常用分子生物学技术
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第六章 常用分子生物学技术
Common Molecular Biology Technique
陈耕夫 生物化学与分子生物学系 基础学院 广东药学院
主要内容 一、分子杂交技术 二、目的基因制备技术 三、遗传修饰动物模型的建立 四、RNA干扰技术 五、蛋白组学研究常用技术
一、分子杂交技术
（一）什么是核酸杂交？ （二）核酸探针 （三）DNA杂交技术 （四）其他杂交技术 （五）生物芯片 （六）核酸杂交技术的应用
非同位素标记核酸探针检测原理
（二）核酸探针
3. 核酸探针标记的常用方法 放射性同位素标记法 如3H、32P、35S、125I等 非放射性标记法
半抗原：生物素、地高辛 荧光素：异硫氰酸荧光素和罗丹明 配体：生物素 光密度或电子密度标记物： 金、银
（三）DNA杂交技术
DNA杂交技术是一种以DNA的特异序列（探针） 检测目标DNA样品中是否存在能与探针碱基配对的 核酸杂交技术。
（四）其他杂交技术
2. Western印迹（Western blot） 又称蛋白质印迹，是用于目的蛋白质定位检测
的实验方法。 其过程与Southern印迹相似： 将电泳分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜或尼
龙膜上，再以免疫反应或亲和反应检测经电泳分离 的样品中能与免疫反应或亲和反应的标记配体特异 性结合的蛋白质区带。
1. 在个体识别中的应用
S 嫌疑人DNA E 现场DNA证据 V 受害人DNA （V右侧是另一嫌疑人）
（六）核酸杂交技术的应用
（2）在产前诊断中的应用
子代
父亲 缺陷基因 正常基因
缺陷基因 正常基因
母亲
等位基因全缺陷 为患病胎儿 应终止妊娠
带一缺陷基因 可继续妊娠
带一缺陷基因 可继续妊娠
基因正常 可继续妊娠
建重组体时，目的基因又称为插入基因或靶基因。 对于原核生物或病毒，其基因组较小，可以直
接从细胞中提取目的基因。 但对于人类基因组，由于有23对染色体组成，
直接从染色体中提取基因的效率极低，故往往是首 先采用适当的方法使目的基因扩增后才进行目的基 因的提取。
（二）聚合酶链反应
聚合酶链反应技术的发明者Dr Kary Banks Mullis，获1993年化学诺贝尔奖。
Western Blot
（四）其他杂交技术
3. 原位杂交（in-situ hybridization） 在组织或细胞水平，使用标记探针与细胞内
DNA或RNA杂交的方法。
原位杂交
人类端粒DNA荧光原位杂交相片
（五）生物芯片
生物芯片（biochip）是将核酸、多肽、蛋白 质分子、组织切片和细胞等制成探针，以预先设计 的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等载体 上，构成二维分子阵列，然后与待测生物样品靶分 子杂交，通过检测杂交信号实现快速、高效、高通 量样品检测。
2. 探针的制备
3. 待测样品核酸序列的检测 ① 杂交——待测样品与探针的复性 ② 洗膜——除去多余未杂交探针 ③ 检测——依据探针特点检测探针信号
杂
组织或细胞
交 基因组DNA
样 限制性内切酶降解
品 及电泳分离、变性
的 转移到硝酸纤维膜
制
或尼龙膜
备
预杂交
含已知的重组
标
质粒菌落
记
提取质粒DNA
探
限制ຫໍສະໝຸດ Baidu内切酶降解 及电泳分离
依据待检测样品的性质，生物芯片又分为基因 芯片（DNA芯片）、蛋白质芯片、细胞芯片、组织 芯片等。
基因芯片
又称为DNA芯片，是将DNA以大规模阵列的形 式排列，形成了可与目的分子相互作用的固相表面。 基因芯片与目的分子作用后激发出不同波长荧光， 通过计算机分析结果。
基因芯片检测原理
蛋白质芯片及其应用
是否存在某段核酸特征序列而人工设计的、能够与 靶分子核酸按碱基互补原则特异性相互作用的一段 已知序列的寡核苷酸或核酸。
（二）核酸探针
2. 核酸探针的标记 核酸探针的标记是指探针以共价键形式结合能
够产生强烈信号的基团、原子或能够与一些产生强 烈信号分子特异性结合的配体。
核酸探针标记的目的 利用探针的标记物特定性质来跟踪检查探针， 从而确定是否存在核酸靶序列或者确定核酸靶分子 所在位置。
针
回收含已知基因的 的
DNA片段，并标记 制
基因探针
备
检测 样品 核酸 序列 检测
杂 交 (待测样品与探针的复性) 洗 膜( 除去多余未杂交探针 )
放射自显影
核酸杂交技术的基本过程
分离
转膜
杂交
自显影
（四）其他杂交技术
1. Northern印迹（northern blot） 应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术。
该方法在1975年由Southern首先创建，故该 方法又称为Southern印迹（Southern blot）。
待检测核酸样品的制备
标记探针的制备
检测样品中是否存在目标序列
（三）DNA杂交技术
1. 样品的制备 ① 核酸样品的提取分离 ② 酶切、电泳分离、核酸变性等 ③ 样品核酸转移到硝酸纤维膜或尼龙膜 ④ 预杂交：封闭硝酸纤维膜或尼龙膜上核酸结 合位点，防止探针直接与膜结合
From the following article:Protein analysis on a proteomic scale, Eric Phizicky, et al.,Nature 422, 208-215(13 March 2003)
（六）核酸杂交技术的应用
1. 在个体识别中的应用
（六）核酸杂交技术的应用
主要内容 一、分子杂交技术 二、目的基因制备技术 三、遗传修饰动物模型的建立 四、RNA干扰技术 五、蛋白组学研究常用技术
二、目的基因制备技术
（一）什么是目的基因 （二）聚合酶链反应 （三）基因组DNA文库 （四）cDNA文库 （五）化学合成
二、目的基因制备技术
（一）什么是目的基因（target gene） 目的基因即是我们需要进行研究的基因。在构
（一）什么是核酸杂交？
核酸杂交（nucleic acid hybridization）是指 碱基序列互补但来源不同的单链DNA和DNA、DNA 和RNA、RNA和RNA，根据碱基配对原则，借助氢 键相连而形成的双链杂交分子的过程。
核酸的变性与复性
核酸杂交
（二）核酸探针
1. 什么是核酸探针？ 核酸探针（probe）是指为了检测核酸样品中
Common Molecular Biology Technique
陈耕夫 生物化学与分子生物学系 基础学院 广东药学院
主要内容 一、分子杂交技术 二、目的基因制备技术 三、遗传修饰动物模型的建立 四、RNA干扰技术 五、蛋白组学研究常用技术
一、分子杂交技术
（一）什么是核酸杂交？ （二）核酸探针 （三）DNA杂交技术 （四）其他杂交技术 （五）生物芯片 （六）核酸杂交技术的应用
非同位素标记核酸探针检测原理
（二）核酸探针
3. 核酸探针标记的常用方法 放射性同位素标记法 如3H、32P、35S、125I等 非放射性标记法
半抗原：生物素、地高辛 荧光素：异硫氰酸荧光素和罗丹明 配体：生物素 光密度或电子密度标记物： 金、银
（三）DNA杂交技术
DNA杂交技术是一种以DNA的特异序列（探针） 检测目标DNA样品中是否存在能与探针碱基配对的 核酸杂交技术。
（四）其他杂交技术
2. Western印迹（Western blot） 又称蛋白质印迹，是用于目的蛋白质定位检测
的实验方法。 其过程与Southern印迹相似： 将电泳分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜或尼
龙膜上，再以免疫反应或亲和反应检测经电泳分离 的样品中能与免疫反应或亲和反应的标记配体特异 性结合的蛋白质区带。
1. 在个体识别中的应用
S 嫌疑人DNA E 现场DNA证据 V 受害人DNA （V右侧是另一嫌疑人）
（六）核酸杂交技术的应用
（2）在产前诊断中的应用
子代
父亲 缺陷基因 正常基因
缺陷基因 正常基因
母亲
等位基因全缺陷 为患病胎儿 应终止妊娠
带一缺陷基因 可继续妊娠
带一缺陷基因 可继续妊娠
基因正常 可继续妊娠
建重组体时，目的基因又称为插入基因或靶基因。 对于原核生物或病毒，其基因组较小，可以直
接从细胞中提取目的基因。 但对于人类基因组，由于有23对染色体组成，
直接从染色体中提取基因的效率极低，故往往是首 先采用适当的方法使目的基因扩增后才进行目的基 因的提取。
（二）聚合酶链反应
聚合酶链反应技术的发明者Dr Kary Banks Mullis，获1993年化学诺贝尔奖。
Western Blot
（四）其他杂交技术
3. 原位杂交（in-situ hybridization） 在组织或细胞水平，使用标记探针与细胞内
DNA或RNA杂交的方法。
原位杂交
人类端粒DNA荧光原位杂交相片
（五）生物芯片
生物芯片（biochip）是将核酸、多肽、蛋白 质分子、组织切片和细胞等制成探针，以预先设计 的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等载体 上，构成二维分子阵列，然后与待测生物样品靶分 子杂交，通过检测杂交信号实现快速、高效、高通 量样品检测。
2. 探针的制备
3. 待测样品核酸序列的检测 ① 杂交——待测样品与探针的复性 ② 洗膜——除去多余未杂交探针 ③ 检测——依据探针特点检测探针信号
杂
组织或细胞
交 基因组DNA
样 限制性内切酶降解
品 及电泳分离、变性
的 转移到硝酸纤维膜
制
或尼龙膜
备
预杂交
含已知的重组
标
质粒菌落
记
提取质粒DNA
探
限制ຫໍສະໝຸດ Baidu内切酶降解 及电泳分离
依据待检测样品的性质，生物芯片又分为基因 芯片（DNA芯片）、蛋白质芯片、细胞芯片、组织 芯片等。
基因芯片
又称为DNA芯片，是将DNA以大规模阵列的形 式排列，形成了可与目的分子相互作用的固相表面。 基因芯片与目的分子作用后激发出不同波长荧光， 通过计算机分析结果。
基因芯片检测原理
蛋白质芯片及其应用
是否存在某段核酸特征序列而人工设计的、能够与 靶分子核酸按碱基互补原则特异性相互作用的一段 已知序列的寡核苷酸或核酸。
（二）核酸探针
2. 核酸探针的标记 核酸探针的标记是指探针以共价键形式结合能
够产生强烈信号的基团、原子或能够与一些产生强 烈信号分子特异性结合的配体。
核酸探针标记的目的 利用探针的标记物特定性质来跟踪检查探针， 从而确定是否存在核酸靶序列或者确定核酸靶分子 所在位置。
针
回收含已知基因的 的
DNA片段，并标记 制
基因探针
备
检测 样品 核酸 序列 检测
杂 交 (待测样品与探针的复性) 洗 膜( 除去多余未杂交探针 )
放射自显影
核酸杂交技术的基本过程
分离
转膜
杂交
自显影
（四）其他杂交技术
1. Northern印迹（northern blot） 应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术。
该方法在1975年由Southern首先创建，故该 方法又称为Southern印迹（Southern blot）。
待检测核酸样品的制备
标记探针的制备
检测样品中是否存在目标序列
（三）DNA杂交技术
1. 样品的制备 ① 核酸样品的提取分离 ② 酶切、电泳分离、核酸变性等 ③ 样品核酸转移到硝酸纤维膜或尼龙膜 ④ 预杂交：封闭硝酸纤维膜或尼龙膜上核酸结 合位点，防止探针直接与膜结合
From the following article:Protein analysis on a proteomic scale, Eric Phizicky, et al.,Nature 422, 208-215(13 March 2003)
（六）核酸杂交技术的应用
1. 在个体识别中的应用
（六）核酸杂交技术的应用
主要内容 一、分子杂交技术 二、目的基因制备技术 三、遗传修饰动物模型的建立 四、RNA干扰技术 五、蛋白组学研究常用技术
二、目的基因制备技术
（一）什么是目的基因 （二）聚合酶链反应 （三）基因组DNA文库 （四）cDNA文库 （五）化学合成
二、目的基因制备技术
（一）什么是目的基因（target gene） 目的基因即是我们需要进行研究的基因。在构
（一）什么是核酸杂交？
核酸杂交（nucleic acid hybridization）是指 碱基序列互补但来源不同的单链DNA和DNA、DNA 和RNA、RNA和RNA，根据碱基配对原则，借助氢 键相连而形成的双链杂交分子的过程。
核酸的变性与复性
核酸杂交
（二）核酸探针
1. 什么是核酸探针？ 核酸探针（probe）是指为了检测核酸样品中