基于ITS序列位点特异性PCR的肉苁蓉与其混伪品的鉴别研究

基于ITS序列位点特异性PCR的肉苁蓉与其混伪品的鉴别研究

研究荒漠肉苁蓉、锁阳和黄花列当之间的DNA分子鉴别方法，采集不同产地的30份荒漠肉苁蓉，13份锁阳以及8份黄花列当，所有样品进行总DNA提取，通过对其ITS片段进行扩增，测序。再进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物，并对位点特异性PCR的反应条件进行了优化；另外，对位点特异性PCR法与DNA序列分析法的鉴别进行了比较。结果显示，该研究设计的位点特异引物在同一PCR反应中，荒漠肉苁蓉能扩增出331 bp的条带，而混伪品锁阳和黄花列当不能扩增出条带，从而实现了正伪品的鉴别。该文通过位点特异PCR的方法可以实现荒漠肉苁蓉与混伪品锁阳、黄花列当的快速、准确鉴别。

标签：荒漠肉苁蓉；位点特异性PCR；分子鉴定肉苁蓉Cistanche Hebra，又名大芸、甜大芸、苁蓉、甜苁蓉、地精等，为我国传统名贵中药材，具有补肾阳，益精血，润肠通便的功效，主治阳痿、不孕、腰膝酸软、筋骨无力、肠燥便秘等。其应用始载于《神农本草经》，被列为上品药材[1]。其在历代增力中药处方中出现率最高，同时在抗衰老类方剂中的出现率仅次于人参，居于第2位，故其具有“沙漠人参”的美誉[2-3]。2000年版《中国药典》之前规定的药材肉苁蓉来源为列当科植物荒漠肉苁蓉Cistanche deserticola Y.C. Ma的干燥带鳞叶的肉质茎[4]。但是近年来，由于野生肉苁蓉资源已濒临枯竭，肉苁蓉及寄主梭梭已被列为国家二级保护植物，同时也被列入濒危动植物种国际贸易公约（CITES）[5]。因此，从2005年版《中国药典》开始，将荒漠肉苁蓉与资源较丰富的管花肉苁蓉 C. tubulosa （Schenk）Wight[6]共同作为肉苁蓉药材的基原植物。

近年来，由于中医药事业的大力发展，导致肉苁蓉需求量大增，货源短缺，目前，市场上肉苁蓉的售价大约125元/kg，列当类药材大约30元/kg，锁阳大约15元/kg，因此，在巨大利益的趋势下，市场上常发现将黄花列当或者锁阳掺杂其中冒充肉苁蓉的现象[7-8]。其中黄花列当Orobanche pycnostachya Hance.为列当科列当属植物，全草入药，具有补肾助阳、强筋骨的功能[9-10]；锁阳Cynomorium songaricum Rupr.为锁阳科锁阳属植物，具有补肾、助阳、益精、润肠的作用[11]。肉苁蓉，黄花列当及锁阳3种药材经过加工后性状较为相似，虽也同为补阳药，但在性味、归经、功能主治不尽相同。因此，建立一种用于快速、准确鉴别肉苁蓉药材的方法对于保障人民用药安全以及规范肉苁蓉市场的流通具有重大意义。

肉苁蓉药材鉴别的方法较多，包括原植物鉴别[12]、性状鉴别和显微鉴定[8，13]以及理化鉴别[14-15]等，但这些鉴别手段常常受到人为或环境因素的影响。与之相比，分子标记技术因具有稳定、不受器官和环境因素影响的特点。目前已报道的肉苁蓉分子鉴别方法是采用DNA条形码通用基因片段ITS2[16]和psbA-trnH[17]，通过基于对序列差异分析来达到肉苁蓉药材的真伪鉴别，但是该鉴别方法繁琐并周期时间长（包括扩增，测序，序列分析等），导致不能满足实际需求，因此急需建立稳定、简单、快捷、通用性好的分子鉴别方法。

近年来，位点特异性PCR方法已成功用于人参[18]，金银花[19]，黄芪[20]

等中药材的真伪鉴别，因此本研究通过位点特异性PCR方法对荒漠肉苁蓉及其混伪品锁阳和黄花列当进行鉴别研究，并尝试对真伪混伪品进行鉴别探索，为肉苁蓉药材的鉴别提供更符合实用要求和简单快捷的方法。

1 材料

2×CTAB提取液，1×TAE缓冲液，琼脂糖（Promega公司），溴化乙锭（Fluka 公司），DNA Taq聚合酶（Takara公司），2 000 bp DNA Markar（Takara公司），三氯甲烷﹑无水乙醇﹑异丙醇均为国产分析纯。

PCR仪（德国Eppendorf，型号5332），电泳系统（北京市六一仪器厂，型号DYY-12），低温冷冻离心机（德国Eppendorf，型号5810R），紫外凝胶成像分析仪（英国Syngene，型号GBOXHR），混合型球磨仪（德国Retsch，型号MM400），数控超声波清洗器（型号KQ-500DE），微量移液器（德国Eppendorf）。

本实验选取的51份材料包括荒漠肉苁蓉30份，黄花列当8份，锁阳13份，分别于2013年在内蒙古和甘肃等地的野外采集，鉴定人为张春红。凭证标本保存于内蒙古科技大学包头医学院。名称、采集地点等见表1。

2 方法

2.1 基因组总DNA的提取、PCR扩增条件的确定取100 mg干燥材料，使用CTAB法提取总DNA。取不同样品DNA，终浓度大约为50 mg·L-1，使用通用引物ITS1和ITS4进行PCR反应以检测模板DNA质量。PCR反应体系总体积为25 μL，包括2.5 μL 10 × Ex Taq buffer缓冲液，2 μL （10 mmol·L-1）dNTPS，引物各0.25 μL（10 pmol·L-1），Ex Taq酶0.2 μL（5 U·μL-1），DNA 1 μL，灭菌蒸馏水19.8 μL。PCR反应液配制完后，轻轻震荡混匀，将PCR管放入PCR仪进行PCR反应，反应程序见表2。取3 μL扩增产物，并加入3 μL 6×loading buffer，通过1%的琼脂糖凝胶电泳，并用EB染色观察。阳性结果的PCR产物由上海美吉生物医药科技有限公司北京分公司测序部测序，各样品均采用正向和反向测序，以保证测序的准确性。2.2 ITS序列分析将3种药材荒漠肉苁蓉，黄花列当以及锁阳的51个个体的ITS序列进行比对分析，所得DNA序列用CONTIG软件同源对齐，并辅以人工校对。排序后的序列使用BioEdit分析软件进行分析处理。用MEGA 4.0 软件对各样品ITS序列的差异性进行分析，并采用邻接法（NJ 法）构建系统发育树，并以Bootstrap作1 000次可信度分析，且cutoff取不小于50%。

2.3 鉴别引物的设计用BioEdit分析软件对ITS序列进行分析、多重比对，找出具有稳定差异的变异位点，筛选获得变异位点，通过该位点利用Primer Premier 5.0软件设计一对用于荒漠肉苁蓉鉴别的特异引物CD_1F/CD_1R，设计的特异引物扩增后片段大小为331 bp，引物序列见表2。

2.4 位点特异性PCR鉴别反应的建立取荒漠肉苁蓉，锁阳和黄花列当不同样品的DNA进行位点特异性PCR，PCR反应体系为2.5 μL 10 × Ex Taq buffer缓