基于ITS序列位点特异性PCR的肉苁蓉与其混伪品的鉴别研究

基于ITS序列位点特异性PCR的肉苁蓉与其混伪品的鉴别研究研究荒漠肉苁蓉、锁阳和黄花列当之间的DNA分子鉴别方法，采集不同产地的30份荒漠肉苁蓉，13份锁阳以及8份黄花列当，所有样品进行总DNA提取，通过对其ITS片段进行扩增，测序。

再进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物，并对位点特异性PCR的反应条件进行了优化；另外，对位点特异性PCR法与DNA序列分析法的鉴别进行了比较。

结果显示，该研究设计的位点特异引物在同一PCR反应中，荒漠肉苁蓉能扩增出331 bp的条带，而混伪品锁阳和黄花列当不能扩增出条带，从而实现了正伪品的鉴别。

该文通过位点特异PCR的方法可以实现荒漠肉苁蓉与混伪品锁阳、黄花列当的快速、准确鉴别。

标签：荒漠肉苁蓉；位点特异性PCR；分子鉴定肉苁蓉Cistanche Hebra，又名大芸、甜大芸、苁蓉、甜苁蓉、地精等，为我国传统名贵中药材，具有补肾阳，益精血，润肠通便的功效，主治阳痿、不孕、腰膝酸软、筋骨无力、肠燥便秘等。

其应用始载于《神农本草经》，被列为上品药材[1]。

其在历代增力中药处方中出现率最高，同时在抗衰老类方剂中的出现率仅次于人参，居于第2位，故其具有“沙漠人参”的美誉[2-3]。

2000年版《中国药典》之前规定的药材肉苁蓉来源为列当科植物荒漠肉苁蓉Cistanche deserticola Y.C. Ma的干燥带鳞叶的肉质茎[4]。

但是近年来，由于野生肉苁蓉资源已濒临枯竭，肉苁蓉及寄主梭梭已被列为国家二级保护植物，同时也被列入濒危动植物种国际贸易公约（CITES）[5]。

因此，从2005年版《中国药典》开始，将荒漠肉苁蓉与资源较丰富的管花肉苁蓉 C. tubulosa （Schenk）Wight[6]共同作为肉苁蓉药材的基原植物。

近年来，由于中医药事业的大力发展，导致肉苁蓉需求量大增，货源短缺，目前，市场上肉苁蓉的售价大约125元/kg，列当类药材大约30元/kg，锁阳大约15元/kg，因此，在巨大利益的趋势下，市场上常发现将黄花列当或者锁阳掺杂其中冒充肉苁蓉的现象[7-8]。

其中黄花列当Orobanche pycnostachya Hance.为列当科列当属植物，全草入药，具有补肾助阳、强筋骨的功能[9-10]；锁阳Cynomorium songaricum Rupr.为锁阳科锁阳属植物，具有补肾、助阳、益精、润肠的作用[11]。

肉苁蓉，黄花列当及锁阳3种药材经过加工后性状较为相似，虽也同为补阳药，但在性味、归经、功能主治不尽相同。

因此，建立一种用于快速、准确鉴别肉苁蓉药材的方法对于保障人民用药安全以及规范肉苁蓉市场的流通具有重大意义。

肉苁蓉药材鉴别的方法较多，包括原植物鉴别[12]、性状鉴别和显微鉴定[8，13]以及理化鉴别[14-15]等，但这些鉴别手段常常受到人为或环境因素的影响。

与之相比，分子标记技术因具有稳定、不受器官和环境因素影响的特点。

目前已报道的肉苁蓉分子鉴别方法是采用DNA条形码通用基因片段ITS2[16]和psbA-trnH[17]，通过基于对序列差异分析来达到肉苁蓉药材的真伪鉴别，但是该鉴别方法繁琐并周期时间长（包括扩增，测序，序列分析等），导致不能满足实际需求，因此急需建立稳定、简单、快捷、通用性好的分子鉴别方法。

近年来，位点特异性PCR方法已成功用于人参[18]，金银花[19]，黄芪[20]等中药材的真伪鉴别，因此本研究通过位点特异性PCR方法对荒漠肉苁蓉及其混伪品锁阳和黄花列当进行鉴别研究，并尝试对真伪混伪品进行鉴别探索，为肉苁蓉药材的鉴别提供更符合实用要求和简单快捷的方法。

1 材料2×CTAB提取液，1×TAE缓冲液，琼脂糖（Promega公司），溴化乙锭（Fluka 公司），DNA Taq聚合酶（Takara公司），2 000 bp DNA Markar（Takara公司），三氯甲烷﹑无水乙醇﹑异丙醇均为国产分析纯。

PCR仪（德国Eppendorf，型号5332），电泳系统（北京市六一仪器厂，型号DYY-12），低温冷冻离心机（德国Eppendorf，型号5810R），紫外凝胶成像分析仪（英国Syngene，型号GBOXHR），混合型球磨仪（德国Retsch，型号MM400），数控超声波清洗器（型号KQ-500DE），微量移液器（德国Eppendorf）。

本实验选取的51份材料包括荒漠肉苁蓉30份，黄花列当8份，锁阳13份，分别于2013年在内蒙古和甘肃等地的野外采集，鉴定人为张春红。

凭证标本保存于内蒙古科技大学包头医学院。

名称、采集地点等见表1。

2 方法2.1 基因组总DNA的提取、PCR扩增条件的确定取100 mg干燥材料，使用CTAB法提取总DNA。

取不同样品DNA，终浓度大约为50 mg·L-1，使用通用引物ITS1和ITS4进行PCR反应以检测模板DNA质量。

PCR反应体系总体积为25 μL，包括2.5 μL 10 × Ex Taq buffer缓冲液，2 μL （10 mmol·L-1）dNTPS，引物各0.25 μL（10 pmol·L-1），Ex Taq酶0.2 μL（5 U·μL-1），DNA 1 μL，灭菌蒸馏水19.8 μL。

PCR反应液配制完后，轻轻震荡混匀，将PCR管放入PCR仪进行PCR反应，反应程序见表2。

取3 μL扩增产物，并加入3 μL 6×loading buffer，通过1%的琼脂糖凝胶电泳，并用EB染色观察。

阳性结果的PCR产物由上海美吉生物医药科技有限公司北京分公司测序部测序，各样品均采用正向和反向测序，以保证测序的准确性。

2.2 ITS序列分析将3种药材荒漠肉苁蓉，黄花列当以及锁阳的51个个体的ITS序列进行比对分析，所得DNA序列用CONTIG软件同源对齐，并辅以人工校对。

排序后的序列使用BioEdit分析软件进行分析处理。

用MEGA 4.0 软件对各样品ITS序列的差异性进行分析，并采用邻接法（NJ 法）构建系统发育树，并以Bootstrap作1 000次可信度分析，且cutoff取不小于50%。

2.3 鉴别引物的设计用BioEdit分析软件对ITS序列进行分析、多重比对，找出具有稳定差异的变异位点，筛选获得变异位点，通过该位点利用Primer Premier 5.0软件设计一对用于荒漠肉苁蓉鉴别的特异引物CD_1F/CD_1R，设计的特异引物扩增后片段大小为331 bp，引物序列见表2。

2.4 位点特异性PCR鉴别反应的建立取荒漠肉苁蓉，锁阳和黄花列当不同样品的DNA进行位点特异性PCR，PCR反应体系为2.5 μL 10 × Ex Taq buffer缓冲液，2 μL （10 mmol·L-1）dNTPs，特异鉴别引物各0.25 μL（10 pmol·L-1），Ex Taq酶0.2 μL（5 U·μL-1），DNA 1 μL，灭菌蒸馏水19.8 μL，反应程序见表2。

反应结束后，取3 μL扩增产物，并加入3 μL 6 × loading buffer，通过1%的琼脂糖凝胶电泳，并用EB染色观察。

另外，为获得最优的位点特异性PCR反应条件，对其反应条件进行优化，分别考察了退火温度，PCR循环数、引物浓度、dNTP用量对PCR反应稳定性的影响。

3 结果与结论3.1 肉苁蓉及其混伪品的ITS序列分析及系统发育树的构建本实验使用通用引物ITS1-ITS4对不同样品进行扩增，将扩增产物测序，得到ITS序列，ITS 序列在所有样品内变化不大，长度为686～699 bp，见图1。

采集NJ法构建系统发育树，见图2。

方法采用Kimura2-parameter距离，系统树各分支的置信度用bootstrap method 检验，共进行1 000次循环，以评价分支的统计学意义与可靠性。

从图2可以来看，通过构建NJ法建立系统树进行聚类，所有的样品分为3大支：荒漠肉苁蓉样品聚为一支，黄花列当样品聚为一支，锁阳样品聚为一支，区分的可信度为99%。

从系统树分支上显示荒漠肉苁蓉和黄花列当的遗产关系较近，与锁阳遗产关系较远，这符合植物的形态分类学的分类结果[3]。

通过系统树聚类分析可将荒漠肉苁蓉和黄花列当及锁阳有效鉴别开。

结果表明ITS序列可以用于鉴别肉苁蓉与其混伪品，ITS序列分析可见能够成为肉苁蓉与其混伪品鉴别分析的有效手段。

3.2 位点特异PCR鉴别肉苁蓉及其混伪品利用位点特异性PCR方法对设计的特异引物进行验证，实验结果显示通过利用肉苁蓉位点特异PCR引物对所有51个实验样品进行PCR扩增：只有荒漠肉苁蓉样品能扩增出331 bp的片段，而混伪品黄花列当和锁阳样品不会扩增出任何条带，部分结果见图1。

实验结果可见该位点特异引物可在同一PCR反应中鉴别正品肉苁蓉和其混伪品黄花列当和锁阳，所以该引物可以作为肉苁蓉及其混伪品黄花列当和锁阳的鉴别引物。

3.3 特异引物扩增条件的优化在位点特异引物中，人为的引入了错配位点，因此PCR扩增条件对实验结果有着较大的影响，并将直接影响到鉴别结果的准确性和稳定性。

为此本研究对PCR循环数、退火温度、引物浓度、dNTP用量及Taq酶进行了考察。

结果显示，该位点特异PCR循环数在23～35，正品肉苁蓉出现了稳定，清晰的鉴别条带，而当循环数小于20个时，鉴别条带开始变暗，甚至不出现鉴别条带；退火温度在50～63 ℃，均可出现稳定的鉴别条带，可见，退火温度对于本研究的位点特异PCR影响不大；在对Taq酶的考察中，发现加入Ex Taq酶的结果明显优于加入rx Taq酶的结果，所以建议使用该引物鉴别时最好使用Ex Taq酶；另外，引物用量CD_1F/CD_2R在2.5/2.5～10.0/10.0 pmol，dNTP用量在10～20 pmol都能扩增出鉴别条带，引物用量和dNTP用量均不宜太高，这与以前学者报道的相符[18]。

综上，通过扩增条件的考察，并结合实际的应用情况。

最终确定出最优的鉴别PCR反应体系：2.5 μL 10 × Ex Taq buffer 缓冲液，2 μL （10 mmol·L-1）dNTPS，引物各0.25 μL（10 pmol·L-1），Ex Taq 酶0.2 μL（5 U·μL-1），DNA 1 μL，灭菌蒸馏水19.8 μL。

而PCR反应条件中，循环数优化为25个，这样缩短了鉴别时间，退火温度对于本研究的影响不大，建议为50 ℃为宜。

3.4 位点特异性PCR鉴别与DNA序列分析法鉴别的比较本研究对荒漠肉苁蓉，锁阳和黄花列当的鉴别分别采用了DNA序列分析法和位点特异性PCR法。