实验农杆菌转化烟草和拟南芥
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操作要点
侵染烟草叶片无菌操作注意事项 抗生素的正确使用及抗生素敏感性实验 新鲜的叶片转化效率高 侵染前去除拟南芥已开花和果荚 侵染后筛选再生植株要注意抑制农杆菌生长 侵染后共培养一般为暗培养,1~2d,使农杆菌繁殖迅速,提高转化效率。
实验报告
实验目的 实验原理(简略写) 实验方法 实验结果及分析(最重要) 思考题(最后一次课给)
切勿相互抄袭,支持原创,如有雷同后果自负!
再见
Baidu Nhomakorabea
转基因方法
农杆菌侵染法
基因枪法
农杆菌侵染法
农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系
对单子叶植物不敏感
根癌农杆菌和发根农 杆菌中细胞中分别含 有Ti质粒和Ri质粒, 其上有一段T-DNA, 农杆菌通过侵染植物 伤口进入细胞后,可 将T-DNA插入到植物 基因组中。
T-DNA整合植物基因组的分子机理
植物瞬时表达系统在启动子分析、基因功能分析和生产重组蛋白方面用 途广泛。
Gus基因
gus基因来源于E.coli染色体上的uid A位点。编码β-葡萄糖苷酸酶。 β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶,以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物,其反应 产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背 景活性,因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。 根据gus基因检测所用的底物不同,检测方法有:组织化学法、分光光度 法和荧光法。
Silwet L-77
拟南芥、油菜等转化必须试剂之一,原产地为美国GE公司, Silwet-L77高效有机硅表面活性剂,能够极大的降低水的表面张力(水 的表面张力为72.4mN/m,0.1%的Silwet-L77系列有机硅溶液的表面张 力约为21mN/m),这使Silwet-L77有机硅溶液可轻易湿润几乎所有种类 的叶面,相对于传统助剂,显著提高了在靶标生物的覆盖面.同时,SilwetL77有机硅助剂具有极强的耐水冲刷及渗透能力。Silwet-L77是拟南芥 及其它作物常用的转基因用表面活性剂。
总之,T-DNA的整合是通过植物靶DNA和T-DNA间短的同源区段 发生重组而完成的,在接口附近伴有DNA顺序的转换和重复。
真空浸透法转化拟南芥
农杆菌侵染瞬时转化烟草
注射法瞬时转化烟草
乙酰丁香酮
Vir区基因的活化直接调控着T-DNA的转移,酚类化合物对Vir区基因的活化具 有重要作用。 乙酰丁香酮(Acetosyringone,分子式:HOC6H2(OCH3)2COCH3)AS:
T-DNA在植物染色体中的插入是随机的,可插入任何一条染色体。 插入位点特点: T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点 T-DNA与植物DNA连接处富含A-T碱基对 植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。 但在T-DNA的整合过程中常有植物基因组靶序列的缺失、倒位和重复 等现象,T-DNA的整合一定程度上依赖于植物内源重组系统。
遗传转化中常用的诱导能力较强的一种酚类化合物,乙酰丁香酮之所以 能够提高外植体的转化频率,是因为它可诱导农杆菌Vir基因活化,从而促进 外源基因的整合。 使用方法: 在侵染前4-6h加入液体培养基,使农杆菌既处于对数生长期,又处于vir基 因高度活化状态,从而提高侵染能力 悬浮离心后用植物外植体培养基稀释成侵染液时加入 加在农杆菌和外植体共培养的培养基中,一般农杆菌附着16h后才能进行转 化 在农杆菌液体培养基及共培养基中都加入AS
植物瞬时表达系统
当外源基因导入植物细胞中以后,其表达方式有瞬时表达 (transientexpression)和稳定表达(stable expression)两种。
在瞬时表达状态的基因转移中,引入细胞的外源DNA和宿主细胞染色体 DNA并不发生整合。这些DNA一般随载体进入细胞后12小时内就可以表达, 并持续约80小时左右。在稳定表达状态的基因转移中,导入宿主细胞的DNA 整合到细胞染色体DNA上,以永久形式存在,并可传给后代,形成稳定的转 化细胞。