植物外源基因转化方法及转化子的检测
转基因植物的检测鉴定方法、遗传转化技术及新技术
PCR检测
• PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段 的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达 到ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭 染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出 基因组中的一些顺序。
• 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩 增，因而对外源基因是否整合需要进行扩增产物 的Southern杂交。
＊已获得专利许可
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Site-specific recombinasemediated transgene excision
loxP
Cre
Transgene
loxP
loxP
Cre
Transgene
llooxP
loxP
43
外源基因去除（Gene-deletor)
• “外源基因去除”技术的要点之一是在目标植 物中加入了受DNA调空片段启动子控制的特殊基 因，该基因在启动子的作用下，可根据科学家的 意愿，在需要的时间和部位将外源基因和自身从 转基因植物中切掉，从而使转基因作物的花粉、 种子、果实不再含有外来基因，或将外来基因从 人们所需食用的部分（如植物的茎、叶、块茎） 彻底清除掉，达到用转基因作物生产出非转基因 食品的目的，从根本上解决了长期困扰人们的转 基因植物基因扩散问题和转基因食品的安全性问 题。
ATP
dsRNA
siRNA
蛋白复合物
RISC
靶 正义链
40
mRNA
3、无选择标记转化
• 可消除选择标记基因对转基因作物安全性 方面的影响
• 可消除选择标记基因对重复多基因转化叠 加所带来的困难
41
marker-free转基因植株
• 共转化法＊(基因枪与农杆菌转化) • 转座元法 • 重组酶法＊ • MAT(Multi-auto transformation)法＊ • 替代法＊
植物重组实验报告模板
一、实验名称植物重组实验二、实验目的1. 掌握植物重组技术的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用基因工程技术将外源基因导入植物细胞。
3. 观察和分析重组植物的表型特征，验证基因表达。
三、实验原理植物重组技术是指利用基因工程技术将外源基因导入植物细胞，并通过组织培养等方法使其在植物体内表达的过程。
实验原理主要包括以下几个方面：1. 基因表达调控：通过基因重组技术，将目的基因与载体连接，再将载体导入植物细胞，使其在植物体内表达。
2. 植物组织培养：利用植物组织培养技术，将导入外源基因的细胞培养成植株。
3. 分子生物学检测：通过分子生物学方法，如PCR、RT-PCR等，检测目的基因在植物体内的表达情况。
四、实验材料1. 植物材料：受体植物种子、叶片等。
2. 基因材料：目的基因、载体等。
3. 工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶等。
4. 试剂：DNA marker、Taq酶、dNTPs、Tris-HCl缓冲液等。
5. 仪器设备：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、超净工作台、培养箱等。
五、实验步骤1. 目的基因的克隆：设计引物，利用PCR技术扩增目的基因，并通过限制性内切酶进行酶切，连接到载体上。
2. 载体构建：将目的基因与载体连接，构建重组载体。
3. 重组载体的鉴定：通过PCR、酶切等方法，鉴定重组载体的正确性。
4. 农杆菌转化：将重组载体导入农杆菌，制备转化子。
5. 转化子的筛选：利用抗生素筛选法，筛选出含有重组载体的转化子。
6. 转化子的再生：将转化子接种到培养基上，进行组织培养，获得转化植株。
7. 分子生物学检测：利用PCR、RT-PCR等方法，检测目的基因在转化植株中的表达情况。
8. 表型观察：观察转化植株的生长发育、生理生化特性等，分析基因表达效果。
六、实验结果与分析1. 目的基因的克隆：通过PCR扩增，成功获得目的基因。
2. 载体构建：通过酶切、连接等操作，成功构建重组载体。
3. 重组载体的鉴定：通过PCR、酶切等方法，验证重组载体的正确性。
转化子筛选方法
转化子筛选方法所谓转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移,使受体细胞表现新的遗传性状。
将经转化后的细胞在选择性培养基中培养,即可筛选出转化体（transformant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。
一.a互补所谓基因内互补作用，在LacZ体系中，是指二个彼此互补的突变基因(突变体1缺失LacZ近操作基因区段LacI；突变体2带有完整的近操纵基因而无β-半乳糖苷酶活性），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过α肽互补作用可呈现有功能的β—半乳糖苷酶活性, 进而可分解底物X—gal(5-溴-4-氯—3-吲哚-β—D—半乳糖苷）而产生半乳糖和深蓝色的底物5-溴—4—氯-青定蓝, 使菌落呈现出蓝色反应。
然而，当外源基因DNA片段插入载体中LacZ α肽区段的多克隆位点后，就会阻断α序列的读码结构，使其编码的α肽失去活性，使重组子所在的细菌不能完成α-互补，因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。
根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。
此法又称蓝白筛选法。
二.杂交筛选该法是从基因组文库中筛选目的基因的首选方法。
将噬菌体感染形成的噬菌斑影印在硝酸纤维膜上变性带有目的基因的放射性DNA或cDNA作探针进行杂交放射性自显影杂交信号（黑点）对应的噬菌斑即为阳性克隆。
菌落印迹原位杂交的优点是：适于高密度菌落的筛选,对于噬菌斑平板，它可以连续影印几张同样的硝酸纤维滤膜,获得数张同样的DNA印迹。
因此，能够进行重复筛选，效率高,可靠性强,而且可以连续使用两种或数种探针筛选同一套重组体DNA，是一种最常规的检测手段。
2。
斑点杂交1)重组体DNA或RNA抽提出来。
2）抽提纯化，蛋白质、杂DNA等减少，所以能得到更为确切的结果，既可用于定性,对拷贝数进行相对定量。
3。
Southern blot杂交法原位杂交与斑点杂交都只能鉴定整个重组子中是否会有与探针互补的同源片段, 而Southern blot杂交能将同源片断定位于基因.三.插入失活根据载体分子所提供的表型特征,选择重组体DNA 分子的遗传选择法,可适用于大量群体的筛选,因此是一种比较简单而又十分有效的方法。
植物转基因的操作流程
植物转基因的操作流程
1.制备基因载体：首先要确定所需转入植物的基因，然后将该基因克隆到适当的基因载体中，如农杆菌介导的转化系统中常用的质粒载体。
2. 构建转化质粒：将基因载体与其他必需的元件如启动子、终止子、选择标记等组装成转化质粒。
3. 制备植物材料：选择合适的植物作为转基因植物的母本，如经济作物或模式植物。
4. 农杆菌介导的转化：将构建好的转化质粒通过农杆菌注入到植物的叶片、茎或愈伤组织等处，利用农杆菌的生物学特性，在植物细胞中导入转化质粒。
5. 筛选转基因植物：通过在培养基中加入相应的选择标记，筛选出已经被转化的植物细胞，进而培育出转基因植物。
6. 鉴定转基因植物：通过PCR、Southern blot等分子生物学技术鉴定转基因植物是否成功，同时进行表型分析，确定转基因植物的性状和稳定性。
- 1 -。
基因转化小实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景基因转化是分子生物学领域的一个重要技术，它通过将外源基因导入宿主细胞中，使宿主细胞表达外源基因所编码的蛋白质。
基因转化技术在基因工程、生物制药、农业等领域具有广泛的应用前景。
本实验旨在探究基因转化技术在微生物中的可行性，以期为后续研究提供参考。
二、实验目的1. 了解基因转化技术的基本原理和操作步骤；2. 掌握基因转化实验的操作方法；3. 评价基因转化技术在微生物中的可行性。
三、实验材料1. 实验仪器：PCR仪、凝胶成像系统、离心机、显微镜等；2. 实验试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂、质粒载体、抗生素等；3. 实验菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）。
四、实验方法1. 提取目的基因：采用DNA提取试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA，通过PCR技术扩增目的基因；2. 构建重组质粒：将目的基因插入到质粒载体中，通过连接酶将两者连接，得到重组质粒；3. 转化宿主细胞：采用热冲击法将重组质粒转化到大肠杆菌中；4. 挑选转化子：在含有抗生素的培养基上培养转化子，观察菌落生长情况；5. 验证转化子：通过PCR技术检测转化子中的目的基因，并通过测序验证其正确性。
五、实验结果1. 提取目的基因：通过PCR技术成功扩增出目的基因，片段大小与预期相符；2. 构建重组质粒：通过连接酶将目的基因与质粒载体连接，得到重组质粒；3. 转化宿主细胞：通过热冲击法将重组质粒转化到大肠杆菌中，得到转化子；4. 挑选转化子：在含有抗生素的培养基上培养转化子，观察到部分菌落生长；5. 验证转化子：通过PCR技术检测转化子中的目的基因，结果与预期相符；通过测序验证，目的基因正确插入到质粒载体中。
六、实验讨论1. 本实验成功实现了基因转化，证明了基因转化技术在微生物中的可行性；2. 实验过程中，热冲击法是一种有效的转化方法，转化效率较高；3. 实验结果表明，通过PCR技术和测序验证，目的基因已成功导入宿主细胞，为后续研究提供了基础。
植物转化及转基因的检测
复杂
复杂
简单
昂贵
昂贵
便宜
低
高
低
可行
广泛
广泛
Agrobacterium tumefaciens
Ti plasmid with the new gene
+
cell’s DNA
Agrobacterium
Plant cell
Transformation
The new gene
Tr2a0n20s/6g/20enic plant
Calli are placed in vacuum chamber, Helium pressure shot DNA into cells
Gene gun
vacuum chamber
Calli remain on the high osmotic media for 2020h2o0u/6r/s20 following shooting.
• 早衰
生长期缩短、早孕早穗等
• 对环境敏感
对水、肥、温度、光照敏感
Transformation is performed by gene gun meia prepare calli for transfomation
2020/6/20
福建省农业遗传工程重点实验室
DNA with desired gene and antibiotic resistance is coated onto the surface of gold particles.
借助标记基因和报告基因的快速筛选和纯合
抗生素抗性基因
新霉素磷酸转移酶基因（nptII）——Kanr，G418r
双氢叶酸脱氢酶基因 潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)——hygr 氯霉素乙酰转移酶基因（cat）——Cre
转化子的筛选和重组子的鉴定
转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。
再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。
因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。
一、基本定义：1、转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。
2、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
3、阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。
4、筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。
二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。
（1）方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。
（2）举例：抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。
2、根据报告基因筛选转化子。
（1）报告基因的定义：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。
由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。
（2）成为报告基因的条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。
如：gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。
3、根据形成噬菌斑筛选转化子。
转化子的筛选和鉴定
菌落噬菌斑原位杂交法
菌落原位杂交法的基本操作：
影印
用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板 用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜 用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜 80℃烘干固定影印薄膜 薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温 用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜 用X光胶片覆盖薄膜感光
感光
杂交
洗涤
克隆DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
Cla I
Pst I
Hind III
BamH I
将外源DNA片段插在EcoRI位点： Pst I 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcr
将外源DNA片段插在BamHI位点：
Apr
Tcr
pBR322
4363 bp
ROI ROP
Sal I Bal I
非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcs
限制性酶切图谱法
所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片 段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因 此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定 目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工 作量极大，实验成本也高。
克隆DNA序列检测
限制性酶切图谱法
全酶解图谱法：
或者： 1.0 kb + 5.7 kb
1.0 kb BE
0.8 kb PB
4.0 kb
HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI lacZ’
用PstI酶切转化子质粒DNA 目的重组子： 3.2 kb + 3.5 kb
或者： 0.8 kb + 5.9 kb
5' P
OH 3'
植物基因转化常用方法(植物遗传,农杆菌、病毒介导和基因枪转化法)
一. 植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。
另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
二.农杆菌介导的基因转化方法（一）农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。
它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。
其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。
农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti 质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA 结合，形成复合物，转化植物根部细胞。
T－DNA 上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。
第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。
1. Ti质粒的结构在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti 质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。
Ti质粒大约在160～240kB之间。
其中T-DNA大约在15kb-30kb。
Vir基因区在36kb 左右。
除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。
T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。
转基因技术——动植物转基因方法
转基因 技术
【DAWN_ZX】
转基因技术的步骤
转基因 技术
STEP4：目的基因的检测和表达
1.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目 的基因。 方法：采用DNA分子杂交技术。 2.检测目的基因是否转录出了mRNA。 方法：采用用标记的目的基因作探针与 mRNA 杂交。 3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质。 方法：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的 抗体进行抗原－抗体杂交。 4. 进行个体生物学水平的鉴定。
转基因 技术
【DAWN_ZX】
动物转基因方法
原核显微注射法
胚胎干细胞介导法 逆转录病毒载体法 精子介导的基因转移 核移植转基因法 体细胞核移植法 线粒体介导法
转基因 技术
【DAWN_ZX】
动物转基因方法
原核显微注射法（最常用） •方法：将外源基因注射到受精卵细胞的原核内，
外源基因与胚胎基因组融合后体外培养， 移植到 受体母畜子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一 个细胞都含有新的DNA片段。 •缺点：效率低、位置效应(外源基因插入位点随 机性)造成表达结果有不确定性、动物利用率低。 反刍动物繁殖周期长，有较强的时间限制、需要大 量的供体和受体动物。
转基因 技术
【DAWN_ZX】
植物转基因方法 基因枪介导转换法
•方法：利用火药爆炸或高压气体加速将包裹
了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入 完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组 织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳 性植株即为转基因植株。 •优点:不受受体植物范围的限制，而且其载 体质粒的构建也相对简单，是目前转基因研究 中应用较为广泛的一种方法。
转基因技术的步骤 STEP2：基因表达载体的构建
目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且 可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥 作用。 组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含 有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出 来。常用抗生素基因。
利用不同的方法筛选和鉴定转化子
生物工程上游技术实验综合实验设计利用不同的方法筛选和鉴定转化子摘要本次实验通过蓝白斑筛选、菌落直接PCR、提质粒进行PCR、酶切鉴定的实验方法，采用A mp抗性筛选，利用含有抗性的培养基从转化后代中筛选出转化子，然后在进行相应的鉴定试验，再从相应的重组子中提取质粒，进行酶切实验，电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致，从而达到实验的基本目的，基本掌握了转基因生物筛选鉴定的基本方法。
关键词菌落直接PCR 提质粒酶切鉴定引言在质粒载体上进行克隆时，由于重组质粒转化的大肠杆菌的量少，连接产物没有也不可能在经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。
同时，宿主的转化效率极低，因此，绝大部分宿主是没有被转化的，所以很有必要对转化产物进行筛选与鉴定。
首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。
然后，通过菌落直接PCR从转化子中筛选出候选转基因生物。
最后，从候选重组子中提取质粒，通过凝胶电泳观察质粒的大小,再利用限制性内切酶切割大小符合的质粒.电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致。
一、实验目的通过不同方法组合，筛选获得转基因菌株。
二、实验原理通过抗生素抗性筛选，从转化后代中筛选出转化子。
因为非转化菌没有质粒而缺乏相应的抗生素抗性，所以可将转化产物涂布在含有相应抗生素的培养基上筛选，只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落。
通过菌落直接PCR从转化子中筛选出转基因生物，扩增出特殊目的基因片段，判断所得转化子是否为重组子。
但因为PCR技术的高灵敏性，往往会产生假阳性结果，所以有必要进一步进行鉴定.。
从候选重组子中提取质粒,通过凝胶电泳观察质粒的大小,再利用限制性内切酶切割大小符合的质粒.电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致.三、使用仪器、材料1、材料实验九准备好的菌株。
2、设备用具PCR仪、恒温摇床、台式高速离心机、恒温水浴锅、琼脂糖凝胶电泳装置、电热恒温培养箱、电泳仪、超净工作台、微量移液抢、1.5mL离心管等。
植物基因转化与转基因植株鉴定
3. 目标基因 PCR 扩增 采用 PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 高保真酶从玉米 cDNA 中扩增 ZmMKK4 全长编码序列（GenBank 序列号：NM_001158890.1）。 ZmMKK4 扩增引物：F-ZmMKK4，R-ZmMKK4。 25μL 反应体系为：5 μL 5× PrimeSTAR Buffer (Mg2+ Plus)，2 μL dNTP Mixture (各 2.5 mM)，1μL 上游引物（5μM），1μL 下游引物（5μM），1 μL cDNA，0.25 μL PrimeSTARTM HS DNA Polymerase，加 ddH20 至 25μL。PCR 扩增程序为 98C 98C 58C 72C 72C 1～3 min 10 s 15 s 1.5 min 10 min
图 1 外源基因转化流程图
三、实验目的和实验要求 目的： 学习和掌握从基因分离克隆到植株转化及转基因植株的筛选整个实验 体系。 要求： 综合利用前面的单个实验环节所掌握的知识， 获得完整的实验理念， 并在实验过程中学会设计、构建适合的载体并将外源基因转化植株。 四、实验材料和方法 （一）实验仪器 PCR 仪， 凝胶成像系统， 台式高速离心机， 台式高速冷冻离心机， DU 640 紫 外分光光度计，UV-2450 分光光度计，精密 pH 计，微量移液器，控温摇床，电 子天平，制冰机，-80C 超低温冰箱，电热恒温水浴锅，自动电热压力蒸汽灭菌 器，超净工作台，光照培养箱等 （二）试剂及配方 Trizol试剂，RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit，DNase I，2× PCR Master Mix，FastDigest 限制性内切酶，T4 DNA Ligase，PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 高保真酶， pEASY-Blunt C， 质粒提取试剂盒 （E.Z.N.A. Gel Extraction Kit） ， 凝胶回收试剂盒 （E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I） ， DNA提取试剂盒， Kanamycin （Kan） ，Ampicillin（Amp） ，Carbenicillin（Cb） ，电泳缓冲液，LB培养基、YEB 培养基，烟草培养基如下表1.
植物转基因方法及特点和转基因沉默现象
综上所述，基因沉默可能来源于转基因植株 体内的不同核酸之间的相互作用，即DNA— DNA、DNA—RNA、RNA—RNA的非正常配 对作用而导致基因核苷酸的甲基化作用和 mRNA的降解，从而引发基因沉默。基因沉默 可能是植物防御机制的一种自然现象——在 DNA或RNA水平上抵御外源DNA，就象植物 体内的对细菌、病毒的天然抗性一样[11]。这 一现象给转基因工作者提出了新的难题，它 已经成为转基因技术的严重障碍。它要求我 们不断去探索、改进植物转基因技术，做到 转基因定点、定量转化重要农作物，并得以 稳定、高效表达，从而加速转基因技术在农 业生产中的应用。
2．1 植物转录基因沉默（TGS） 植物转录基因沉默（TGS）
植物转录基因沉默的主要方式有两类：顺式失活和 反式失活。当一个或多拷贝基因整合进入或接近高 甲基化基因组序列时，转基因的顺式失活就可能发 生。这种现象与果蝇中的位置斑驳效应（position effect variegation）很相似[12]。植物中的甲基化可以 象果蝇中的异染色质一样进行传递，当甲基化传递 进转基因中时，就会导致基因沉默[19]。多拷贝基因 整合进一个甲基化位点时也能产生顺式转录沉默， 这种现象又与果蝇中的由于转基因重复延伸而导致 的基因沉默现象类似，即所谓的重复诱导失活[5]。 有时转基因以单拷贝插入一个高甲基化位点也能引 起转录基因沉默[11]。总的来说甲基化（或超甲基化） 和染色质凝集（异染色质化）是与转录基因沉默相 关联的普遍特征[11]。
1．3 显微注射法、电击法及激光法 显微注射法、 显微注射法（microinjection）是用显微注射器 将遗传物质注射到培养细胞中，通过组织培 养最终获得转化植株。此项技术起初主要应 用于动物，八十年代中期开始应用于植物的 遗传转化。虽然该法具有DNA注射的准确性、 预见性、克服远源杂交的困难等优点，但其 又有工作效率低、表达不稳定等缺点，故其 应用受到了限制。自基因枪法诞生以来，这 种转化方法在植物上的应用走入了低谷[2]。
外源基因整合到受体基因组的方法
外源基因整合到受体基因组的方法1. 转化：将外源基因导入到宿主细胞中，使其成为宿主基因组的一部分。
这可以通过转化方法，如化学法、电穿孔法、冷冻法、微弹力法等进行。
2. 转座子：使用转座子作为载体，将外源基因整合到宿主基因组中。
转座子是一种能够在基因组中移动的DNA片段，通过转座子以及其相关的酶的介入，可以实现外源基因的整合。
3. 基因敲入：使用基因编辑技术，如CRISPR/Cas9系统，将外源基因精确地插入到受体基因组的特定位置。
这种方法可以实现有针对性的基因敲入，减少随机整合带来的不确定性。
4. 整合质粒：将外源基因克隆到质粒中，然后将质粒导入到宿主细胞中，使其整合到宿主基因组中。
这种方法通常用于细菌、酵母等微生物的基因整合。
5. 病毒载体：将外源基因导入到病毒载体中，然后利用病毒的复制机制将其导入到宿主细胞中。
病毒载体可以提供高效的基因传递，但需要注意病毒的安全性和限制性。
6. 基因炮：利用基因炮技术，将外源基因以高速粒子投射的方式导入到宿主细胞中。
这种方法可以用于生物多样性较高的组织和植物细胞的基因整合。
7. 卵细胞转染：将外源基因导入到卵细胞中，使其整合到受体基因组中。
这种方法通常用于转基因动物模型的制备，如转基因小鼠。
8. 表达载体：将外源基因克隆到表达载体中，然后将表达载体导入到宿主细胞中，使其以外源基因的形式表达。
这种方法通常用于蛋白质表达和基因功能研究。
9. 基因融合：将外源基因与宿主基因进行融合，使其成为宿主基因组的一部分。
这种方法可以通过基因重组、转座子介入等策略实现。
10. 基因整合：利用特定的基因整合系统，将外源基因整合到受体基因组中。
这些基因整合系统可以利用特异性的酶或蛋白质介导，实现外源基因的整合。
11. 基因突变：利用基因编辑技术，如ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系统，对受体基因组进行定点突变，然后将外源基因整合进去。
这种方法可以用于研究基因功能与表达的关系。
转基因技术——动植物转基因方法
转基因 技术
【DAWN_ZX】
动物转基因方法
原核显微注射法
胚胎干细胞介导法 逆转录病毒载体法 精子介导的基因转移 核移植转基因法 体细胞核移植法 线粒体介导法
转基因 技术
【DAWN_ZX】
动物转基因方法
原核显微注射法（最常用） •方法：将外源基因注射到受精卵细胞的原核内，
外源基因与胚胎基因组融合后体外培养， 移植到 受体母畜子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一 个细胞都含有新的DNA片段。 •缺点：效率低、位置效应(外源基因插入位点随 机性)造成表达结果有不确定性、动物利用率低。 反刍动物繁殖周期长，有较强的时间限制、需要大 量的供体和受体动物。
转基因 技术
【DAWN_ZX】
植物转基因方法 基因枪介导转换法
•方法：利用火药爆炸或高压气体加速将包裹
了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入 完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组 织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳 性植株即为转基因植株。 •优点:不受受体植物范围的限制，而且其载 体质粒的构建也相对简单，是目前转基因研究 中应用较为广泛的一种方法。
【DAWN_ZX】
我们身边的合成生物学
转基因 技术
国际遗传工程的机器设计竞赛
International Genetically Engineered Machine Competition 每年由美国麻省理工学院主办，是合成生物学领域的国 际性学术竞赛。iGEM期望通过竞赛的形式，回答合成生 物学中的核心问题——能否在活细胞中使用可互换的标 准化组件构建简单的生物系统，并且加以操纵。 每支队伍尝试使用标准化后的生物模块元件库，利用标 准化的基因工程方法，以特定目的拼装人工生物系统， 并进行操纵和测量。
实验九利用不同的方法筛选转化子-09级
实验方法
转化方法
采用化学转化、电转化或 基因枪等方法将转化质粒 导入宿主细胞。
筛选方法
利用抗生素或选择剂对转 化子进行筛选，或者通过 荧光显微镜观察荧光蛋白 表达情况。
鉴定方法
采用PCR、测序或酶切等 方法对筛选得到的转化子 进行鉴定，确认目标基因 是否成功导入并表达。
实验步骤
1. 准备宿主细胞和转化质粒，将宿主 细胞培养至对数生长期。
结果讨论
方法比较
根据实验结果，对不同筛选方法 进行比较，分析各方法的优缺点
及适用范围。
结果解释
结合实验原理和相关理论，对实验 结果进行解释，探讨影响转化子筛 选的关键因素。
实验改进
针对实验过程中出现的问题和不足， 提出改进措施和建议，为后续研究 提供参考。
04
不同筛选方法的比较
方法一：基于表达量的筛选
实验展望
01
改进实验方法
在未来的实验中，我们可以进一步改进实验方法，如优化转化条件、提
高转化效率等，以获得更准确、更可靠的实验结果。
02 03
拓展研究领域
本次实验主要关注转化子的筛选和鉴定，未来可以进一步拓展研究领域， 如研究转化子的生物学特性、功能分析等，以更全面地了解转化子的性 质和作用。
加强合作交流
03
实验结果与分析
数据收集与整理
数据来源
从实验过程中记录的各项指标， 包括转化子的生长情况、表达产 物的量等。
数据整理
对收集到的数据进行分类、编码 和标准化处理，以便后续分析。
数据分析方法
描述性统计
相关性分析
对转化子的生长情况、表达产物的量 等指标进行描述性统计分析，包括均 值、标准差、最大值、最小值等。