实验2 细菌的染色和形态观察分解

革兰染色的步骤
1：制片 3：固定 2：干燥 4：染色： 初染：结晶紫 1分钟
媒染：碘液
脱色：95%酒精
1分钟
半分钟
复染：稀释复红
半分钟
革兰染色结果判断
紫
球
碘பைடு நூலகம்
阳
酒
杆
微生物学实验二
细菌的染色和形态观察
（验证性实验）
微生物学教研室 郭棵棵
实验内容
上节课实验结果观察
显微镜油镜头的使用与保护
示教：细菌的基本形态与特殊结构的观察
操作：单染色、革兰染色 材料：葡萄球菌、大肠杆菌肉汤培养物 载玻片 2张/人 1支/6人
教学目标
了解：
1.显微镜油镜镜头的使用与保护
α -溶血
β -溶血
γ -溶血
2）半固体琼脂培养基上细菌生长状态的观察：
清晰（无动力） 注意在穿刺线上细菌生长的状态 向四周扩散（有动力）
3）观察细菌在肉汤培养基上的生长状态： 有无菌膜、菌膜厚度，混浊度， 有无沉淀、沉淀的性质是絮状、粘液状或颗粒状。
空气中细菌的检查——菌落计数的方法
每100cm² 培养基在空气中暴露5分钟，其表面接受自然 沉降的细菌数约相当于10升空气中所含的细菌量。 每块平板的菌落数=4块平板的菌落总数/4 100cm² 面积培养基上的菌落数=（每块平板的菌落数 /πr² ）x100 每 m³ 空气中活菌数=（100cm² 培养基上菌落平均数/30） x1000
2. 低倍镜查找标本视野，加香柏油一滴于标本的待检部位， 换用油镜观察。 3. 从侧面注视油镜头，小心将镜头浸入镜油中，轻柔调节细 调节器进行观察。 4. 观察标本时，双眼同时睁开。 5. 油镜用毕，转动粗调将镜筒提起，取下标本，用擦镜纸沾 少许二甲苯将镜头擦净，然后再用擦镜纸擦去二甲苯。
示教：细菌的基本形态与特殊结构观察
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复染：两种或两种以上染料进行染色。 革兰染色、抗酸染色、荚膜染色等
（一）简单染色
单染染色步骤
1 涂片：
在玻片上滴一滴生理盐水，然后刮取少许菌苔在盐水中乳磨 使之乳化，涂成直径约为0.5cm - 1cm的菌膜。
2 干燥：
最好在室温中自然干燥，也可在远离火焰上方微微烘干。但 切勿靠火焰以免烤焦标本。
3 固定：火焰固定。 固定的作用：杀死细菌；使细菌与玻片粘附牢固；
革兰染色的原理：
等电点学说
化学学说 通透性学说
等电点学说：
革兰阳性菌的等电点（PI 2-3)比革 兰阴性菌的等电点(PI 4-5)低，在pH=7 的染液中，革兰阳性菌所带的负电荷比 阴性菌多，因而摄取碱性染料比较多且 牢固，不易被酒精脱色。
化学学说 ：
革兰阳性菌的细胞内含有某些特殊化 学物质，一般认为是核糖核酸镁盐，能与 染料和碘液结合成为稳定的化学物，不易 被酒精溶解脱色。
正常人体皮肤及随身物品的细菌检查
结果：通常除用碘液消毒的手指外，其余手指或
杂物接触的培养基表面都有数量不等的菌落长出。
观察菌落直径大小，形状，透明度，硬度，表面， 边缘，颜色，菌落与培养基关系等。
呼吸道细菌的检查 — 咳碟试验
观察培养基上的菌落形态并进行计数分析。
显微镜油镜的使用与保护
1. 显微镜直立放稳，打开显微镜光源
单染色法过程
1、涂片：先在玻片上放一滴生理盐水，然后 刮取菌苔在盐水中乳化，涂成直径约为0.5cm的 膜。 2、干燥：在远离火焰上方微微烘干。 3、固定：火焰固定。 4、染色：滴加结晶紫、稀释复红或碱性美兰 液染色1～2分钟后，用细小流水洗去多余的染液。 5、镜检
（二）复染
革兰染色法
丹麦的细菌学家C.Gram 1884年发明革兰染色法
2.细菌的基本形态与特殊结构的观察
3.常用的细菌染色方法
掌握：
1. 细菌单染色和革兰染色的方法和意义
2. 细菌染色标本的制备技术
上次结果观察
细菌的分离接种
1）固体琼脂平板培养基上细菌生长状态的观察：
观察平板上可有不同的菌落长出。
菌落大小； 形状（圆形或不规则）； 硬度（粘稠或易碎）； 透明度（半透明、不透明或透明）； 边缘（整齐、不整齐）； 颜色（色素）； 表面（光泽、粗糙、平滑、凸起、凹下、干燥、湿润等）； 菌落与培养基的关系（粘连、溶血与否）。
以辅助鉴别细菌。
细菌染色多采用碱性染料如美蓝、碱性复红、 结晶紫等，原因在于：
1、细菌蛋白质是两性电解质，等电点较低， 在pI2-5之间。故在近于中性的环境中，细菌多带
负电荷，易与带正电荷的碱性染料结合。
2、细菌胞质中含有大量呈酸性的RNA，也与碱
性染料有亲和性。
细菌的染色方法 单染和复染
单染：用一种染料进行染色
1、细菌基本形态的观察
2、细菌特殊结构的观察
芽胞、荚膜、鞭毛、菌毛
3、特殊染色结果观察
抗酸染色
细菌的染色
细菌是无色半透明的微小生物，肉眼看不到， 必须借助于显微镜才能够观察。然而，未经染色的
细菌标本，在普通光学显微镜下只能粗略地看见其
形态和大小，只有经过染色后才能观察清楚。染色
后镜检，不但可以识别细菌的各种不同结构，还可
使细菌蛋白凝固后保持其固有的外形；改变对染料的通透性。
4 染色： 滴加结晶紫、稀释复红或碱性美兰液1～2滴，使染 液盖满菌膜, 1～2分钟后，用细小流水洗去多余的 染液，在空气中自然干燥或用吸水纸轻轻吸干。 （切忌拖、拉）
5 镜检观察结果： 用结晶紫染色的葡萄球菌、大肠杆菌或变形杆菌成紫色； 复红染色者均为红色；碱性美兰染色者均为蓝色。
通透性学说：
脱色剂较易通过G-菌的细胞壁，将染料和碘 的复合物溶解洗出，故易脱色。G+菌的细胞壁通 透性低，酒精不易通过，故不易脱色。
近年来认为，95%酒精可使G+菌的细胞壁脱 水形成屏障，染料和碘的复合物不能透出；而G菌不仅无此屏障，且其细胞壁的脂类含量较G+菌 多，酒精对其表面脂类的溶解也可能是G-菌容易 脱色的一个因素。