自由基及其检测
生物体系中自由基检测方法评述
生物体系中自由基检测方法评述
1自由基检测方法
自由基产生是生物体系中一个重要的活动，它的检测方法有多种，其中最常用的方法就是自由基检测方法。
自由基检测技术是用来识别和定量危害生物体积质的最有效的方法。
自由基检测方法是通过分析活性自由基来检测外界干扰和内部诱导影响生物体系时产生的自由基。
自由基检测使用了一些特定的荧光指示剂，这些荧光指示剂与受检物体中含有的活性自由基物质发生化学反应，然后荧光指示剂产生强荧光信号，这样就可以用仪器检测，然后从细胞参数中获得更多的信息。
2特点
自由基检测方法有一些显著的优势，比如准确性高、快速、可以定量化，可以直接应用于生物体系中，而且不受探测物质形态或其他变量的影响，可以灵敏检测出低活性自由基水平。
另外，专门的多种指示剂也可以检测出多种不同形式的活性自由基，灵敏度也比较高，而且这种技术的操作也很简单。
3局限性
虽然自由基检测技术具有许多优点，但也有一些局限性，比如受到光的干扰，结果不够可控，而且价格也比较贵，不能检测出非光表达的系统，比如水溶性的自由基。
总的来说，自由基检测方法是一种生物体系中自由基检测的重要方法，它在检测外界干扰和内部诱导影响动态变化中具有重要的作用，它操作方便、灵敏度高，而且可以采集大量信息，但也存在一些不可避免的局限性，因此在应用中还需根据具体情况结合其他技术使用，以便得到最佳效果。
ESR 光生自由基的检测
DMPO-O2·-
ESR——光生自由基的检测 超氧自由基、羟基自由基、空穴、单线态氧等在文献中的报道及特征：
羟基自由基的ESR谱图（DPMO-的ESR谱图）呈现出标 准的四重峰（就是有四个峰），四峰等距15G（相邻 峰的距离是一样的），且四个峰的峰高是1:2:2:1
硫酸根自由基的ESR谱图（DPMO-SO3）呈现出标准的
3260 3280 3300 3320 3340 3360 3380 3400
Fe3+为催化剂第三次实验（1.17）
0.50 0.25
0.2
DMPO _H2O2_Fe3+_1
0.1
0.2
DMPO _H2O2_Fe3+_2
0.1
DMPO _H2O2_Fe3+_3
Indensity
Indensity
Indensity
ESR——光生自由基的检测
单线态氧（.1O2-） 单线态氧是指激发态的氧分子，且自旋多重度为1，这种激发态的氧分子也具有较强的氧化性，但是在光催化过程中，氧气分子不 会直接在光照的条件下就产生单线态氧，而是需要敏化剂受到光辐射激发，再将能量传递给氧分子才能产生单线态氧，而某些染 料就是很好的敏化剂。
ESR——光生自由基的检测
光催化反应的发生是依靠半导体受到光辐射后价带上的电子激发至高能级的导带，在原来的价带留下带有氧化 性的空穴。导带上还原性的电子与价带上氧化性的空穴能够诱发后续的氧化还原反应。但是污染的降解，很多情 况下并不是由电子或是空穴直接进行氧化还原降解，而是电子-空穴先与吸附于光催化材料表面的电子受体或电 子给体进行作用，产生具有 高活性的中间物质，这些物质大多都是自由基。这些自由基能够进攻污染物分子某些 结构并破坏，从而产生氧化降解的效果。因此，对光催化降解中间活性物质-也就是自由基的研究近年来备受关 注，常见的自由基及其特性有以下几种：
具有生物活性的自由基的检测及其生理学意义
具有生物活性的自由基的检测及其生理学意义自由基是一种不稳定的电子，它们的不同反应性使它们对我们的身体产生了巨大的影响。
在医学和生物化学领域，对生物活性自由基的检测和研究，是目前极为热门和前沿的研究领域。
毋庸置疑，对自由基的检测和研究，具有重要的理论和实用价值。
本文分别从自由基的概念和特性、化学性质和生理学意义，阐述了对具有生物活性的自由基的检测方法及其生理学意义。
一、自由基的概念和特性自由基是一种不稳定的分子或原子，它们具有不成对的电子，因而在很多方面表现出与稳定的化合物不同的反应性质。
自由基的存在与活动是伴随着我们生命的各个阶段，任何生物体在生长发育、代谢、呼吸、免疫等过程中都会产生自由基，但这些自由基若产生过多，可引起人体的不良反应，甚至引发一系列的癌症、心血管疾病等。
而自由基的化学性质和特性，也决定了自由基与人体内的其他物质之间发生反应所产生的化学反应机制，如有氧呼吸、氧化，还原。
二、化学性质自由基是一种极其不稳定的粒子，没有正常分子的空间电子构型，从而其能量较低，容易与他物质相互作用，例如最常见的自由基氧自由基（O·）、超氧自由基（·O2-）及其他次级自由基，它们在活性氧的反应过程中会与铁、铜、锌等离子或分子、脂蛋白、谷胱甘肽还原酶等，形成新的反应产物，导致健康问题。
而且自由基十分喜欢攫夺其他分子中的电子，当它们夺得分子中的电子后，这个原子或分子的化学性质也许会发生巨大变化，甚至发生新的化学反应。
三、自由基的生理学意义由于自由基在我们日常生活中的不断存在和产生，因此，对自由基以及细胞内氧化还原状态的检测，已经成为当今生物医学和基础研究领域的一个前沿课题。
这是因为自由基与人体内的其他分子或细胞发生反应后，会随着血液流入心脏、肝脏等重要器官，对这些器官造成不良影响，并且加速了体内大量的自由基的形成，导致健康问题。
目前有很多方法可以检测自由基，其中最常用的是测定人体内的抗氧化能力。
荧光探针的合成及自由基检测研究要点
荧光探针的合成及自由基检测研究摘要荧光分析法在生物化学、医学、工业和化学研究中的应用与日俱增，其原因在于荧光分析法具有高灵敏度的优点，且荧光现象具有有利的时间表度。
由于物质分子结构不同，其所吸收光的波长和发射的荧光波长也不同，利用这一特性可以定性鉴别物质。
荧光探针技术是一种利用探针化合物的光物理和光化学特性，在分子水平上研究某些体系的物理、化学过程和检测某种特殊环境材料的结构及物理性质的方法。
该技术不仅可用于对某些体系的稳态性质进行研究，而且还可对某些体系的快速动态过程如对某种新物种的产生和衰变等进行监测。
这种技术具备极高的灵敏性和极宽的动态时间响应范围的基本特点。
羟基自由基(HO·)和超氧阴离子自由基(O2-·)是生物体内活性氧代谢产生的物质，当体内蓄积过量自由基时，它能损伤细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应。
因此，近些年来人们为了预防这类疾病的发生，自由基的研究已逐渐成为热点。
而快速、灵敏和实用的自由基检测方法就显得十分重要。
荧光探针检测自由基具有操作简便、响应迅速、选择性高等多种优点，我们将着重研究一类苯并噻唑结构荧光探针的合成及其对超氧阴离子自由基(O2-·)的检测。
关键词：荧光探针，苯并噻唑，超氧阴离子自由基，自由基检测SYNTHESIS OF FLUORESCENT PROBES AND DETECTION OF FREE RADICALSABSTRACTApplications of fluorescence analysis method in biochemistry, medicine, industry and chemical research grow with each passing day, the reason is that fluorescence analysis method has the advantages of high sensitivity, and the flurescence phenomenon has a favorable time characterization. Since the molecular structure of different materials, the absorption wavelength and fluorescence wavelength of the emitted light is different, this feature can be characterized using differential substances. Fluorescent probe technology is a method using photophysical and photochemical properties for researching some systems’physical and chemical process at the molecular level and detecting a particular structure and physical property of the special environment material. This technology not only can be used for steady-state nature of certain system, but also can monitore fast dynamic processes of a certain system such as the production and decay of a new species. This technology has the basic characteristics of a high degree of sensitivity and very wide dynamic range response time. Hydroxyl radical(HO-·)and superoxide anion radical(O2-·) is a substance produced in vivo metabolism of reactive oxygen species. When the body accumulates excess free radicals that will damage cells thereby causing chronic diseases and aging effects. Thus, in recent years people in order to prevent the occurrence of such diseases, the study of free radicals has become a hot spot. And fast, sensitive and practical method for the detection is very important. Using the fluorescent probes for the detection of free radicals is a simple, quick response, high selectivity variety of advantages. We will focus on the study of a classof synthetic fluorescent probes of benzothiazole structure and detection of superoxide anion radical.Key words：Fluorescent probes, Benzothiazole, Superoxide anion radical, Detection of free radicals目录1 绪论 (1)1.1 引言 (1)1.2 荧光 (1)1.2.1 荧光的产生 (1)1.2.2 荧光探针结构特点 (2)1.2.3 荧光探针传感机理 (3)1.2.4 常见荧光团 (3)1.2.5 荧光探针的性能 (5)1.2.6 影响荧光探针性能的因素 (5)1.2.7 荧光淬灭 (5)1.3 自由基 (6)1.3.1 自由基的间接检测技术 (6)1.3.2 自由基的直接检测技术 (7)1.4 研究现状 (8)1.4.1 超氧化物歧化酶(SOD)的检测 (8)1.4.2 2-(2-吡啶)-苯并噻唑啉荧光探针 (8)1.4.3 PF-1和PNF-1 (8)1.4.4 香草醛缩苯胺 (8)1.4.5 Hydroethidine类荧光探针 (9)1.4.6 二(2,4-二硝基苯磺酰基)二氟荧光素 (9)1.5 选题背景和意义 (10)1.6 课题研究内容 (10)2 荧光探针的合成 (11)2.1 引言 (11)2.2 还原文献 (11)2.3 新探针合成 (11)2.3.1 2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑 (11)2.3.2 2-(4-氰基苯)-苯并噻唑 (12)2.3.3 2-(苯)-苯并噻唑 (12)2.3.4 2-(4-甲基苯)-苯并噻唑 (12)2.3.5 2-(4-硝基苯)-苯并噻唑 (13)2.3.6 2-(水杨醛)-苯并噻唑 (13)2.4 合成小结 (14)2.5 实验药品及规格 (14)2.6 实验仪器及型号 (15)3 实验结果与讨论 (16)3.1 引言 (16)3.2 荧光性能测试 (16)3.2.1 荧光性能待测溶液配制 (16)3.2.2 荧光性能测试结果 (16)3.2.3 测试谱图 (17)3.3 1H NMR数据 (21)3.3.1 2-(2-吡啶)-苯并噻唑 (21)3.3.2 2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑 (22)3.3.3 2-(4-氰基苯)-苯并噻唑 (23)3.3.4 2-(苯)-苯并噻唑 (24)3.3.5 2-(4-甲基苯)-苯并噻唑 (25)3.3.6 2-(水杨醛)-苯并噻唑 (25)3.3.7 2-(2-噻吩)-苯并噻唑 (26)3.4 反应条件控制及处理 (27)3.5 结论与展望 (27)参考文献 (28)致谢 (30)译文及原文 (31)1 绪论1.1 引言荧光分析法在生物化学、医学、工业和化学研究中的应用与日俱增, 其原因在于荧光分析法具有高灵敏度的优点, 且荧光现象具有有利的时间表度。
自由基的临床检测方法
第31卷第4期吉林医药学院学报V01．31N o．42010年08月Jour nal of J il in M ed i cal C ol l eg e A ug．2010—239一文章编号：1673-2995(2010)04-0239-02自由基的临床检测方法C l i ni cal de t e ct i on m e t hod of f r ee r adi ca l s综述潘黎明1，艾一玖“，林艳茹3(1．北华大学医学检验学院，吉林吉林132013；2．吉林医药学院附属医院，吉林吉林132013；3．北华大学临床医学院，吉林吉林132013)摘要：自由基极不稳定，半衰期短，具有很强的氧化能力，因此在生物体内具有重要的生物学意义。
大量的研究结果表明自由基与许多疾病的发生有密切的关系。
其反应特点为连锁反应，一经启动即可连续发生，且损伤作用累积，其临床检测对疾病的预防有重要的意义。
关键词：自由基；检测；临床应用；基层医院中图分类号：R446．1文献标识码：A近年来随着人们健康意识的提高，疾病的预防和抗衰老越来越受到人们的关注。
众多研究成果显示，自由基不仅关系到人类的衰老，而且与许多疾病的发生、发展和治疗密切有关…。
自由基对人体的损伤作用是累积的【2J，所以如果人们在其累积初期就发现它，就可以预防很多疾病的发生。
目前自由基的检测方法有很多种，按原理分类主要有分光光度法、化学发光法、高效液相色谱法、电--FIJ顷磁共振技术、电化学法、荧光方法和毛细管电泳法，每种方法都有自己不同的特点和适用范围口J。
广义的自由基检测分为三个部分：自由基直接间接检测、自由基清除酶系检测和自由基相关代谢产物的检测。
在临床上应用对检测方法有一定的要求，例如要体外检测，所需费用要在检测者能承受的范围，操作不能太繁琐等等。
本文主要介绍针对医学上疾病的预防、亚健康状态检查和基层医院的临床应用的一些自由基检测方法。
l自由基自由基(f r ee r adi cal)或称游离基(r adi ca l)，是指具有未配对价电子(即外层轨道具有奇数电子)的原子、原子团或分子，如H，C l，O H，R O，R00，N O，N O：，0：。
自由基的检测方法
自由基的检测方法
那可是个让人又爱又恨的家伙！爱它是因为它在身体里也有点小作用，恨它是因为多了就会搞破坏。
那咋检测自由基呢？有个方法叫电子自旋共振法。
把要检测的东西放进去，就像警察在找小偷一样，能把自由基给揪出来。
步骤嘛，先准备好仪器和样品，然后把样品放进仪器里，等着出结果。
注意事项可不少呢！样品得处理好，不然结果可不准。
仪器也得调试好，不然啥也测不出来。
这过程安全不？嘿，只要操作规范，那还是挺安全的。
稳定性也不错，只要仪器不出毛病，结果还是比较靠谱的。
那这检测方法有啥应用场景呢？医院里可以用它来检测病人身体里的自由基水平，看看是不是有啥毛病。
科研机构也能用它来研究自由基的作用。
优势可多啦！检测准确，速度也快。
举个实际案例呗！有个科学家用这个方法检测了一种新的药物对自由基的影响。
哇塞，结果发现这个药物能有效地降低自由基的水平。
这效果，杠杠的！
所以说，自由基的检测方法很重要啊！它能帮我们了解身体的状况，还能为科研提供帮助。
咱可得好好利用这个方法，让自由基在我们的掌控之中。
自由基及检测方法
ESR电子顺磁共振（EPR）或称电子自旋共振（ESR）现象最早发现于1944年。
它利用具有未成对电子的物质在磁场作用下吸收电磁波的能量使电子发生能级间的跃迁的特征，对顺磁性物质进行检测与分析。
自旋捕集方法是将不饱和的抗磁性化合物（自旋捕集剂）加入反应体系,与反应体系中产生的各种活性高、寿命短的自由基结合形成相对稳定的自旋加合物,以适于ESR检测其原理是利用适当的自旋捕捉剂与活泼的短寿命自由基结合,生成相对稳定的自旋加合物,可以用电子自旋共振波谱法检测自旋加合物的数量,利用自旋加合物的数量来计算原来自由基的多少。
H：V：ESR测自由基是怎么被检测的（细胞，组织，溶液？体内，体外？）(MGD)2 - Fe2 +,是含有10mmol·L- 1MGD 和2mmol·L- 1FeSO4的溶液。
体外捕集：处死后取组织（血液、细胞），加入捕集剂，ESR测定体内捕集：腹腔注射捕集剂，处死取组织（血液、细胞），ESR测定腹腔注射几乎没有检测到自由基信号，或者信号很弱，而处死后样品加捕获剂则可以检测到自由基信号。
通用捕获剂典型的自旋捕捉剂是亚硝基化合物或氮氧化合物，把足够量的自旋捕捉剂加入到产生自由基的体系中，自旋捕获剂就会快速地和任何出现的自由基反应，最后给出稳定的可检测的氮样氧自由基加合物。
所形成的自由基加合物的ESR 谱上有被捕自由基基因给出的超精细分裂,可鉴别被捕自由基通用自旋捕获剂所形成的自由基加合物对自由基结构变化相当敏感，ESR 技术检测O-2O-2可以与1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸钠(Tiron)(钛铁试剂)快速反应生成一种称之为“Tiron 半醌自由基”的自旋加合物，比较稳定，可在室温下应用电子顺磁共振波谱仪(EPR)进行检测，从而解决了生理条件下水溶液中寿命极其短暂的O-2·的定性和定量问题ESR 技术检测·OHDMPO作自由基捕获剂对自由基结构变化相当敏感,可以提供自由基结构的详细信息。
核磁共振测自由基
核磁共振测自由基一、简介核磁共振（NMR）是一种强大的无损检测技术，可以对物质的微观结构和动态行为进行深入探测。
自由基，作为许多生物化学反应中的重要活性分子，其检测和分析对于理解反应机制、评估生物医学应用以及环境监测等方面具有重要意义。
核磁共振技术为自由基的检测提供了一种非侵入、非破坏性的手段。
二、核磁共振的基本原理核磁共振技术基于原子核的自旋磁矩。
当这些磁矩在磁场中受到射频脉冲的激励时，它们会发生能级跃迁，释放出射频信号。
通过测量和分析这些信号，可以获得关于分子结构和动态行为的信息。
三、核磁共振在自由基检测中的应用1. 直接检测：一些自由基具有特征性的核磁共振信号，可以直接通过核磁共振谱进行检测和识别。
这种方法尤其适用于那些在生物体内具有重要功能的自由基，如超氧自由基（•O2-）和羟基自由基（•OH）。
2. 动态监测：核磁共振技术还可以用于监测自由基反应的动力学过程。
通过测量自由基浓度的变化，可以深入理解反应机制和反应速率。
这对于评估抗氧化剂、药物等对自由基反应的影响具有重要意义。
3. 结构分析：核磁共振技术结合化学位移和J耦合等参数，可以用于解析自由基的结构，例如取代基的位置和电子效应等。
这对于理解自由基的化学性质和反应活性非常关键。
4. 代谢物追踪：通过核磁共振技术，可以追踪自由基在生物体内的代谢过程，了解其在生物体内的分布和转化。
这对于研究自由基与疾病的关系以及药物开发具有重要意义。
四、核磁共振测自由基的挑战与前景尽管核磁共振技术在自由基检测中具有显著的优势，但仍面临一些挑战。
首先，某些自由基的信号弱、稳定性差，导致检测难度较大。
其次，生物体内的自由基浓度通常较低，这要求检测方法具有较高的灵敏度。
此外，自由基的短寿命和低丰度也给检测带来了挑战。
为了克服这些挑战，研究者们正在不断探索新的技术和方法。
例如，开发高灵敏度的探测器和检测系统，利用超导量子计算技术提高检测的分辨率和灵敏度等。
随着技术的不断进步，核磁共振技术在自由基检测中的应用将更加广泛和深入。
自由基的捕获与检测
自由基是许多化学反应过程的中间体 ,它的寿命是很短暂的 ,可能很快经历进一步的氧化还原反 应而生成反磁性物质. 活性有机反应碎片或反应中间体的分离和鉴定对于理解和证明反应机理是非常 重要的 ,也是令人非常感兴趣的. 自由基中间体在 100 多年前被发现 ,直到最近的几十年才发展了检测 技术 :一是闪光光解与电子自旋共振波谱连用累加[1 ] ;二是自旋捕捉技术与电子自旋共振波谱连用[2 ] . 前者是直接的方法而后者是间接但相对简便的方法. 最近日本的一研究组首次合成了金属离子 ———自 由基中间体配合物 ,是一非常有研究前景的方法[3 ] .
当准确的测量 ,才能区分一个β质子所产生的二级分裂. 谢毓元[5 ]等应用 PBN 作自旋捕获剂研究了超 声作用下苯甲酰呋喃核糖的溴化反应.
每一种自旋捕获剂除能独立地结合自由基外 ,还可以配位使用来鉴别一些较活泼的自由基中间
体. 徐广智[6 ]等用 PBN 、MN P 及 2 、3 、4 、52四甲基亚硝基苯 ND 的配合物用 Braker ER200D2SRC 谱仪 测定苯甲醛及对溴苯甲醛在光作用下的活泼中间体的 ESR 谱.
N=O
MN P 或 tNB ( Ⅱ) 2 - 甲基 2 - 亚硝基丙烷
收稿时间 :1999 - 11 - 28 作者简介 :井强山 (1970 —) ,男 ,河南信阳人 ,信阳师院化工系讲师 ,在读硕士研究生 ,主要从事催化剂及气体净化方面的研究 1
32
许昌师专学报 2000 年 3 月
=
H
,2 R
=
CH3
3 R
=
OH
(3)
1 R = Me ,2 R = H ,PM IO (5)
(Байду номын сангаас)
抗氧化自由基检测的方法及步骤
抗氧化/自由基检测的方法及步骤
一、技术简介
自由基是含有未成对电子的原子、分子或原子团。
它是线粒体在电子传递的过程中产生的，正常情况下，机体的自由基清除系统可使自由基的产生与消除保持在极低的动态平衡水平上，对机体是有利的。
但当体内蓄积过量自由基时，就会损伤细胞，导致动物组织或细胞的氧化损伤。
在抗氧化研究中，自由基的检测已成为至关重要的一环，得到了广泛的应用。
自由基检测的方法多种多样，包括自由基相关酶的测定，化学发光测定，吸光度法等。
以SOD检测为例，介绍其主要原理和实验流程。
超氧化物歧化酶（SOD）是一种抗氧化剂，其主要功能是清除机体内的自由基。
黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺成亚硝酸盐，亚硝酸盐在对氨基苯磺酸与甲萘胺作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。
当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性抑止作用，使可形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于空白管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中SOD的活力。
二、实验流程
1. 从血液或组织中提取超氧化物歧化酶（SOD）；
2. 设置测定管和对照管，加入相应的试剂；
3. 混匀，37℃恒温水浴30min；
4. 加入显色剂；
5. 吸光度检测；
6. 根据公式计算SOD活力。
利用荧光探针探测细胞中的活性氧物质和自由基研究
利用荧光探针探测细胞中的活性氧物质和自由基研究细胞是生命的基本单位，细胞内的许多代谢程序都和氧相关。
但是，过量的氧会产生一些有害物质，如超氧离子和过氧化氢等，它们被称为活性氧物质和自由基。
过多的活性氧物质会损伤细胞的膜、DNA和酶等结构和功能，因此对于维持细胞正常代谢活动和防止细胞氧化伤害的研究非常重要。
近年来，荧光探针技术的应用越来越广泛。
荧光探针是一种通过荧光检测的手段来测定某种化学过程或生物过程的物质。
荧光探针通过与活性氧物质或自由基特有的反应结合，可以有效地测量细胞内的活性氧物质和自由基的含量和分布，是研究细胞氧化伤害的有力工具。
荧光探针常用的类型有三种，分别是实体荧光分子、荧光素探针和荧光蛋白探针。
实体荧光分子比较简单易得，但使用中有一定的局限性。
荧光素探针识别度较高、对活性氧物质和自由基具有很好的特异性。
荧光蛋白探针则是一种基于生物合成的荧光探针，通过蛋白质的结构和功能的改变来产生荧光信号。
利用荧光探针技术可以测量很多活性氧物质和自由基的含量和分布，常见的有超氧离子、一氧化氮、过氧化氢、硝酸盐和羟基自由基等。
其中，羟基自由基的类别较多，如流式细胞术中常用的DCFH-DA和DHE等。
DCFH-DA是一种非极性化合物。
在细胞内，它会被细胞内酯化酶水解成DCFH，被氧化后生成荧光产物 2',7'-二氯荧光素（DCF），从而测量细胞内活性氧物质的水平。
而DHE则可以通过荧光产物ethidium bromide（EBr）先后加上再用流式细胞仪扫描获得到的荧光后，可以得出有关细胞内自由基的信息。
除此之外，荧光探针还可以排除细胞内其他对荧光信号的干扰，如荧光素P的反应可以被氧气和其他自由基和活性氧消耗掉，从而可以增强测量的准确性。
总之，利用荧光探针探测细胞内的活性氧物质和自由基研究，为我们更好地了解生命活动提供了有效的手段。
在未来的科学研究中，荧光探针技术也将发挥更重要的作用。
自由基及检测方法
自由基及检测方法自由基是指具有未成对电子的化学物质分子或离子。
由于不稳定的电子结构，自由基往往具有高度反应性，常常与其他分子发生反应，对生物体和环境产生一定的危害。
因此，检测自由基的方法对于研究其活性和对策的制定非常重要。
首先，常见的检测自由基的方法有光谱法、电化学法和化学法。
1.光谱法：光谱法主要利用自由基与一些指示剂的发色反应，通过测量吸光度的变化来定量分析自由基的浓度。
例如，通过双氧水自由基法测定。
该方法将自由基和一定浓度的双氧水反应，自由基会被消耗，产生的氧会比较多，从而使溶液中的过量双氧水能够分解。
这种分解产生的氧气和标准溶液中的过量双氧水处理后产生的气相氧气一起，通过传递的管道，进入分光光度计中测定吸光度变化。
2.电化学法：电化学法主要是通过测量自由基在电极上的电流和电势来定量分析自由基的浓度。
常用的方法包括电化学阻抗谱法、循环伏安法和常规直线扫描伏安法。
其中，循环伏安法是常用的检测自由基的方法之一、循环伏安法通过改变电极电位并测量电流的变化来研究电化学反应，其中电流的变化与自由基的浓度相关。
3.化学法：化学法主要是利用自由基与一些化学试剂发生特定的反应，从而产生显色、发光等可测量的信号，进而定量分析自由基的浓度。
例如，常用的方法包括酸碱指示剂法和化学荧光法。
酸碱指示剂法通过改变溶液的酸碱度来测定自由基的浓度，原理是自由基的反应会改变溶液中的酸碱物质的浓度，从而改变颜色的变化。
而化学荧光法通过自由基与荧光试剂发生特定反应产生荧光，通过测量荧光的强度来定量分析自由基的浓度。
此外，还有一些特殊的检测方法：1.ESR(电子自旋共振)法：该方法依托于电子自旋共振光谱，通过测量自由基与电磁波之间的相互作用来分析自由基的存在与浓度。
具体操作是将样品放入ESR仪器中，通过照射样品产生磁场，使得自由基的电子自旋发生改变，进而可以观察到共振信号的变化。
2.活性氧自由基检测技术：活性氧自由基是一种特殊的自由基，可以通过特定的抗氧化物质捕捉或与特定的荧光染料反应来进行检测。
羟基自由基的产生与测定
-
但在制浆化学领域 , 目前有关羟基自由基的研 究还很少 ,特别在国内还未见报道 。由于自由基非 常活泼 ,存在的寿命非常短 ,一经产生就会马上与邻 近的化学结构发生反应 , 因而给有关的测定与研究 造成一定的难度 。根据查阅的有关文献 , 以下介绍
H2 O2 + M n + H2 O2 + M HOO
-
H2 O2 → 2 ・
( 当漂白温度达 130 ℃ 时迅速发生) 近年来已得到研究和应用的压力高温过氧化氢 漂白就是在适当的高温条件下 ( 当温度接近和超过
100 ℃ 时 , 需 在 压 力 条 件 下 避 免 漂 液 沸 腾) 利 用 HOO - 与 HO・ 等自由基的协同作用 , 大幅度提高漂
《造纸科学与技术》 2003 年 第 22 卷 第 6 期
COOH OH + HO・
COO H OH + HO OH
COO H OH +
COO H OH
( 水杨酸) (2 ,3 - 二羟基苯甲酸 ,49 %) (2 ,5 - 二羟基苯甲酸 ,40 %) (11 %) 产物中的 2 ,3 - 二羟基苯甲酸和 2 ,5 - 二羟基苯甲酸 的铈离子 ( Ce3 + ) 在稀硫酸介质中能产生特征荧光 , 可用 HPL C 进行分离与测定 。李立平等利用这一原 理测定 Fenton 反应产生的 HO・ ,结果表明 HPL C 谱 图中由 2 ,3 - 二羟基苯甲酸和 2 ,5 - 二羟基苯甲酸出 现的两个峰面积与 Fe2 + 和 H2 O2 浓度之间存在线性 其最 大 激 发 波 长 和 发 射 波 长 分 别 为 280nm 和
自由基化学简述二氧化氮自由基的来源、清除和检测方法
简述二氧化氮自由基的来源、清除和检测方法自由基，化学上也称为“游离基”，是含有一个不成对电子的原子团。
由于原子形成分子时，化学键中电子必须成对出现，因此自由基就到处夺取其他物质的一个电子，使自己形成稳定的物质。
在化学中，这种现象称为“氧化”。
我们生物体系主要遇到的是氧自由基，例如超氧阴离子自由基、羟自由基、脂氧自由基、二氧化氮和一氧化氮自由基。
加上过氧化氢、单线态氧和臭氧，通称活性氧。
体内活性氧自由基具有一定的功能，如免疫和信号传导过程。
但过多的活性氧自由基就会有破坏行为，导致人体正常细胞和组织的损坏，从而引起多种疾病。
如心脏病、老年痴呆症、帕金森病和肿瘤。
此外，外界环境中的阳光辐射、空气污染、吸烟、农药等都会使人体产生更多活性氧自由基，使核酸突变，这是人类衰老和患病的根源。
一般情况下，生命是离不开自由基活动的。
我们的身体每时每刻都从里到外的运动，每一瞬间都在燃烧着能量，而负责传递能量的搬运工就是自由基。
当这些帮助能量转换的自由基被封闭在细胞里不能乱跑乱窜时，它们对生命是无害的。
但如果自由基的活动失去控制，超过一定的量，生命的正常秩序就会被破坏，疾病可能就会随之而来。
特别是二氧化氮自由基，随着吸烟者人数的增加、空气环境的污染程度的加重，都直接或间接的导致了人体内二氧化氮自由基数量的增加。
N02主要来源于煤炭燃烧和汽车尾气排放,室内N02主要来源于燃煤灶、燃气灶的使用和抽烟等。
近年来,关于N02诱导各类疾病病死率上升的流行病学数据大量涌现,特别是有学者指出,N02会影响心脑血管系统和神经功能,并提示肺和支气管不是N02毒性作用的唯一靶器官。
因此在第一部分实验中,我们首先对正常大鼠进行了不同浓度(0、5、10和20 mg/m3) N02的吸入染毒处理,进而从氧化应激、炎性反应和细胞凋亡等多个角度考察了N02对心脑组织的毒性作用。
所以说自由基是一把双刃剑。
认识自由基，了解自由基对人体的作用，对健康十分必要。
自由基及检测方法
ESR电子顺磁共振（EPR）或称电子自旋共振（ESR）现象最早发现于1944年。
它利用具有未成对电子的物质在磁场作用下吸收电磁波的能量使电子发生能级间的跃迁的特征，对顺磁性物质进行检测与分析。
自旋捕集方法是将不饱和的抗磁性化合物（自旋捕集剂）加入反应体系,与反应体系中产生的各种活性高、寿命短的自由基结合形成相对稳定的自旋加合物,以适于ESR检测其原理是利用适当的自旋捕捉剂与活泼的短寿命自由基结合,生成相对稳定的自旋加合物,可以用电子自旋共振波谱法检测自旋加合物的数量,利用自旋加合物的数量来计算原来自由基的多少。
H：V：ESR测自由基是怎么被检测的（细胞，组织，溶液？体内，体外？）(MGD)2 - Fe2 +,是含有10mmol·L- 1MGD 和2mmol·L- 1FeSO4的溶液。
体外捕集：处死后取组织（血液、细胞），加入捕集剂，ESR测定体内捕集：腹腔注射捕集剂，处死取组织（血液、细胞），ESR测定腹腔注射几乎没有检测到自由基信号，或者信号很弱，而处死后样品加捕获剂则可以检测到自由基信号。
通用捕获剂典型的自旋捕捉剂是亚硝基化合物或氮氧化合物，把足够量的自旋捕捉剂加入到产生自由基的体系中，自旋捕获剂就会快速地和任何出现的自由基反应，最后给出稳定的可检测的氮样氧自由基加合物。
所形成的自由基加合物的ESR 谱上有被捕自由基基因给出的超精细分裂,可鉴别被捕自由基通用自旋捕获剂所形成的自由基加合物对自由基结构变化相当敏感，ESR 技术检测O-2O-2可以与1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸钠(Tiron)(钛铁试剂)快速反应生成一种称之为“Tiron 半醌自由基”的自旋加合物，比较稳定，可在室温下应用电子顺磁共振波谱仪(EPR)进行检测，从而解决了生理条件下水溶液中寿命极其短暂的O-2·的定性和定量问题ESR 技术检测·OHDMPO作自由基捕获剂对自由基结构变化相当敏感,可以提供自由基结构的详细信息。
esr谱测羟基自由基和超氧负离子
esr谱测羟基自由基和超氧负离子
ESR谱是一种用于检测未配对电子存在的电子磁共振技术，常用于化学反应中自由基的检测。
羟基自由基和超氧负离子都是自由基，具有未配对的电子，因此可以通过ESR谱进行检测。
在ESR谱实验中，通常使用微波和静磁场来探测自由基。
当样品被置于磁场中时，其中的自由基会受到磁场的力作用，从而产生一个信号峰型。
通过分析信号峰型的特点，可以推断出自由基的种类和浓度。
对于羟基自由基和超氧负离子的检测，可以采用特定的自旋捕获剂将它们转化为稳定且可检测的自由基。
例如，常用的自旋捕获剂有DETC和TEMP等，它们可以与羟基自由基或超氧负离子反应，生成稳定的自由基产物，从而在ESR谱中观察到相应的信号峰型。
需要注意的是，ESR谱对于自由基的检测具有较高的灵敏度，但实验操作也较为复杂，需要专业的技术和设备支持。
同时，由于自由基的寿命较短，因此在实验中需要注意样品的保存和制备。
自由基的检测
自由基检测方法自由基检测方法＊赵宝洪1，高洪1*（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201；2.海关总署缉私局瑞丽缉毒犬基地，云南瑞丽678600）摘要：自由基是含有未成对电子的原子、分子或原子团，它是线粒体在电子传递的过程中产生的，正常情况下，机体的自由基清除系统可使自由基的产生与消除保持在极低的动态平衡水平上，对机体是有利的，但当体内蓄积过量自由基时，它能损伤细胞，导致动物组织或细胞的氧化，损害细胞膜上的脂类和蛋白质等，从而使细胞膜黏度增加，流动性下降，抗氧化酶丧失活性，造成膜内外离子交换紊乱等，致使细胞内钙离子超载，黄嘌呤氧化酶活性升高，又进一步加速自由基的产生。
为提高自由基对动物机体损伤的诊断效率，近年来自由基检测方法在病理学、生物学中发展迅速，并得到了广泛应用。
关键词：自由基；检测方法；概述自由基(free radicals，FRs)化学反应性极强，极不稳定，半衰期短，其化学反应性的特点是连锁反应，一经启动即可连续发生。
从生物学角度讲，通常所说的FRs主要是指活性氧(active oxygen)，即氧的某些代谢产物和一些反应的含氧产物。
由于FRs具有活泼的化学反应特性，因而在生物体内具有重要的生理及病理功能，具有重要的生物学意义[14]。
自1900年，Gomberg M首次证实三苯甲基自由基以来，自由基参与生命过程中许多重要的生化反应逐步为人们所认识，特别是随着现代检测分析技术的日新月异，自由基在生物和病理学领域的作用研究迅速发展。
而寻求简便、快速、准确、高效的自由基检测方法成为研究自由基生物学作用的关键[5]。
与医学密切相关的自由基是氧自由基(oxygen free radical，OFR)，包括超氧阴离子和羟自由基，大量研究结果表明自由基与许多疾病的发生有着密切的联系，特别是与生物膜损伤的关系更是目前研究的热点[69]。
自由基已日益受到人们的重视，现将自由基的检测方法介绍如下。
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GSH+5,5’-DTNB
5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子
二硫对硝基苯甲酸
于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算 出GSH减少的量
分光光度法检测自由基清除能力 (DPPH)
• DPPH・是一种稳定的自由基,其醇溶液呈深紫色,在 517nm处有一吸收峰。
• 当反应系统中存在自由基清除剂时,它可以和DPPH・ 的单电子配对而使517nm处的吸收峰渐渐消退。
未成对电子
自由基在夺取正常分子的电 子后，该分子就变成另一个自 由基， 如此循环，就会引发连 续的氧化反应，最终对机体产 生重大影响！
自由基的产生与分类
机体生理活动产生
机体的新陈代谢需要由氧化反应产生的能量， 这些氧化反应就是自由基的重要来源。
内源性自由基的产生
➢自由基的分类 机体内的自由基主要分为氧自由基和
自由基的清除
• 机体内存在着一套内源性抗氧化防御系统 ，它可以维持体内自由基代谢的平衡，使 人体处于健康状态。
直接
•与产生反应性氧化物（ROS）所 必需的金属离子结合，从而抑制 ROS的生成。 •通过补充合成抗自由基酶的必需 元素，提高酶促系统的合成能力。
酶促系统
➢ 超氧化物歧化酶（SOD）歧化自由基O-2生成H2O2
亚硝基化合物 或氮氧化合物
NO
O-2·
·OH
血红蛋白
N-甲基葡萄糖胺-铁 复合物（MGD）
1，2-二羟基苯-3， 5-二磺酸钠(Tiron)
5, 5-二甲基1-吡咯 啉N-氧化物(DMPO)
• 总结
优点 可在室温下进行检测，解决了生理条件下
水溶液中寿命极其短暂的自由基的定性和 定量问题。 缺点 ➢有些自旋捕集剂对生物体有毒,有些易受到 血脑屏障限制,无法到达自由基生成的组织 部位; ➢被捕获的自由基不专一,而且ESR法难以清 晰的解释被捕获的自由基种类,需要待测自 由基的清除剂加以佐证; ➢仪器成本较高
分光光度法
• 基本原理 利用自由基使显色剂发生颜色变化 , 根据 吸光度的变化值而间接测得自由基的含量
• 应用 ·OH、O2-、NO、SOD、CAT、GSH-Px、自
由基清除能力的测定
分光光度法检测·OH
分光光度法检测O2-
分光光度法检测NO
分光光度法检测CAT
2H2O2 CAT 2H2O+O2 体系中残留的过氧化氢再与钼酸胺作用生成黄色复 合物,其呈色的深浅可用分光光度计进行测定
325nm、 420nm
碱性
邻苯三酚
中间体A O2 中间体B H2O2 终产物
O2-
SOD
2O2-+2H+
O2+H2O2
分光光度法测GSH-Px
• 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）对防止体 内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其 活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位 时间内GSH减少的量来表示
GSH-Px
•高效液相色谱法（HPLC）
•自动电位滴定法
•极谱法
自旋共振波谱仪(ESR)自旋捕获法
顺磁共振波谱仪示意图
• 生物体内能直接用ESR技术检测研究的自 由基很少，因为体内绝大多数自由基的反 应活性非常高，半衰期很短，使其浓度很 低（10-8M- 10-10M），不能达到目前ESR 技术的检测水平（10-6M -10-7M）
自由基的检测
主要内容
自由基简介 自由基及其性质 自由基的产生与分类 自由基与机体损伤 自由基的清除
自由基的检测方法
自由基及其性质
1.自由基（free radical）
化学上也称为“游离基”，是指带有不成对（ 奇数）电子的原子、原子基团或分子。
2.自由基，具有高度活泼性，很容易夺取其他物质
的电子而转变为稳定状态。在化学上，这种现象 称为“氧化”。
分光光度法检测SOD
1、细胞色素C还原法
SOD 歧化
黄嘌呤-黄嘌呤氧化 酶体系
氧化型细胞色素C O-2还原型细胞色素C
550nm
2、氯化硝基四唑氮蓝 （NBT）还原法
SOD 清除
NBT
O-2
二甲臜
560nm
反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反 之酶活性愈高. 据此可以计算出酶活性大小
3、邻苯三酚自氧化法
脂质自由基
氧自由基包括超氧阴离子自由基O2-、羟自由基
• OH
脂质自由基（LPO）是细胞膜上的不饱和脂肪酸 被自由基夺去电子后所产生的。
氮中心自由基：一氧化氮（NO）、过氧亚硝基阴 离子（ONOO-） 等。
自由基与机体损伤
➢在受控情况下对机体是有益的,也是必需的 自由基是能量传递的搬运工。 自由基可以帮助杀灭细菌、病毒和寄生虫 ，还能参与排除毒素。 信使分子。
• 根据消退速度和峰值改变程度可了解反应系统中自由 基清除剂的反应速度和能力。
• 解决这一困难的重. + ST → R-SA•∗
自由基
自旋捕获剂 (一般为抗磁 性物质 )
自由基加合物 （radical adduct, 长寿命自由基）
使自由基加合物的浓度积累到能被ESR检 测到的水平
自由基捕获剂
通用自旋捕获剂
特异自旋捕获剂
*NO作为信使分子， 作用于平滑肌，使 血管扩张 硝酸甘油
➢ 自由基的危害
自由基过量，并失控时，机体的正常秩序就会被 破坏，并因此产生多种疾病。
➢自由基的损伤机理 1.损伤细胞膜结构 2.导致免疫系统功能紊 乱 3.损伤基因，导致DNA 变异
1.损伤细胞膜结构 自由基对细胞膜结构的损伤，主要是
自由基与细胞膜上丰富的不饱和脂肪酸反应， 形成脂质过氧化物（即LPO）而影响膜的正 常功能。
2O-2+2H+ SOD O2+H2O2
➢ H2O2可被过氧化氢酶（CAT）分解为H2O
2H2O2 CAT 2H2O+O2
➢ 谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）中的巯基能与活性 氧结合，终止脂类自由基（LPO）的生成。
自由基的检测方法
• 自旋共振波谱仪(ESR)自旋捕获法 • 分光光度法 • 化学发光法 • 荧光分析法 • ·OH的其他检测方法
2.导致免疫系统功能紊乱
*自由基抑制淋巴细胞的增生分化，抑制其对刺激 原的反应性；
*改变K细胞和NK细胞的结构及功能，使其对靶细胞 的识别能力减弱；
*被自由基损伤的部分细胞自动修复，而修复后的 细胞具有了抗原性，干扰正常的免疫功能。
3.损伤基因，导致DNA变异
自由基可使DNA断裂或交联，从而诱发基因突 变或癌变。