浸矿微生物鉴定研究进展

　第16卷第9期　2007年9月

中　国　矿　业

CHINA MINING MAG AZINE

　Vol.16,No.9

September 2007

浸矿微生物鉴定研究进展

陈勃伟,温建康,刘文彦

(北京有色金属研究总院生物冶金国家工程实验室,北京100088)

摘　要:为了探明浸矿过程中微生物的组成,通过比较浸矿微生物鉴定的常规方法、免疫学方法和分子生物学方法的优缺点,并参考研究现状,指出利用现代分子生态学的方法可快速鉴定浸矿微生物,多种方法组合使用可获得更加全面的浸矿微生物组成演替信息。 关键词:浸矿微生物;生物冶金;分子生物学方法;免疫学方法

中图分类号:TF111131+1 文献标识码:A 文章编号:1004-4051(2007)09-0103-04

Progress in identif ication of bioleaching microorganisms

CH EN Bo 2wei ,WEN Jian 2kang ,L IU Wen 2yan

(National Engineering Laboratory of Biohydrometallurgy ,G eneral Research

Institute for Nonferrous Metals ,Beijing 100088,China )

Abstract :In order to explore the composition of microorganisms in the bioleaching process ,in terms of

present research situation ,advantages and disadvantages of conventional methods 、immunological methods and molecular biological methods for identification of bioleaching microorganisms is compared 1It is pointed out that the use of modern molecular ecological methods can quickly identify bioleaching microorganisms ,while the integration of several methods can get more comprehensive information about constitution and suc 2cession of bioleaching microorganisms 1

K ey w ords :bioleaching microorganisms ;biohydrometallurgy ;molecular biological methods ;immuno 2

logical methods

收稿日期:2007-05-11

基金项目:“973”课题(2004CB619205)资助项目

作者简介:陈勃伟(1984-),男,汉,陕西乾人,硕士研究生,主要研究方向为生物冶金。

随着我国矿产资源的不断开发利用,富矿资源日趋贫乏,以贫、细、杂为突出特点的难选冶矿石,所占比例不断上升,致使常规的选冶方法,在技术和经济两方面都面临严峻的挑战。对于铜、金、铀等金属需求量的不断增加以及成本的节约化,促使冶金技术的不断进步,由此产生了生物冶金技术。生物冶金技术具有工艺简单、流程短、装备简单、投资小、成本低、污染轻、资源消耗量小以及能够处理低品位矿等诸多优点,适合社会可持续发展的要求,因此,生物冶金技术的开发研究,己经成为矿产资源利用领域的前沿研究课题。随着生物冶金技术研究的不断深入,学者对在生物浸矿体系中起关键作用的浸矿微生物的研究越来越多。本文将对浸矿微生物鉴定的常用方法进行综述,为

浸矿微生物的鉴定提供一定的参考,以便能更好的利用生物冶金技术。1　常规方法

微生物鉴定的常规方法,是指通过纯培养,获得纯菌株后,将测定的细胞的形态学、生理学、生态学的各种指标,与权威性的菌种鉴定手册比较,获得菌种的分类信息〔1〕。早期的鉴定,就是通过此方法进行的,但是,这种方法需要的时间长,而且有些浸矿微生物难以获得纯培养。Johnson 〔2〕曾通过平板培养的方式,发现有机物对专性自养菌

A ci dit hiobacill us f erroox i dans 有毒害作用,导致

它很难在固体琼脂培养基上生长,但通过夹层培养或引入异养菌A ci di p hil um ,可获得纯的A t 1f er 2

roox i dans 。由此可以推断,早期获得的纯的A t 1f erroox i dans ,有可能是A t 1f erroox i d ans 和A ci 2di p hil um 的混合菌株。

2　免疫学方法211　免疫荧光法

中国矿业第16卷

免疫荧光法是一种使结合有荧光素的抗体与抗原进行反应,借以提高免疫反应灵敏度和适合显微镜观察的免疫标记技术。Baker和Mills〔3〕将荧光抗体(Fluorescent antibody,FA)和22(p2Iodo2 p henyl)232(p2Nit rop henyl)252Phenyltet razolium Chloride(IN T)结合,此技术又称为FA IN T。他们利用FA IN T技术研究了酸性和非酸性环境中T hiobacill us f erroox i d ans的分布。通过比较FA IN T技术,荧光抗体染色和M PN(Most Prob2 able Number),结果表明,M PN低估活细胞数12 3个数量级,而荧光抗体染色估计过高。

212　斑点免疫测定法

该方法是J erez〔4〕提出来的,可以快速特异性鉴定T1f erroox i dans、L1f erroox i d ans和T hio2 bacill us t hioox i dans。该方法的基本过程为:首先,将要鉴定的细菌以硝酸纤维素滤膜过滤,使细菌呈点状分布在膜上。然后,用一次抗体和细胞反应,再与酶结合的可以和一次抗体特异结合的二次抗体反应。酶通过催化无色底物产生有色底物,斑点中要鉴定细菌的数量与有色底物的多少成正比。同时,做一细菌数已知的对照试验,通过计算机图像分析软件,来确定斑点中细菌的数量。该方法可以检测的最低限为每个斑点103个细胞。

3　分子生物学方法

对于浸矿微生物的检测,免疫学方法是针对某一种已知菌或多个菌种的检测。但是,随着人们对于浸矿微生物的认识逐渐加深,发现能够浸矿的细菌种类很多,而且存在一些未知的菌种。因此,针对单一菌种或者多个菌种的检测,已不能说明浸矿环境中的微生物种群的问题,便逐渐发展出了可以检测微生物种群的技术,这也是随着现代分子生物学的技术而发展起来的,特别是PCR技术。通过PCR扩增后,原有的DNA可以扩增106倍以上,因此,对于分析微量且浓度低的样品特别有效。311　16S rRNA基因序列分析

由于16S rRNA作为原核生物分类的一个标准,因此,将16S rRNA基因全长测序后与现有的数据库比较,就可知道原核生物的分类信息。Okibe等〔5〕用此方法研究了搅拌罐浸出操作中的微生物群落,共分离到4种菌:A t1cal d us、L e pto2 s pi rill um sp1、S ul f obacill us sp1和Ferropl asm a。这些原核生物的相对数量,在三个采样的反应器中是变化的。随着矿物的氧化,Ferropl asm a成为优势菌,而且在第三个反应器中,占到了平板分离的99%以上。证明混合铁氧化菌和硫氧化菌,可加速硫化矿物的氧化,也表明随着矿物的溶解,微生物种群也会随着改变。

312　构建克隆文库

克隆文库的构建分为以下几步:首先提取样品核酸,PCR扩增16S rRNA基因,扩增产物与载体相连,然后将载体转入大肠杆菌,通过固体平板培养的方式,挑选阳性菌落,组成克隆文库。再提取阳性克隆的质粒,测序后与NCB I中的数据库进行比较,就可知道文库中的菌种及数量。郝春博〔6〕通过16S rRNA基因文库的构建,对浸矿微生物生态学进行研究。表明某反应器内嗜酸菌的组成,主要包括五种嗜酸细菌L1f erri p hil um,A1cal d us, S ul f obacill us sp1,A licyclobacill us sp1和革兰氏阳性嗜酸铁氧化菌,其中前三种是稳定存在的。313　PCR2SSCP(PCR2Single St randed Confor2 mation Polymorp hism)

单链构象多态性(Single Stranded Conforma2 tion Polymorp hism)的原理,是基于不同单链DNA的不同折叠构象会影响电泳进程中的迁移率。通过PCR扩增出的DNA,经变性产生两条互补的DNA单链,由于碱基序列及空间构象的不同,在非变性聚丙烯酰胺凝胶中呈现不同的带型。Foucher等〔7〕应用SSCP研究了含钴黄铁矿柱浸和搅拌罐浸出中细菌种群演化,分别研究了吸附在矿石上以及浸出液中的细菌组成。浸出液中,在实验的第一阶段,优势菌为T1cal d us,之后被L1 f erroox i dans代替。吸附在矿石上的优势菌始终为是L1f erroox i dans。S ul f obacill us t hermos ul f i2 doox i dans不是很恒定,似乎在柱浸时生长更好。314　PCR2D GGE(PCR2Denat ured Gradient Gel Elect rop horesis)

变性梯度凝胶电泳(Denat ured Gradient Gel Elect rop horesis)的基本原理,基于当双链DNA 在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时,DNA发生部分解链,电泳迁移率下降,当解链的DNA链中有一个碱基改变时,会在不同的时间发生解链,因影响电泳速度变化过程而被分离。Demergasso等〔8〕采用D GGE对智利的一个低品位粗制硫化铜矿堆浸中的微生物群落进行了一年的监测。第一阶段主要是A t1f erroox i d ans 和古细菌S ul f uris p haera。第二阶段(从2252338天)主要是L eptos pi rill um和Ferropl asm a。第三阶段(从598到749d)S ul f obacill us成为优势菌,Ferropl asm a是唯一检测到的古细菌。

315　荧光原位杂交(Fluorescent In Sit u Hybrid2

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