检测方法的准确性和可靠性。
以下是建立细菌内毒素检测方法的一些关键步骤：
1. 方法选择：根据检测样品的特性和预期用途，选择合适的检测方法。
目前常用的方法包括凝胶法、动态浊度法和显色基质法等。
2. 鲎试剂选择：选择合适的鲎试剂是检测过程中的关键。
鲎试剂的质量直接影响到检测结果的准确性。
3. 检测限度的确定：通过方法学验证，如准确度、精密度、专属性、定量限、线性、范围和耐用性等试验，来确定检测方法的检测限度。
4. 干扰因素分析：分析样品在检测过程中可能存在的干扰因素，如样品中的蛋白质、脂多糖等成分可能对检测结果产生影响。
5. 方法学验证：对所建立的方法进行验证，确保其准确度、精密度、专属性等满足检测要求。
6. 样品适应性验证：对不同样品进行适应性验证，确保方法的可重复性和稳定性。
7. 结果判定：根据检测结果，结合相关标准和规定，对样品中的细菌内毒素进行判定。
8. 质量控制：在整个检测过程中，需严格控制实验条件，如温度、时间等，确保检测结果的准确性。
9. 数据记录与分析：详细记录实验数据，进行统计分析，确保数据的完整性和可追溯性。
建立细菌内毒素检测方法是一个复杂且严谨的过程，需要专业知识和技能。
同时，检测人员需具备一定的实验操作能力和理论知识，以确保检测工作的顺利进行。
2008 无菌_微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析_国明
中国药品标准 2008年第 9卷第 1 Nhomakorabea 47以减少膜的吸附, 对于抑菌性较强的注射用无菌粉 末或固体原料, 一定要充分溶解、混合均匀。 114 加菌时机不一致
验证试验主要考虑滤器中残留抗菌物质对阳性 菌生长的影响, 应与对照滤器比较而作出判断, 所以 验证试验中加菌时机要与对照一致 [ 2] 。
115 薄膜过滤法滤膜材质选择不正确, 直接影 响试验结果
20 05年 版药 典执 行以 来药 品 生 产企 业 、科 研 单 位等 在药品质量标准建立及检验工作中困难和问题较多 的项目。我们在药品注册品种的审核检验中, 发现 有的申报单位对方法学验证的意义理解不够, 验证 试验的科学性、完整性及可操作性均存在着很多问 题。为尽快提高方法学验证水平, 更好地保证用药 的安全性, 现将方法学验证工作中常遇到的问题进 行分析、讨论。 1 无菌检查方法学验证问题及分析 111 验证菌株选择不正确 11111 敏感菌株与阳性对照菌不一致, 降低了阳性 对照菌的意义。有些药品选择了敏感菌株进行方法 学验证试验, 但是无菌检查时阳性对照菌不是验证 试验选定的敏感菌株。实际工作中抑制枯草芽孢杆 菌的样品很多, 可用此作为敏感菌株, 但药典规定无 菌检查时以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌, 使金 黄色葡萄球菌失去了阳性对照菌的意义。应在此类 无菌检查时也增加敏感菌株作为阳性对照菌。 11112 2005年版药典无菌检查中规定 / 抗革兰阴 性菌为主的供 试品以大肠埃希菌为对照菌 0, 但方 法学验证规定用菌株没有大肠埃希菌, 缺少了验证 此类药物抗菌作用的代表菌株。建议对抗菌作用中 明确具有抗革兰阴性菌的药品进行无菌检查方法学 验证时, 应增加大肠埃希菌作为验证菌株。 112 验证时取样量不符合要求 11211 无菌检验量与验证试验的取样量不同, 与中 国药典 2005年版方法学验证要求不符。进行供试 品检查时, 所采用的检验方法和检验条件应与验证 的方法相同, 应按照规定的检验数量和检验量取样。 11212 有的生产单位无菌检查方法学验证仅按抽 验产品检验数量进行验证, 药典规定应按照批出厂 产品最少检验数量进行试验 [ 1] 。 113 方法选择错误或不恰当, 不符合 2005 年版中 国药典要求 11311 有的申报单位无菌检查时无论什么药品都 用直接接种法。 2005年版中国药典规定, 只要供试 品性状允许, 应采用薄膜过滤法 [ 1] 。 11312 有些申报单位对非抑菌性供试品也用大量 的冲洗液冲洗, 如每次 100 mL, 10次 /膜, 既增加了 对膜的损伤和对微生物生物特性的破坏机会, 也增 加了检验繁琐性和检验人员的工作量。所以薄膜过 滤时尽 可能 减少 冲 洗量, 冲 洗 不一 定 为每 次 100 mL, 可少量多次, 并注意充分振摇。对于抑菌性较 强的供试品, 可以先用适宜的稀释液稀释后再过滤,
内毒素检查法
2.9细菌内毒素检查用水 2.9细菌内毒素检查用水 2005年版中国药典规定细菌内毒素检查用 2005年版中国药典规定细菌内毒素检查用 水系指与灵敏度0.015EU/ml或更高灵敏度 水系指与灵敏度0.015EU/ml或更高灵敏度 的鲎试剂24h不产生凝集反应的灭菌注射用 的鲎试剂24h不产生凝集反应的灭菌注射用 水。 3 细菌内毒素的化学结构、量值和限值 3.1化学结构 3.1化学结构 细菌内毒素的本质是脂多糖（LPS)，主要 细菌内毒素的本质是脂多糖（LPS)，主要 有两部分组成：多糖和类脂A 有两部分组成：多糖和类脂A。多糖部分又 可进一步分为O 可进一步分为O-特异性多糖链、核心寡聚 糖。O 特异性脂多糖一般由3 糖。O-特异性脂多糖一般由3-6个单糖通过 糖苷键相联形成低聚糖单位聚集而成，是 LPS分子中最易变异的成分。 LPS分子中最易变异的成分。
1.2 细菌内毒素在我国的发展
在我国，1975年开始鲎试剂的研制，1979年开始 在我国，1975年开始鲎试剂的研制，1979年开始 将其用于放射性药品的细菌内毒素检查方法研究， 1983年开始用于输液制剂热原检查的协作研究。 1983年开始用于输液制剂热原检查的协作研究。 1988年卫生部颁布细菌内毒素检查法，允许4 1988年卫生部颁布细菌内毒素检查法，允许4种 药品采用细菌内毒素检查法作为热原检查的初试 方法；1993年中国药典1990年版第二增补本开始 方法；1993年中国药典1990年版第二增补本开始 收载细菌内毒素检查法。1995年版中国药典规定 收载细菌内毒素检查法。1995年版中国药典规定 13个品种进行细菌内毒素检查法。2000年版药典 13个品种进行细菌内毒素检查法。2000年版药典 规定60个品种进行细菌内毒素检查法。2005年版 规定60个品种进行细菌内毒素检查法。2005年版 药典规定133个品种进行细菌内毒素检查法。 药典规定133个品种进行细菌内毒素检查法。
细菌内毒素检查操作规程
细菌内毒素检查操作规程细菌内毒素检查操作规程一、实验目的细菌内毒素检查是为了检测样本中是否存在细菌产生的内毒素，可以作为细菌感染的诊断依据和治疗效果评估的指标。
二、实验材料和设备1. 细菌培养基和培养物2. 内毒素检测试剂盒3. 显微镜和载玻片4. 离心机5. 温箱和恒温水浴6. 试管、培养皿、移液器等常规实验用品三、实验步骤1. 培养细菌：将待检测的细菌接种到适当的培养基上，放入温箱中以适当的温度和时间进行培养，使细菌生长至对应的生长期。
2. 收集细菌：将培养好的细菌转移到离心管中，使用离心机将细菌离心沉淀。
3. 细菌裂解：将细菌沉淀加入合适的裂解缓冲液中，使用适当的方法将细菌完全裂解。
4. 澄清液分离：使用离心机将细菌裂解液离心，将上清液转移到新的试管中。
5. 内毒素检测：按照内毒素检测试剂盒说明书的要求，将所得上清液加入试剂盒中，进行内毒素的检测。
6. 结果解读：根据试剂盒的指示，观察试剂盒中的颜色变化或读取光密度等指标，判断样品中是否存在细菌内毒素。
7. 结果验证：使用正负对照样品验证结果的准确性和可靠性。
四、实验注意事项1. 实验过程需要遵守无菌操作的要求，避免细菌污染。
2. 实验中使用的试剂和培养基要在有效期内，并按照要求保存。
3. 实验过程中应注意个人防护，避免接触到有害物质。
4. 操作前要充分了解试剂盒的使用方法和读取结果的标准。
5. 结果解读时要考虑到阳性和阴性对照的结果，以免误判。
6. 使用的设备要事先进行验证和校准，以保证实验结果的准确性和可靠性。
五、实验结果记录和分析1. 记录实验所使用的试剂批号和有效期。
2. 记录实验过程中的注意事项和操作细节。
3. 记录实验结果，包括阳性和阴性对照的结果。
4. 对实验结果进行分析和解释，判断样品中是否存在细菌内毒素。
六、实验结果的报告和存档1. 编写实验报告，包括实验目的、材料和方法、结果分析、结论等内容。
2. 报告中要附带实验记录、数据分析和结果验证等材料。
细菌内毒素检查法
二、2010年版《中国药典》细菌内毒 素检查法增修订情况
2010版与2005版区别
修订背景
注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查
法指导原则
2010版与2005版区别
2010版 1、细菌内毒素检查用 水系指内毒素含量小于 0.015EU/ml（用于凝 胶法）或0.005EU/ml （用于光度测定法）且 对内毒素试验无干扰作 用的灭菌注射用水 2005年版 凝胶法细菌内毒素检查 用水系指内毒素含量小 于0.015EU/ml的灭菌 注射用水。光度测定法 用的细菌内毒素检查用 水，其内毒素的含量应 小于0.005EU/ml
种类以及分布： – 美洲鲎：北美洲东岸海域 – 中国鲎：中国东南沿海 – 南方鲎：泰国和马来群岛海域 – 圆尾鲎：东南亚西部海域
鲎试验的发现
1956年Johns Hophins 大学动物学家 Frederik. Bang发现革兰阴性细菌的粗制品 能使鲎的血细胞凝聚。
1963～1964年 Jack.Levin和Bang对细菌引 起鲎血凝聚进行研究，用内毒素和鲎血细胞 溶解物证明鲎血凝聚机制是一种酶反应。
实验基本流程图
供试品 限值确定
最大有效稀释 倍数确定
正式实验
供试品干扰实验
结果判断
2. 试剂、仪器设备等
细菌内毒素检查法所应用的 试剂，主要包括：鲎试剂、细菌 内毒素检查用水、细菌内毒素工 作标准品等。
国内鲎试剂的生产情况
安度斯生物技术有限公司 湛江海洋生物制品厂 福州新北鲎试剂厂 厦门鲎试剂厂 福州东方鲎试剂厂 福州平潭东方鲎试剂厂 广西北海鲎试剂厂
2005年版
内毒素限值按L=K/M计算， M为人用每公斤体重每小 时的最大供试品剂量，以 ml/（kg²h）、mg/ （kg²h）或U/（kg²h） 表示，人均体重按 60kg 计算，注射时间若不足1 小时，按1小时计算。
细菌内毒素检测试验注意事项与误差分析
董光宴 工程师
一、实验注意事项
二、影响试验结果的因素分析
湛江博康海洋生物有限公司
2014年10月24日 博康 1
一、试验操作注意事项
——2010年版《中国药品检验标准操作规程》P310细菌内毒素检查法
实验前，须用肥皂洗手，用 75 ％酒精棉球消毒。
2014年10月24日
博康
32
2） PH值对反应速度的影响 常见现象：样品阳性不成立。 鲎试剂与内毒素反应的最适宜 pH 在 6.5-8.0 ； pH ≤3 或≥ 10 时， 酶活性受到抑制。
相 对 活 力
7.0
PH
2014年10月24日
博康
33
在使用洗耳球、移液管取样时，应注意不要将 洗耳球中的气体吹入溶液中，以防止气体中的内 毒素进入供试液。 复溶0.5ml鲎试剂时，在旋涡混合器上点击1～3 秒，促进鲎试剂的溶解。
2014年10月24日
博康
2
由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程 中及观察结果时应注意不要使试管受到振动， 以免使凝胶破碎产生假阴性结果。 进行干扰实验时，标准对照系列和含内毒素 的供试品溶液系列应同时进行，并使用同一支 细菌内毒素标准品。
2014年10月24日 博康 19
2） 湿度
吸潮
灵敏度增高 挥发
2014年10月24日
博康
20
5 实验器皿
器皿的计量管理（校正）
器皿的选择标准 器皿的正确处理
2014年10月24日
博康
21
1） 器皿的选择标准
2014年10月24日
博康
4
二、影响试验结果的因素分析
鲎试剂
细菌内毒素检查注意
细菌内毒素检查法的正确理解·如何全面理解细菌内毒素检查法中污染物对试验结果的影响？·如何正确认识器皿洗涤的重要性？·如何正确理解鲎试剂的抗干扰能力和鲎试剂的特异性？许多客户对污染的认识是不全面或错误的，他们认为在细菌内毒素检查过程中，器皿被污染的结果必然导致阳性结果的出现，但试验结果正好与他们的认识有时正好相反，可能阳性对照全为阴性，对此亦有百思不得其解。
要正确理解这个问题，首先要正确理解鲎试剂与内毒素的反应机理，鲎试剂与内毒素的反应为一系列酶反应，生物酶反应受许多因素的干扰。
在日常工作中，我们要特别注意一些因素对试验结果的影响，如PH值、器皿的洁净度以及环境因素等。
图1 鲎试剂与内毒素的反应机理1、PH值：鲎试剂生物活性在pH 6-8时酶活性稳定；pH ≤3 或≥10时，酶活性受到抑制。
故鲎试验时，供试品 pH 最好应预调和6.8-8.0 为好，必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀溶液调节 pH 值。
2、器皿：内毒素稀释不宜用注射器，而应用经过校正的刻度玻璃吸管。
因为注射器刻度准确度差，而且针栓壁磨沙面易吸附内毒素，试验误差大。
同时要特别注意注射器针头引入的铁离子对试验结果的干扰，铁离子对鲎试验反应有较强的抑制作用。
操作中常用的聚丙烯塑料管可能干扰试验结果，故宜慎用。
3、金属阳离子：离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面阳离子如Fe3+、Al3+强度较大会引起内毒素的聚集造成内毒素局部浓度过高，同时还必须注意高价阳离子（如Fe3+）对鲎试剂酶反应具有强抑制作用；另一方面鲎试剂必须在二价阳离子Ca2+、Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应。
许多药物因PH值≥10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的 Ca2+、Mg2+离子，使实验呈假阴性。
4、其它物质：如血液中的凝血因子、络合剂、抗凝剂等，都可能干扰鲎试剂与内毒素的反应，同时消毒剂和有机溶剂对鲎试验都有抑制作用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
发布日期20060822
栏目化药药物评价>>化药质量控制
标题细菌内毒素检查法研究中应注意的几个方面
作者李霞张哲峰
部门
正文内容
审评三部李霞张哲峰
摘要：本文通过审评中发现的一些问题，结合药品检验的工作实际，对细菌内毒素进
行方法学验证的重要性、必要性以及在技术审评中应关注的几个方面进行了全面阐述。
关键词：细菌内毒素、药品申报、技术审评
热原检查法和细菌内毒素检查药典附录并没有统一的给药剂量和标准限度，均在各
品种项下具体规定，故是否能有效地保证临床用药的安全性，其标准限值是我们在制
订质量标准时首先要关注的。
对于内毒素限值的确定，药典附录有相应计算公式，即当今世界各国普遍采用的细菌内毒素计算公式，即：L=K/M，式中K为按规定给药途径，人每公斤体重每小时可以
接受的不产生任何不良反应的细菌内毒素剂量（亦称致热阈），它基本上是一固定值，药典上对每一给药途径的K值都有具体的规定。
M为按规定的给药途径，人每公斤体
重每小时给药的最大剂量。
这一个值的确定实际上才是计算限值的关键。
原则上一般根据药品使用说明书来确定最大剂量。
通常以一次剂量为准，如注明输
2小时，则除以2，否则均以1小时为准；不足1小时的，也以1小时计；如未给出一次剂量，而是一日剂量，如一日2～4g，分2～4次用，这种情况以计算后的最大剂量，即2 g/次计算。
用法用量中有成人剂量、儿童剂量、重症剂量时，要体现出最大剂量。
通常儿童剂量以Kg计算时大于成人剂量，所以，此时应用儿童剂量，因为儿童与重症病人更易出现问题，故应更严格。
用于感染、肿瘤、心血管、中枢疾患易感的药物建
议加上安全系数。
复方、输液、工艺易污染者从严，大输液一般计为0.5EU/ml。
有时候，细菌内毒素限值也以国外药典为参考，甚至就直接采用国外药典的限值。
这一点在实际应用的时候，必须从中国的临床用药的实际出发，不能不加区分地把同
品种中国外药典规定的限值移至中国药典，总的原则是，对这一类国外药典已建立细
菌内毒素检查法的品种，原则上要求将国外药典规定的限值与按公式计算出的数值进
行比较，一般应以严格者为该品种的限值。
另外以热原剂量作参考的问题，现在原则上已不再考虑热原的剂量。
但大容量输液细
菌内毒素限值为0.5EU/ml，主要是由热原试验中以10ml/kg iv家兔剂量得出的。
细菌内毒素的限值确定后，需要关注的第二个方面就是细菌内毒素方法学研究问题。
在申报资料中，无论是仿制药还是创新药，申请人一般均会提供有关物质、溶出度、
含量测定等主要检测项目的方法学研究资料，而对于细菌内毒素检查，给予的关注似
乎要少得多，而申报资料中提供了这方面资料的也少之又少。
实际上，处方工艺的改变对检测方法所带来的影响，对有关物质、溶出度、含量测定等项目的影响绝对不会比对细菌内毒素检查法带来的影响大，因为，细菌内毒素检查法实际是一种较为特殊的检查方法，中国药典2005年版对什么时候该进行细菌内毒素的干扰试验进行了相关规定【1】：
当进行新药的细菌内毒素检查试验前，或无细菌内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。
当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
所谓干扰试验，换句话说就是方法的可行性试验。
从药典对它的要求可以看出，不论是新药，还是已有国家标准的仿制药，只要须控制细菌内毒素的，有这样一项检查项的，均应在质量研究中对其方法的可行性进行验证。
在以往工作中遇到的一个实例可以对其进行说明，我们曾经对硫酸头孢匹罗这个品种进行标准复核，结果发现不同厂家的硫酸头孢匹罗，几乎相同的含量、相同的工艺，对其细菌内毒素检查所产生的干扰情况却存在较大的差别，通过进一步的试验研究，结果发现造成这种结果最大的可能是由于生产过程中引入的微量杂质的不同所引起的。
这个例子进一步说明了在申报资料中提供细菌内毒素方法学研究资料的必要性。
进行内毒素干扰试验时，首先要确定限值，然后采用至少两个厂家的鲎试剂进行干扰预试验，得到一最大不干扰浓度或最小稀释倍数后，即可用这一最大不干扰浓度进行正式的干扰试验。
预试验一般不要以市售鲎试剂灵敏度计算所得的MVD作为起始浓度来做。
注射液建议以原液来做，粉针剂建议至少往上几个浓度级来做，探索其干扰程度，如没有干扰，方法则更可靠。
在申报资料中经常会看见这种情况：就是研究者直接用灵敏度为0.06或0.03的鲎试剂进行试验，资料中既不交代是否是由于样品有干扰，不能用高于此灵敏度的鲎试剂进行试验，或者是样品没有干扰，实验者手中只有这种灵敏度的鲎试剂，审评人员根本无法根据资料情况判断样品本身是否产生了干扰？其引起干扰的浓度为多少？不产生干扰的样品的浓度又为多少？在此情况下，无法对方法的可行性作出判断。
因为现在市售灵敏度最高的鲎试剂也就是0.03，而前面已经介绍了，生产工艺的细微变化都可能引起其干扰的增加，如果一个样品，原来就只能用0.03灵敏度的鲎试剂进行检测，而这时干扰程度又增加了，则进行检测时，方法已不可行，所以，如果采用稀释法，样品浓度要稀释到必须使用灵敏度为0.06甚至0.03的鲎试剂时，只能说方法的粗放度不够，耐用性不好，最好采用其它手段排除干扰，实在暂时不能排除干扰时，可还是采用经典的热原检查法。
在资料中有时也会看到这种情况，实验者先采用一种灵敏度的鲎试剂（如灵敏度为0.5EU/ml）进行预试验，只做了一个样品浓度，就是灵敏度0.5EU/ml所对应的稀释浓度，结果这一浓度有干扰，接着就采用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂在其相对应的稀
释浓度来进行试验，而前面几个浓度样品有没有干扰，资料中根本无从体现，这种方
法也是不完善的。
资料中还有一种情况是，实验者在预试验时做到样品稀释到30倍即已不产生干扰，但正式试验时，试验者手中只有 0.125EU/ml灵敏度的鲎试剂，则实验者就把样品稀释到其对应的稀释浓度如120倍进行试验，其实这时正确的做法应该是就用30倍的稀释液进行试验。
现在要确定的是什么浓度不产生干扰，对于用什么灵敏度的鲎试剂是没
有影响的，干扰试验与鲎试剂灵敏度无关。
理论上某一浓度无干扰，则对各种灵敏度
的鲎试剂都没有干扰。
只不过使用的鲎试剂过于灵敏，如样品本身内毒素偏高，则容
易产生阳性，故在进行研究工作时，一般使用较低灵敏度的TAL进行试验，如采用
0.5EU/ml或0.25EU/ml灵敏度的鲎试剂，避免由于样品本身所含内毒素所造成的干扰影响。
中国药典2005年版一部也增加了细菌内毒素检查，但中药注射剂进行内毒素检查
要慎重。
由于中药成分比较复杂，干扰因素也多，其中的成分由于原料及提取工艺不同，干扰因素也在变动，确定剂量时，不要单纯用M值，最好加上安全因子。
对于中
药注射剂来说，不光是原料、工艺对细菌内毒素检查有影响，其中所含的鞣质、多糖
等都有影响，也许用热原检查可能更合适。
现在又推出一种新的体外热原试验方法【2】【3】，利用免疫分析方法测定细胞因子（cytokine）以检查药品中污染的热原，这些
细胞因子包含白细胞介素－1、肿瘤坏死因子¦Α、白细胞介素－6和干扰素，目前认为它们是进入体内的热原物质刺激外周血中白细胞释放的具有热原和炎症活性的“内源
性热原”。
这种体外热原试验方法一旦被药典收载，可能会克服中药细菌内毒素检查
中出现的一些弊端。
参考文献：
1、《中国药典》2005年版二部附录Ⅺ E
2、Poole S,et al.Detection of pyrogen by cytokine ncet,1988,(8577):130
3、 Poole S,et al.Assay of pyrogenic contamination in pharmaceuticals by cytokine release.Pharma Europa,1989,(1):17
备注。