实验农杆菌转化烟草和拟南芥
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌渗透转化拟南芥
1）取含有重组质粒的农杆菌，在含有相应抗生素的YEP（LB也可以）平板上划线，28℃培养2-3d。
2）取划线的农杆菌单菌落，接种在3ml含相应抗生素的YEP培养液中，28℃，250rpm，振荡过夜培养。
3）在400-500ml 含相应抗生素的YEP培养基中，接种3ml过夜培养的起始农杆菌液，并在28℃摇床上振荡过夜，培养至细菌OD600值大于2.0。
4000rpm离心
10min收集细胞并悬浮于大约3倍体积的渗透培养液（1/2MS，50g/L蔗糖，0.5g
MES，pH=5.7-5.8，250ul/L silwetL-77(0.02%silwet)）中，此时的OD600值约
为0.8。
一般来说，400ml YEP过夜培养的农杆菌应至少可以渗透转化6钵植株。
4）在一个开口的大器皿（如500ml烧杯）内倒入200-300ml的悬浮有农杆菌的渗透液。
5）将生长有拟南芥的培养钵（盛花期拟南芥，最好在转化前修剪掉果荚和已经开放的花）小心地反扣在上述器皿内，让拟南芥的花芽完全浸入农杆菌悬浮液中
大约1min，将培养钵移开侧倒放入大盘中，让多余液体流净。
6）将处理过的植物用塑料盖盖上避光大约24h培养。
7）将植物放置在适宜的条件下培养3-4周，收集种子，进行下一步的筛选处理。
转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
Silwe-77t：加300微升/L 浸30s 50-100微升/L 浸3分钟。
农杆菌花序侵染法转化拟南芥
农杆菌花序侵染法转化拟南芥
侵染液制备
1、将保存的农杆菌拿出按1：100的比例接种与5ml含抗生素的液
体YEP培养基中。
28°C、220rpm过夜培养。
农杆菌2h左右繁殖一代，培养时间较大肠杆菌长。
2、将活化好的农杆菌按1：100的比例加入100ml含抗生素的液
体YEP培养基中继续28°C、220rpm培养16h左右。
3、次日中午测菌液OD600值，用含抗生素的液体YEP培养基作为
空白对照。
OD600值达到1.0-1.3之间时，用50ml离心管，
室温4000rpm离心10min集菌。
倒掉上清，加入悬浮液重悬
菌体，调节OD600达到0.8-1.0.
悬浮液100ml为例：ddH2O 1OOml、MS 0.216g、蔗糖5g、
L-77 30ul，调节PH=5.8
4、拟南芥有花序、花蕾的植株浸入悬浮好的菌液40-50s ,确保
所有的花都浸在农杆菌培养液中。
浸染后避光过夜，第二天
揭开覆膜。
正常光照培养。
每隔七天转化一次。
可转化3次
提高转化效率。
实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥课件
05
CATALOGUE
实验总结
实验收获与体会
掌握了农杆菌转化法的基本 原理和操作流程。
了解了烟草和拟南芥作为实 验材料的优缺点。
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学会了如何进行抗性筛选和 分子检测验证转基因植株。
培养了实验操作技能和团队 合作精神。
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等方法进行评估。
表型分析对于筛选具有优良性状的转基 因植株具有重要意义。
转化细胞的遗传稳定性分析
转化细胞的遗传稳定性分析是评估转 基因植物遗传物质稳定性的重要步骤 。
一般情况下，经过多次繁殖后，转化 细胞或转基因植株仍能保持稳定的遗 传特性，则认为遗传稳定性较好。
通过连续繁殖转化细胞或转基因植株 ，并定期进行PCR检测和表型分析， 可以观察遗传物质的变化情况。
其他试剂
如抗生素、质粒 DNA等。
农杆菌转化烟草和拟南芥
01
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04
将外源基因克隆到农杆菌的质 粒载体上。
将重组质粒转化到农杆菌中。
将农杆菌接种到植物受体材料 上。
在培养条件下培养植物受体材 料，使农杆菌与植物细胞相互
作用并导入外源基因。
基因枪法转化植物细胞
胞，促 进其再生和表达外源 基因。
实验原理
植物基因工程简介
植物基因工程是通过改变植物 的遗传物质来改良植物性状的 一门科学。
它利用基因工程技术将外源基 因导入植物细胞，并在植物细 胞内表达，从而获得具有优良 性状的转基因植物。
植物基因工程的应用范围广泛 ，包括抗虫、抗病、抗除草剂 、提高产量、改良品质等。
农杆菌的特性
农杆菌是一种土壤细菌，属于根瘤菌科。
基因转化小实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景基因转化是分子生物学领域的一个重要技术，它通过将外源基因导入宿主细胞中，使宿主细胞表达外源基因所编码的蛋白质。
基因转化技术在基因工程、生物制药、农业等领域具有广泛的应用前景。
本实验旨在探究基因转化技术在微生物中的可行性，以期为后续研究提供参考。
二、实验目的1. 了解基因转化技术的基本原理和操作步骤；2. 掌握基因转化实验的操作方法；3. 评价基因转化技术在微生物中的可行性。
三、实验材料1. 实验仪器：PCR仪、凝胶成像系统、离心机、显微镜等；2. 实验试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂、质粒载体、抗生素等；3. 实验菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）。
四、实验方法1. 提取目的基因：采用DNA提取试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA，通过PCR技术扩增目的基因；2. 构建重组质粒：将目的基因插入到质粒载体中，通过连接酶将两者连接，得到重组质粒；3. 转化宿主细胞：采用热冲击法将重组质粒转化到大肠杆菌中；4. 挑选转化子：在含有抗生素的培养基上培养转化子，观察菌落生长情况；5. 验证转化子：通过PCR技术检测转化子中的目的基因，并通过测序验证其正确性。
五、实验结果1. 提取目的基因：通过PCR技术成功扩增出目的基因，片段大小与预期相符；2. 构建重组质粒：通过连接酶将目的基因与质粒载体连接，得到重组质粒；3. 转化宿主细胞：通过热冲击法将重组质粒转化到大肠杆菌中，得到转化子；4. 挑选转化子：在含有抗生素的培养基上培养转化子，观察到部分菌落生长；5. 验证转化子：通过PCR技术检测转化子中的目的基因，结果与预期相符；通过测序验证，目的基因正确插入到质粒载体中。
六、实验讨论1. 本实验成功实现了基因转化，证明了基因转化技术在微生物中的可行性；2. 实验过程中，热冲击法是一种有效的转化方法，转化效率较高；3. 实验结果表明，通过PCR技术和测序验证，目的基因已成功导入宿主细胞，为后续研究提供了基础。
烟草瞬时转化实验步骤
烟草叶片瞬时转化实验试验方法一、实验材料及药品pCAMBIA 1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCl2、乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等二、载体构建及农杆菌转化烟草瞬时转化实验选用融合Luc信号的pCAMBIA 1381Z-Luc载体，载体构建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将启动子构建到pCAMBIA 1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或pMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。
通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株GV3101的感受态细胞中。
三、材料的准备1、烟草植株5-6周幼嫩未开花植株2、携带质粒的农杆菌（GV3101或An105均可）3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA 1381Z-Luc载体为卡纳氯霉素抗性、Gv3101只有r抗性）4、处理液：10mL配方如下母液配方（10ml配方）：0.5M MES 200ul 0.976g1M MgCl2100ul 2.03g100mM乙酰丁香酮10ul 0.196g（使用DMSO溶解）灭菌水加至10ml （若长时间保存，需避光！）四、操作步骤1、农杆菌转化2、转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养P19菌株（最好先进行划线）3、确定不同农杆菌所加菌液的量：计算公式：V=n×Vfinal×0.5/OD600 VP19= n×Vfinal×0.3/OD600 OD600最好在1以上n=注射叶片数Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml 注：在进行转录激活或抑制实验时，一般加入四种农杆菌（包括P19）而对照组往往只加入两种或三种菌液，此时，应使用Gv3101对体系进行补充，计算方法为公式一，具体加入量视对照组缺失的量确定，分别加入一倍或两倍Gv3101进行补充。
转Mn-SOD基因拟南芥、烟草与耐盐性的研究
中国农业大学博士学位论文转Ｍｎ－ＳＯＤ基因拟南芥、烟草与耐盐性的研究摘要盐、渍、干旱和低温等逆境胁迫是农业减产的重要原因。
长期而严重的环境胁迫会引起植物体内活性氧的积累，导致氧化胁迫，给细胞乃至整个植株带来严重伤害。
ＳＯＤ被认为是细胞内的维持活性氧平衡的关键酶，它能快速清除超氧阴离子，防止毒性最强的羟自由基的生成，清除活性氧的毒害。
Ｍｎ—ＳＯＤ位于真核细胞的线粒体中，尽管人们早己认识到线粒体是盐胁迫下最易受到伤害的细胞器之一，但是对于植物的线粒体内Ｍｎ．ＳＯＤ在盐胁迫条件下的适应性调节及其在植物耐盐性中作用还未有详尽的报道，而且在目前有限的研究结果中还存在很多的分岐。
为此本研究构建了ＣａＭＶ３５Ｓ启动子控制下的Ｍｎ．ＳＯＤ重组质粒，通过农杆菌的介导获得了转Ｍｎ－ＳＯＤ的拟南芥和烟草。
通过比较野生型与转基因的拟南芥和烟草的耐盐性、Ｍｎ—ＳＯＤ和其它抗氧化酶类活性和ＭＤＡ含量的差异、以及它们在盐适应反应中的变化，阐明Ｍｎ．ＳＯＤ在维持细胞内活性氧的平衡、保护细胞免受活性氧的伤害中的作用，为进一步改造植物耐盐品种提供理论依据。
／～√采用ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆得到拟南芥Ｍｎ－ＳＯＤｅＤＮＡ全序列，并构建Ｍｎ－ＳＯＤ片段的原核表达载体，获得融合蛋白并制备抗体，抗体效价为１：１００００。
同时以Ｍｎ－ＳＯＤｅＤＮＡ全序列构建真核生物表达载体，分别转化拟南芥和烟草，通过ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＳＯＤ活性鉴定，得到阳性转基因植株。
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定转基因植株的线粒体中有外源的Ｍｎ—ＳＯＤ的表达。
野生型拟南芥和烟草组培苗经不同浓度ＮａＣＩ胁迫处理１５天后，发现拟南芥在】５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ下烟草在２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ下植株遇到明显伤害，生长受到抑制。
检测叶片Ｍｎ．ＳＯＤ活性，结果表明拟南芥和烟草叶片中Ｍｎ．ＳＯＤ活性受盐胁迫调节，在一定盐浓度范围内（烟草１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、拟南芥１００ｍｍｏｌ／Ｌ）Ｍｎ—ＳＯＤ活性与盐胁迫程度正相关。
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法制备转化用的农杆菌菌液准备：1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。
2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。
1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。
3．步骤：共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。
28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。
用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。
转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。
4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
（注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。
2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。
3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。
4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。
5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。
花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥（2）拟南芥种植取Columbia生态型的拟南芥种子，在EP管中用70%的酒精消毒2-3min，10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗5-6次，用0.1%的Top agar混匀，平铺在1/2 MS 培养基上，4℃保湿黑暗条件下春化3-4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、18℃、RH为70%条件下培养。
转基因烟草方法
2．材料与方法2.1实验材料植物材料：K326烟草种子药品：MS大量元素，MS微量元素，MS铁盐,吲哚乙酸（IAA），6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），烟肌醇(B1B6),蔗糖，琼脂，头孢霉素（Cef），羧苄青霉素（Carb），卡那霉素（Kn）、庆大霉素、利福平等；MS培养基(1L):大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、蔗糖30g、琼脂8g，PH值约为6.0预培养基(1L)：大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、6-BA(1000x)2ml、B1B6(200x)5ml、甘氨酸(1000x)1ml、琼脂8g，PH值约为6.0。
高温灭菌后加IAA(0.2mg/L)1ml分化培养基(1L)：预培养基的基础上加入头孢霉素2ml，羧苄青霉素1ml，卡那霉素1ml.生根培养基(1L)：1/2MS、IAA 2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L，pH=5.8 LB液体培养基(1L)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCI 10gMS0培养基：为不加琼脂的只含大量元素MS培养基2.3实验方法2.3.1浸染菌液制备将含有目的基因的农杆菌在固体LB培养基上划板，28℃下暗培养两天。
挑取单菌落，接种于5ml含50mg.L-1卡那霉素、50mg.L-1链霉素及50mg.L-1利福平的液体LB培养基中，28℃下振荡培养过夜。
活化过夜的农杆菌，按1:50的比例，稀释到含50mg.L-1卡那霉素的新鲜液体LB培养基中，继续培养至OD600值约为0.5。
取培养物1ml，置于无菌离心管中，12000rpm离心1分钟，弃上清。
加入100ml的MS0培养基，混匀。
2.3.2烟草转化按叶圆盘法转化烟草。
将剪切好的烟草叶盘放置在预培养基上培养1-2天后，置于悬菌液中（MSO悬浮，可以稀释50—100倍）浸泡3-5分钟。
然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。
农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
本实验使用农杆菌介导植物的遗传转化技术，将外来基因导入到拟南芥植物中。
通过将拟南芥的幼苗浸泡在农杆菌中，再经过一定的培养条件，使外来基因被顺利地导入到拟南芥植物的细胞中，并观察到了转化成功的基因表达现象。
实验过程：
1. 构建外源基因载体——将目的基因把它克隆进载体中，构建出我们所需要的质粒；
2. 建立农杆菌表达载体——通过将农杆菌表达载体连接到质粒上，形成我们的转化载体；
3. 准备转化基质——通过将农杆菌营养培养在一定条件下，形成我们所需要的转化基质；
4. 转化拟南芥中——通过将拟南芥幼苗浸泡到农杆菌基质中，利用细胞壁酶和孔道蛋白结合作用，导入外源基因，最终实现基因转化；
5. 鉴定转化水平——通过将转化后的拟南芥植株置于含有抗生素的培养基中，筛选出转化成功的植株。
实验结果：
通过观察实验结果，我们发现拟南芥细胞成功地接受了外源基因，使其表达了目
的蛋白。
同时，通过筛选，我们也成功得到转化成功的植株。
结论：
农杆菌介导植物的遗传转化技术是一种有效的基因转化方法，可以将外源基因导入到植物细胞中，从而实现第二代遗传分析、基因功能研究、新品种选育等方面的应用。
拟南芥遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在通过农杆菌介导法对拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行遗传转化，将目的基因导入拟南芥基因组中，并通过筛选和鉴定得到转基因植株。
二、实验材料1. 拟南芥（T0代）植株2. 根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株3. 目的基因质粒（含有荧光素酶基因）4. 抗生素：卡那霉素、氯霉素5. 培养基：MS培养基、N6培养基、再生培养基6. 仪器：离心机、PCR仪、荧光显微镜等三、实验方法1. 构建重组表达载体将荧光素酶基因插入到农杆菌转化载体pCAMBIA1300中，构建重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化将重组表达载体转化根癌土壤杆菌GV3101菌株，通过平板划线法筛选阳性克隆。
3. 拟南芥转化将阳性克隆的农杆菌悬浮液与拟南芥（T0代）花序进行蘸花处理，将蘸花后的拟南芥放入MS培养基中培养。
4. 筛选和鉴定在含有卡那霉素的培养基上筛选转基因植株，通过PCR检测和荧光显微镜观察GUS 基因的表达情况，鉴定转基因植株。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，待植株生长稳定后，收集种子进行繁殖。
四、实验结果1. 构建重组表达载体成功构建了含有荧光素酶基因的重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化通过平板划线法筛选到阳性克隆，表明重组表达载体已成功转化根癌土壤杆菌GV3101菌株。
3. 拟南芥转化蘸花处理后，部分拟南芥植株在含有卡那霉素的培养基上生长，表明转基因植株已成功筛选。
4. 筛选和鉴定通过PCR检测和荧光显微镜观察，发现部分转基因植株GUS基因表达阳性，荧光素酶活性明显。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，植株生长良好，繁殖成功。
五、实验讨论1. 本实验通过农杆菌介导法成功将荧光素酶基因导入拟南芥基因组中，获得了转基因植株。
2. 在实验过程中，农杆菌转化和拟南芥转化效果良好，表明该实验方法适用于拟南芥遗传转化。
实验三(1)通过根瘤农杆菌转化拟南芥
4．将沉淀用200ml浸染液重悬，形成均匀的农杆菌悬浮液 （OD600=0.8左右），并将农杆菌悬浮液转移到一个敞口 的器皿中（500ml烧杯）。 5．选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬 浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约 20-30秒，注意叶片尽量不与浸染液接触。同一个烧杯中 的农杆菌悬浮液可以转化10株或者更多株拟南芥。在此过 程中，尽量避免将蛭石倒入农杆菌悬浮液中。 6．将盆钵取下，横放于暗箱中约24小时。注意保持一定的 湿度。 7．24小时后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条 件下使其正常生长。 8．大约三周后收取成熟种子。
人工改造后的Ti质粒
1.保留T-DNA的转移功能，去掉T-DNA的致瘤性， 有利于转化体再生植株； 2.在T-DNA左右边界序列之间构建一段DNA序列， 其上含有一系列单个的限制性内切酶的识别位点、 即单克隆位点，以利于插入外源DNA和其后的操 作； 3.具有目的基因表达所需的启动子、终止子以及提 供重组细胞筛选的标记基因等； 4.具有使质粒能够在大肠杆菌中进行复制的DNA复 制起始位点，某些载体还同时带有可在农杆菌中 进行复制的起始位点。
思 考 题
1．目前拟南芥稳定表达有几种基本的方法？ 试分析不同转化方法的优缺点。 2．植物转基因技术有哪些应用? 3．拟南芥作为研究植物发育的重要模式植株 之一，请问有哪些特性？
培养基配制
准备—下周筛转基因种子和萌发实验。每两个人一 组，准备下述平板： （1）1个含有卡那霉素（50 mg/L）的 1/2 MS固体 平板； （2）1个1/2 MS固体平板（不含任何抗生素或者是 激素）； （3）一个加200 mM NaCl 1/2 MS固体平板（不含 抗生素）； （4）一个加1µM ABA 2 MS固体。 灭菌后将平板倒好并再4 ℃保存备用。
农杆菌转化的实验报告
一、实验目的1. 掌握农杆菌转化法的基本原理和操作步骤。
2. 将抗虫基因导入植物细胞，观察转化效果。
二、实验原理农杆菌转化法是一种将目的基因导入植物细胞的方法。
该方法利用农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）将目的基因转移到植物细胞中，并整合到植物细胞染色体DNA上，从而实现目的基因的遗传表达。
三、实验材料1. 植物材料：拟南芥种子、生长培养基、诱导培养基、选择培养基。
2. 农杆菌：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）。
3. 抗虫基因：Bt基因。
4. 工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶。
5. 试剂：LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、抗生素、CaCl2、DNA标记染料等。
四、实验步骤1. 目的基因克隆（1）设计引物：根据Bt基因序列设计一对引物，用于扩增Bt基因。
（2）PCR扩增：以Bt基因的DNA为模板，进行PCR扩增。
（3）克隆：将PCR产物连接到载体上，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。
2. 农杆菌工程（1）制备感受态农杆菌：将根癌农杆菌接种于LB液体培养基，37℃培养过夜，按1:100的比例接种于新鲜的LB液体培养基，37℃培养3小时，加入IPTG和CaCl2，使农杆菌进入感受态。
（2）目的基因转化：将克隆有Bt基因的载体与感受态农杆菌混合，在冰浴中孵育30分钟，然后将混合液涂布于含有抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。
3. 植物转化（1）种子处理：将拟南芥种子用70%酒精消毒后，用无菌水冲洗干净。
（2）农杆菌感染：将处理好的种子接种于含有农杆菌的培养基上，28℃恒温培养3天。
（3）筛选转化植株：将感染后的种子接种于选择培养基上，筛选出转化植株。
4. 抗虫鉴定（1）PCR检测：提取转化植株的DNA，进行Bt基因的PCR检测。
（2）生物测定：将转化植株与抗虫性差的拟南芥进行抗虫性比较，观察转化植株的抗虫效果。
实验六农杆菌介导转化拟南芥
Hyg基因或Lac Z基因等。
双元载体系统旳转化原理是Ti质粒上 旳Vir基因能够反式激活T－DNA 旳转移。
外外源源基基因因 切
3 转化措施
• 根据受体材料不同分为浸花法、原生质 体共培养法、叶盘法和创伤植物感染法。
• 其中 浸花法、叶盘法在许多植物上得 到广泛应用。
试验流程
1. 挑取活化旳含目旳基因质粒旳单克隆阳性农杆菌GV3101菌 株至5ml 新鲜YEB液体培养基（50g/ml Kan，125g/ml Rif）中，28℃摇培24h。
科植物，二年生草本，高7～40厘米，花期3～5 月。广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生 物学旳研究，已成为一种经典旳模式植物，其原 因主要基于这种植物具有下列特点：
• （1）形态个体小，生活力强,种子量大；
• （2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需 6--8周；
• （3）基因组小(2n=10)，是目前已知植 物基因组中最小旳，但是具有完毕“复 杂”旳植物生长发育旳全部基因；
试验六、农杆菌介导转化拟南芥
试验目旳：学习真核生物旳转基因技术及农杆菌介 导旳转化原理。
•试验要求：掌握农杆菌介导转化拟南芥 旳试验措施， 了解拟南芥旳生理特点及在基因工程试验中应用。
• 技术应用：一种以便，高效旳植物转基因措 施，多用于转化双子叶植物，经过改善后也 逐渐用于单子叶植物旳转化。
• 试验材料： 农杆菌GV3101重组菌株，重组双元 体现载体pCAMBIA1300 ，拟南芥
Vir区
2.3 双元体现载体系统源自•双元体现载体系统主要涉及两个部分：
•
一部分为卸甲Ti质粒，此类Ti质粒因为缺失了T
－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir
农杆菌实验报告
一、实验目的1. 掌握农杆菌介导的植物基因转化方法。
2. 学习基因转化过程中的操作技巧。
3. 研究农杆菌介导的基因转化在植物遗传育种中的应用。
二、实验原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤细菌，它具有将T-DNA（转移DNA）片段转移到植物细胞中的能力。
在植物基因转化实验中，利用农杆菌将目的基因导入植物细胞，进而实现基因的遗传转化。
本实验采用农杆菌介导的方法，将目的基因导入拟南芥（Arabidopsis thaliana）细胞中。
三、实验材料1. 拟南芥植株2. 农杆菌菌株（E. coli DH5α和Agrobacterium tumefaciens C58）3. 载体DNA（含目的基因）4. 限制性内切酶和连接酶5. 载体质粒（含T-DNA序列）6. 抗生素（卡那霉素和壮观霉素）7. 培养基和试剂四、实验方法1. 构建重组载体：将目的基因克隆到载体质粒中，并构建重组载体。
2. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共同培养，使目的基因转移到农杆菌中。
3. 农杆菌感染：将转化后的农杆菌与拟南芥植株进行共培养，使农杆菌感染拟南芥细胞。
4. 抗性筛选：将感染后的拟南芥植株在含有抗生素的培养基上培养，筛选出含有目的基因的植株。
5. 基因表达检测：通过PCR、RT-PCR等方法检测目的基因在转化植株中的表达情况。
五、实验结果与分析1. 重组载体的构建：通过PCR和测序验证，成功构建了含目的基因的重组载体。
2. 农杆菌转化：经过共培养和感染，拟南芥植株表现出明显的抗性。
3. 抗性筛选：在含有抗生素的培养基上，成功筛选出含有目的基因的植株。
4. 基因表达检测：通过PCR和RT-PCR实验，证实目的基因在转化植株中得到了表达。
六、实验结论1. 成功构建了含目的基因的重组载体。
2. 农杆菌介导的基因转化方法在拟南芥中取得了较好的效果。
3. 通过抗性筛选和基因表达检测，验证了目的基因在转化植株中的稳定遗传和表达。
农杆菌转化和侵染拟南芥及其种子的消毒与筛选
一、拟南芥种子的消毒1、网筛：硅胶干燥过两三周的种子，用漏网筛滤几遍，尽量除去皮壳等杂质，倒入EP管中；2、消毒：于超净台上，用无菌枪头，向EP管中加入1ml的70% 酒精，并计时8分钟，在此期间不停的振荡，以使种子与酒精充分接触，最后12000rpm离心30s；3、洗涤：回到超净台上，酒精消毒双手，用无菌枪头将70% 酒精吸出，更换无菌枪头，吸取1ml无菌水加入管中，反复颠倒振荡，以使种子与无菌水充分接触，最后12000rpm离心30s；重复上述操作两次；4、春化：无菌枪头吸取1ml无菌水，加到种子EP管中，放入4℃冰箱中三天。
二、表达载体克隆构建转化农杆菌1、冲洗电击杯：水龙头下流水冲洗3min以上；于超净台上无菌水冲洗：用无菌蓝枪头将无菌水加入电击杯中，然后吸出并打入电击杯底部狭缝，如此重复吹打几次，再换成新的无菌水，如此反复3次；无水乙醇冲洗，同上反复3次；70%酒精冲洗，同上反复3次；最后无水乙醇冲洗1次，并平放于枪头盒上对着超净台风向吹干；2、加样：将已经吹干的电击杯放在冰上预冷，与此同时，从-20℃取出的质粒解冻后亦放在冰上预冷；然后从-80℃中取出已制备好的农杆菌感受态，解冻时离心几秒钟使其均匀分布（储存完整量为50ul）；准备工作做好后，白枪头吸取质粒1ul打入50ul农杆菌感受态细胞中，然后轻轻反复吹打使两者混匀，再用黄枪头全部吸出，沿着电击杯内壁或侧壁打入缝隙中，最后放于冰上保持低温；3、电击：插上电击仪电源，打开开关，调至Bacteria，调至Agr（农杆菌），将电击杯外壁突出面放在前面，并放在电击仪槽中，然后将槽推进去，使两边电击卡住，最后摁下Pulse脉冲进行电击，听到蜂鸣后取出电击杯放回冰上；4、复苏：于超净台上，沿电击杯内壁，往电击杯狭缝中，加入800ul无抗LB培养液，然后换用黄枪头，反复吸出培养液并吹打底部感受态细胞，使其悬浮起来，最后吸到2ml无菌EP管中，于28℃恒温箱中复苏1～2小时；5、涂板：复苏结束后，将菌液涂至含有利福平（菌种自身抗性）和表达载体抗性抗生素的固体培养基平板上，于28℃恒温箱中倒置过夜培养；三、侵染拟南芥植株1、栽种：将春化种子点在土里，隔两天浇一次水；2、打顶：拟南芥幼苗抽薹两三天后，去除其顶上花序，注意要避免伤及叶生花序；3、转化：打顶三四天后，进行侵染转化。
农杆菌介导的拟南芥转基因技术方法探究
农杆菌介导的拟南芥转基因技术方法探究农杆菌介导的植物转基因技术在研究植物基因功能、改良作物农艺性状等方面发挥着重要作用。
拟南芥作为模式植物，是研究植物基因功能的重要材料。
本文主要介绍农杆菌介导的拟南芥转基因方法——浸花法。
该方法操作简单，转化效率高，易于在中学生物实验教学中推广。
通过该实验，可以培养中学生对于生物学科的兴趣，提高学生对于生物知识的理解力和创新能力。
标签：植物转基因；农杆菌；浸花法植物转基因技术是指把目的基因通过各种方法转移到植物基因组中，使之稳定遗传。
利用该技术研究基因在植物个体生长发育以及生理代谢过程中功能，研究成果可应用于农艺性状的改良、植物经济价值和观赏价值的提高等方面。
植物基因转化的方法可分为直接转化和载体介导两种转化方法。
基因直接导入法直接将外源目的基因导入植物的基因组中，包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法、PEG 介导转化方法、脂质体法和花粉管通道法等；载体介导的转化方法需要将目的基因插入到改造后的农杆菌质粒或病毒的DN分子上，利用农杆菌或病毒对植物的侵染作用将目的基因导入到植物基因组中。
农杆菌介导的转化方法具有应用范围广，转化率高，单拷贝比例高，转化子稳定等特点，是植物转基因研究中的常用转化方法。
农杆菌能在自然条件下感染大多数双子叶植物受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
在农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，农杆菌中Ti质粒上的T-DNA可以插入到植物基因中。
科研人员经过长期的研究，将目的基因插入到经过改造T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，从而获得转基因植株。
利用农杆菌介导的转化方法进行转基因操作时，根据植物材料的不同，采用不同的转化方法，如在烟草转化时常采用叶盘法，而水稻转化则采用愈伤组织转化的方法。
浸花法（floral tip）是拟南芥转化最常用的方法。
这种转化方法不需要组织培养和再生植株的过程，操作简便、转化效率较高，为科研人员提供了极大的便利。
实验六、农杆菌介导转化拟南芥
• （1）形态个体小，生活力强,种子量大；
• （2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需 6--8周；
• （3）基因组小(2n=10)，是目前已知植 物基因组中最小的，但是具有完成“复 杂”的植物生长发育的所有基因；
2. 取上述菌液0.1ml 接至50ml 新鲜YEB液体培养基（50 g/ml Kan，125 g/ml Rif）中，28℃ 220rpm培养2～4h， 使OD值达到0.8左右。
3.取上述菌液1ml于EP管中，室温22℃，5500g，离心15min， 弃去上清，用转化介质重悬沉淀至OD值达到0.8左右。
Hale Waihona Puke • 为了提高转化率，去除塑料袋3d后，用吸管吸 取适量重悬目的质粒的新鲜转化液，逐个醮沾 花蕾。
说明
• 转化后拟南芥的培养恢复正常管理，一旦再出现 侧蘖或主苔出现分枝，及时剪除。
• 转化5-6周后，为了加速拟南芥成熟可以适量少浇 营养液。待拟南芥个别角果开始枯黄后，可将其 角果剪下放于培养皿内干燥。拟南芥角果大部分 枯黄后，即可收取全部种子存于1.5ml 的EP管中 （在盖上扎一小孔以便干燥）。种子完全干燥后， 放于1.5ml 新EP管中4℃短期保存。如需要可放于 -20℃冰箱内长期保存。
Vir区
2.3 双元表达载体系统
•
双元表达载体系统主要包括两个部分：
•
一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T
－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir
基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
拟南芥模拟植物实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为一种重要的模式植物，在植物遗传学、分子生物学和发育生物学等领域的研究中发挥着举足轻重的作用。
由于其生长周期短、繁殖速度快、基因组相对较小、易于转化和遗传操作等特点，拟南芥成为科学家们研究植物生命现象的理想材料。
本实验旨在通过模拟拟南芥的生长过程，了解其生物学特性，并掌握相关实验技术。
二、实验目的1. 了解拟南芥的生长周期和生物学特性。
2. 掌握拟南芥种子萌发、移栽、生长和观察的基本实验技术。
3. 熟悉拟南芥的遗传转化和基因编辑方法。
三、实验材料1. 拟南芥种子2. 培养基（MS培养基）3. 培养皿、移栽盘、水培箱等容器4. 电转化仪、PCR仪、凝胶成像系统等仪器5. 相关试剂（如DNA提取试剂盒、PCR试剂等）四、实验方法1. 种子萌发（1）将拟南芥种子用70%乙醇消毒2分钟，然后用无菌水冲洗3次。
（2）将消毒后的种子接种到MS培养基上，置于培养箱中，保持适宜的温度和光照条件。
（3）观察种子萌发情况，记录萌发时间和生长状况。
2. 移栽（1）待拟南芥幼苗长到2-3片真叶时，将其移栽到移栽盘中。
（2）在移栽盘中加入适量的营养土，保持土壤湿润。
（3）观察移栽后的生长状况，记录生长时间和生长情况。
3. 生长和观察（1）将移栽后的拟南芥放置于水培箱中，定期更换营养液。
（2）观察拟南芥的生长状况，包括叶片、茎、根的生长速度和形态变化。
（3）记录生长数据，分析生长规律。
4. 遗传转化和基因编辑（1）利用电转化法将目的基因导入拟南芥细胞。
（2）通过PCR和DNA测序验证基因转化成功。
（3）利用CRISPR/Cas9技术对拟南芥基因进行编辑，观察基因编辑效果。
五、实验结果与分析1. 种子萌发实验结果显示，拟南芥种子在消毒后2-3天内开始萌发，5-7天内大部分种子萌发，生长状况良好。
2. 移栽移栽后的拟南芥生长迅速，叶片展开，茎、根生长良好。
3. 生长和观察实验过程中，观察到拟南芥在适宜的生长条件下，生长速度较快，叶片、茎、根的生长状况良好。
农杆菌转化拟南芥
农杆菌转化拟南芥1．农杆菌感受态制备①从YEB平板培养基上挑取农杆菌单克隆，接种于5 mL YEB （含50µg/mL 利福平）液体培养基中，28ºC，200 rpm，过夜培养；②取2 mL过夜培养液接种于50 mL上述含有利福平的YEB液体培养基中，28ºC，200 rpm，摇床培养至OD达到0.5；③菌液冰浴30 min，转至预冷的50 mL离心管中，4ºC，5000 rpm，离心10 min，收集菌体；④ 2 mL预冷的50 mM 无菌CaCl2溶液（含15%甘油）悬浮菌体，即为感受态细胞；以100 µl/管分装，液氮速冻后，保存于-70ºC冰箱，备用。
2．质粒转化农杆菌感受态①吸取构建好的表达载体质粒5 µl，加入到100 µl感受态细胞中，混匀；②冰浴30 min，液氮冷冻5 min，37ºC热击5 min；③加入800 µl YEB液体培养基，28ºC，200 rpm，摇床培养5 h；④离心，留200 µl上清重悬沉淀，将菌液涂于YEB固体培养基（含质粒对应的抗生素），28ºC培养2 d，挑取单克隆，检测筛选阳性克隆，摇菌后-70ºC保存，用于下一步植物转化。
3．农杆菌侵染拟南芥花序①将筛选的阳性农杆菌在YEB（抗生素）固体培养基划板培养，至长出单克隆后挑3-5个单克隆，于5 mL YEB（抗生素）液体培养基中，28ºC，200 rpm培养16 h，（以培养基变得很浑浊为准），保菌之后全部接到250-500 mL的培养基中，培养16 h以上；②5000 rpm离心20分钟，然后用转化液（1/2MS（只用大量和微量元素），添加50 g/L的蔗糖，调pH为5.8左右，然后加200 ul/L的Silwet L-77混合），剧烈悬浮沉淀至完全悬起；③在拟南芥盛花期，将悬浮液直接浸泡地上部分约1分钟，然后用保鲜膜完全包裹以保湿，放回培养室12小时以上打开保鲜膜；④待种子成熟后（半个月左右），收取种子用于下一步筛选工作。
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操作要点
侵染烟草叶片无菌操作注意事项 抗生素的正确使用及抗生素敏感性实验 新鲜的叶片转化效率高 侵染前去除拟南芥已开花和果荚 侵染后筛选再生植株要注意抑制农杆菌生长 侵染后共培养一般为暗培养，1~2d，使农杆菌繁殖迅速，提高转化效率。
实验报告
实验目的 实验原理（简略写） 实验方法 实验结果及分析（最重要） 思考题（最后一次课给）
Silwet L-77
拟南芥、油菜等转化必须试剂之一，原产地为美国GE公司， Silwet-L77高效有机硅表面活性剂，能够极大的降低水的表面张力(水 的表面张力为72.4mN/m，0.1%的Silwet-L77系列有机硅溶液的表面张 力约为21mN/m),这使Silwet-L77有机硅溶液可轻易湿润几乎所有种类 的叶面,相对于传统助剂,显著提高了在靶标生物的覆盖面.同时，SilwetL77有机硅助剂具有极强的耐水冲刷及渗透能力。Silwet-L77是拟南芥 及其它作物常用的转基因用表面活性剂。
T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可插入任何一条染色体。 插入位点特点： T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点 T-DNA与植物DNA连接处富含A-T碱基对 植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。 但在T-DNA的整合过程中常有植物基因组靶序列的缺失、倒位和重复 等现象，T-DNA的整合一定程度上依赖于植物内源重组系统。
植物瞬时表达系统
当外源基因导入植物细胞中以后，其表达方式有瞬时表达 （transientexpression）和稳定表达（stable expression）两种。
在瞬时表达状态的基因转移中，引入细胞的外源DNA和宿主细胞染色体 DNA并不发生整合。这些DNA一般随载体进入细胞后12小时内就可以表达， 并持续约80小时左右。在稳定表达状态的基因转移中，导入宿主细胞的DNA 整合到细胞染色体DNA上，以永久形式存在，并可传给后代，形成稳定的转 化细胞。
植物瞬时表达系统在启动子分析、基因功能分析和生产重组蛋白方面用 途广泛。
Gus基因
gus基因来源于E.coli染色体上的uid A位点。编码β-葡萄糖苷酸酶。 β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应 产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背 景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。 根据gus基因检测所用的底物不同，检测方法有：组织化学法、分光光度 法和荧光法。
遗传转化中常用的诱导能力较强的一种酚类化合物，乙酰丁香酮之所以 能够提高外植体的转化频率，是因为它可诱导农杆菌Vir基因活化，从而促进 外源基因的整合。 使用方法： 在侵染前4-6h加入液体培养基，使农杆菌既处于对数生长期，又处于vir基 因高度活化状态，从而提高侵染能力 悬浮离心后用植物外植体培养基稀释成侵染液时加入 加在农杆菌和外植体共培养的培养基中，一般农杆菌附着16h后才能进行转 化 在农杆菌液体培养基及共培养基中都加入AS
切勿相互抄袭，支持原创，如有雷同后果自负！
再见
总之，T-DNA的整合是通过植物靶DNA和T-DNA间短的同源区段 发生重组而完成的，在接口附近伴有DNA顺序的转换和重复。
真空浸透法转化拟南芥
农杆菌侵染瞬时转化烟草
注射法瞬时转化烟草
乙酰丁香酮
Vir区基因的活化直接调控着T-DNA的转移，酚类化合物对Vir区基因的活化具 有重要作用。 乙酰丁香酮（Acetosyringone，分子式:HOC6H2(OCH3)2COCH3）AS：
转基因方法
农杆菌侵染法
基因枪法
农杆菌侵染法
农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系
对单子叶植物不敏感
根癌农杆菌和发根农 杆菌中细胞中分别含 有Ti质粒和Ri质粒， 其上有一段T-DNA， 农杆菌通过侵染植物 伤口进入细胞后，可 将T-DNA插入到植物 基因组中。
T-DNA整合植物基因组的分子机理