优良菌种选育(杂交育种).
常用菌种选育原理的种植方法
常用菌种选育原理的种植方法今天给大家介绍一下常用菌种选育原理的种植方法！一、人工选种的方法：1.自然选种：该法是通过广泛异地引种、野生采集、孢子分离等途径获得菌种，将其进行驯化移栽，使其逐渐适应当地环境条件，并从中选优汰劣，选出性状优异的菌株。
在菌种生产以及试验性栽培中，反复进行比较和选择，最终确定优良的食用菌品种。
2.杂交育种：该法是通过将不同遗传性状的亲本之间进行交配，使遗传物质重新组合配对，通过双亲性状的优势互补或借助于以一个亲本的优点去克服另一亲本的缺点，产生具有其双亲优点的育种方法。
杂交育种一般有单孢杂交、多孢杂交、单双核杂交、原生质体融合等方法，一般科研、育种上多采用单孢杂交或原生质体融合，通过这些办法处理的菌种常常可表现出较强的“杂交优势”。
3.诱变育种该法是利用物理的或化学的方法处理细胞群体，促使菌种的细胞遗传物质发生性状的改变，然后从变异的菌种中选出具有优良性状的菌种的方法。
科研上常用的主要有辐射诱变育种，如紫外线照射、X射线等高能量射线，以及用一些化学药剂进行诱变育种。
4.基因工程育种该法是在基因分子水平上的遗传工程，又称基因操作、基因克隆、脱氧核糖核酸（DNA）重组技术等，基本原理就是把我们需要的目标基因通过载体DNA与原品种的DNA结合，然后人工导入一个受体细胞内，以让外来的遗传物质在其中“着生”，进行正常的复制，从而获得预先设计的新菌种。
二、菌种分离技术方法：多孢分离：该法是利用子实体弹射许多孢子在同一培养基上，让其萌发、自由交配，从而获得纯母种的方法。
该法简便易行，在食用菌选种中应用普遍。
（1）整菇孢子弹射法：该法适用于伞菌类的孢子采集。
在无菌室（箱）中，将经消毒处理的整只种菇插入无菌平皿孢子收集器里，之后使用透明玻璃钟罩将其罩住，于见光、适温下使菇自然弹射孢子。
24h后，将玻璃钟罩打开，从培养皿内获取孢子。
（2）试管插割法：在无菌箱内，迅速用无菌试管插割种菇有菌褶一侧，直至取下组织块。
237.3优良菌种的选育生物技术制药
➢ 生物诱变剂 噬菌体、转座子
菌种选育的方法——杂交育种
杂交育种一般指利用真核微生物 的有性生殖或准性生殖，或原核微生 物的接合、转化和转导等过程，促使 两个具有不同遗传性状的菌株进行遗 传物质交换和基因重组，以获得优良 性能或新的品种的生产菌株。
杂交育种是一个重要的微生物育 种手段。比起诱变育种，它具有更强 的方向性或目的性。
微生物代谢控制育种是指以生物化学和 遗传学为基础，研究代谢产物的生物合成途 径和代谢调节的机制，选择巧妙的技术路线， 通过遗传育种技术获得解除或绕过了微生物 正常代谢途径的突变株，从而人为地使用有 用产物选择性地大量合成积累。
菌种选育的方法——基因工程育种
基因工程育种技术是一种DNA 体外重组技术，是将人工方法获得的 一段外源DNA分子，用某一限制性内 切酶切割后，与载体DNA连接，然后 导入到某一受体细胞中进行复制、转 录和翻译，从而使受体细胞表达出外 源基因所编码的遗传性状的一种技术。
2.菌种选育
菌种选育是运用遗传学原理和技术
对某种具有特定生产目的的菌株进 行改造，去除不良性质，增加有益 新性状，以提高产品的产量和质量 的一种育种方法，使我们获得所需 要的高产、优质和低耗的菌种。
菌种选育的方法
菌种选育的方法
➢经验育种方法： 自然选育、诱变育种、杂交育种
➢定向育种方法： 代谢控制育种、原生质体融合、
基因重组
菌种选育的方法——自然选育
利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理， 通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持或高
于原有生产水平菌株的过程称为自然选育。
缺点：效率低、进展慢 自然突变频率:10-6-10-10
微生物的天然进化不可能刻意去照顾人类的利益源自自然选育操作步骤： 生产菌种
优良菌珠的选育
五、诱变育种的具体方法
（一）菌悬液的制备，单核，单细胞（孢子10 6 个/mL）
1.菌悬液用生理盐水（ 物理因素处理 ）或缓冲液配
制（化学因素处理中pH不同诱变效果不同或pH
比较长） 容易改变、处理时间
2.用灭菌的玻璃珠把成团的细胞打碎 3.用灭菌的脱脂棉球进行过滤。
（二）诱变处理 根据诱变剂及诱变对象的特点选 用适当处理参数 。
第四章 优良菌株选育与提纯复壮
本章的重点是诱变育种及杂交育
种中几个值得注意的具有普遍意义的 基本问题，以及菌株提纯复壮技术。
内容提要
一、优良菌株的选育
二、优良菌株提纯复壮
第一节
优良菌株的选育
一、食用菌育种常规步骤
二、食用菌育种目标 三、食用菌选择育种 四、食用菌诱变育种
五、食用菌杂交育种
一、食用菌育种常规步骤
地控制生物的生殖，而不是随机进行，以不断累积和有
效利用自然发生的有益变异，进而保留适合人类需要的
个体，培育新品种的过程。
二、人工选择育种应注意的几个基本问题
（1）选择必须针对可遗传的变异
（2）侧重于在不同菌株之间进行选择 （3）必须广泛收集不同地域、不同生态型、
不同栽培特点的菌株
黑木耳耳片大小、厚薄和耳脉
在一定范围内，双亲间的亲缘关系、生
态类型和生理特性上差异越大的，双亲间的相
C、亚硝酸：通过强氧化作用，以氧代替腺嘌呤，
胞嘧啶C6位置上的氨基。
（3）空间诱变等因素
高空环境具有高真空、微重力和多种高能粒
子辐射等特点，具有诱变育种的多种因子。这种特
殊的物理化学环境，引起菌种DNA分子的变异和重
组，从而得到生产效价更优异的高产菌种。 我国空间诱变育种的搭载方式主要有两种，一 种是返地式卫星搭载、另一种是高空气球，高空气 球的条件一般为30～40km ，停留时间在10h 左右。
食用菌菌种选育的一般方法
食用菌菌种选育的一般方法食用菌是指人类食用的真菌。
为了满足人们对食用菌的需求，菌种选育成为推动食用菌产业发展的重要一环。
以下是食用菌菌种选育的一般方法：1.优良菌株的筛选：优良的菌株是选育高产、高品质、耐逆性强的食用菌的基础。
通过野生菌株、采集菌种或现有优良株系的筛选，选取菌株具有高产、耐逆性强、抗病能力强等特点。
2.杂交育种：杂交育种是将两个或多个具有不同特点的菌株进行人工杂交，以增加变异性和多样性。
通过对不同特征的亲本进行杂交，可以获得新的优良菌株。
例如，将高产菌株与抗病菌株进行杂交，可以获得既高产又抗病的优良品种。
3.辅助选择和基因工程：辅助选择是通过生理和生化方法，利用菌株的形态、生长特性、营养需求、代谢产物等性状进行选择。
同时，基因工程技术也可以应用于食用菌菌种选育。
通过转基因技术，可以将目标基因导入到菌株中，增加其产量、抗病性等性状。
4.连续培养和选育：通过连续培养和选育，可以选出适应培养条件和生产要求的菌株。
在不断培养的过程中，逐渐降低菌株对外界条件的依赖，提高其适应性和稳定性。
5.精细筛选和扩繁：通过对菌株进行精细筛选，选取具有理想特征的菌株，如高产、高品质、耐逆等。
同时，通过菌种的扩繁，可以使优良菌株得到大规模繁育。
6.田间试验和品种选育：选育出的菌株需要在田间进行试验，观察其在不同环境条件下的表现，如产量、品质以及抗病性等。
根据试验结果，进一步筛选和培育适应不同地区和需求的优良品种。
7.基因资源的开发和保存：基因资源的开发和保存是食用菌菌种选育的重要环节。
通过对食用菌的生态环境、野生资源及优良株系的研究，收集并保存多样的基因资源，为菌种选育提供多样性和可持续性的基础。
总之，食用菌菌种的选育是一个复杂的过程，需要通过多种方法和手段来进行。
选育出优良的食用菌菌种，既可以提高食用菌的产量和品质，也可以改善其抗病能力和适应性，促进食用菌产业的发展。
微生物工程期末复习题目及答案
名词解释1.富集培养：分为分批式富集培养和恒化式富集培养。
分批式富集培养指将富集培养物转接到新的同一种培养基中，重新建立选择性压力，如此重复转种几次后，再取此富集培养物接种到固体培养基上，以获得单菌落。
恒化式富集培养是通过改变限制性基质的浓度，来控制两类不同菌株的比生长速率2.自然选育：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。
3.诱变选育：用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变4.杂交育种：将不同菌株的遗传物质进行交换、重组，使不同菌株的优良性状集中在重组体中，得到具有新性状的菌株。
5.原生质体融合技术：将遗传性状不同的两种菌(包括种间、种内及属间)融合为一个新细胞的技术6.前体：某些化合物加入到发酵培养基后，能直接被微生物在生物合成过程结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入而有较大的提高。
7.促进剂：那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。
8.抑制剂：在发酵过程中加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以致可以改变微生物的代谢途径。
9.合成培养基：用化学成分和数量完全了解的物质配制而成，成分精确，重复性强，可减少不能控制因素。
10.天然培养基：采用化学成分不清楚或化学成分不恒定的各种动植物或微生物的浸出物、水解液等物质制成的。
11.孢子培养基：制备孢子用的培养基，营养不太丰富。
12.种子培养基：满足菌种生长用的。
营养丰富，氮源、维生素比例较高。
13.发酵培养基：满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累的营养物质。
14.发酵热：发酵过程中释放出来的净热量。
15.生物热：微生物在生长繁殖过程中，本身产生的大量热。
16.搅拌热：搅拌器的机械搅拌的动能以摩擦放热的方式使热量散发在发酵液中17.生理碱性物质：被微生物利用后，使PH上升的物质18.生理酸性物质：被微生物利用后，使PH下降的物质19.OTR：单位体积培养液中的氧传递速率[mol/(m3·s)]OTR=K L a（C*-C L）K L——以氧浓度为推动力的总传递系数（m/s）a——比表面积（m2/m3）K L a——容积传递系数（s-1）C*——与p平衡的液相氧浓度（mol/m3）C L——液相主体氧浓度（mol/m3）20.摄氧率：单位体积培养液，在单位时间内消耗的氧量21.临界氧浓度：在好氧发酵中，满足微生物呼吸的最低氧浓度。
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生理生化鉴定
通过测定菌种的生理生化指标，如糖发酵试验、 氧化酶试验、氨基酸脱羧酶试验等，对菌种进行 进一步的分类和鉴定。
分子生物学鉴定
利用基因测序、PCR扩增、DNA指纹图谱等技术 ，对菌种的基因组进行分析，从而准确鉴定菌种 的种属和分类地位。
测定菌种在不同环境压力下的存活率 、耐受性等，了解菌种的抗逆性能和 适应性。
05 优良菌种的应用与案例分析
优良菌种在工业生产中的应用
01
02
03
生物能源
利用优良菌种将有机废弃 物转化为生物燃料，如乙 醇、生物柴油等，降低对 化石燃料的依赖。
生物化工
通过优良菌种生产高附加 值的化学品、材料和生物 聚合物，如柠檬酸、聚乳 酸等。
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目录
Contents
• 优良菌种选育的重要性 • 优良菌种的选育方法 • 优良菌种的保藏与复壮 • 优良菌种的鉴定与评价 • 优良菌种的应用与案例分析
01 优良菌种选育的重要性
菌种选育对生产效率的影响
菌种选育能够提高生产效率
通过选育具有优良性状的菌种，可以缩短发酵周期，提高产物的合成速度，从 而提高生产效率。
生物冶金
利用微生物从矿石中提取 有价值的金属，如铜、钴 等，具有环保和资源可持 续性的优势。
优良菌种在农业生产中的应用
生物肥料
01
通过微生物肥料提高土壤肥力和植物生长，减少化肥使用，降
低环境污染。
生物农药
02
利用有益微生物防治植物病虫害，减少化学农药的使用，保障
食品安全。
生物饲料
黑木耳优良杂交种的选育
20192020年第dible 育摘要以黑木耳优良栽培品种黑木耳29号及紫柏山野生黑木耳ZB-19为亲本，采用单孢杂交技术选育性能优良的黑木耳菌株。
单单配对杂交获得113个杂交菌株，通过拮抗试验、抗杂菌试验和出菇试验筛选出1株抗杂菌能力强、子实体性状佳、产量高的黑木耳菌株HZ-16，小试栽培该菌株产量稳定，杂菌污染率6.0%，折干率7.25%，平均生物转化率89.05%，产量高于亲本黑木耳29号、黑木耳ZB-19（70.16%、65.30%）。
关键词黑木耳单孢杂交抗杂性文章编号1000-8357（2020）06-0024-03黑木耳（Auricularia auricula ），又称木耳、云耳、光木耳[1]。
近年来，随着“北耳南扩”“科技扶贫”战略的实施，我国黑木耳产业发展迅猛，到2017年总产量达到了638.84万t ，占世界总产量的98%以上。
食用菌产业化快速、可持续发展的基础是要有优质高产的菌种资源，尤其以自然生态环境和传统农艺方式为基础发展起来的中国黑木耳产业，优良菌种对产业发展所占的技术份额起到举足轻重的作用。
杂交育种是食用菌优良品种选育最常用，也是最有成效的方法[2]。
研究以栽培性能优良的黑木耳29号、野生黑木耳ZB-19为亲本，采用单孢杂交技术选育优良黑木耳菌株。
1材料与方法1.1供试菌株亲本选用栽培性能优良的黑木耳29号及野生黑木耳ZB-19，均为陕西省微生物研究所微生物资源中心第三研究室保藏的菌种。
黑木耳29号：黑褐色，耳片中等，无耳根、根基小，抗杂菌，产量高，干湿比中等；黑木耳ZB-19：黑褐色，耳片较小，肉稍薄，背面少筋，耐水性好，干湿比高。
采自陕西凤县紫柏山自然保护区枯立硬杂木上。
1.2试验培养基（1）综合PDA 培养基：马铃薯200g （去皮煮汁），葡萄糖20g ，蛋白胨5g ，酵母膏2g ，MgSO 4·7H 2O 0.5g ，KH 2PO 41g ，琼脂20g ，蒸馏水定容至1000mL 。
三、 优良菌种选育,四菌种保藏的原理和方法
◆ 筛选检出抗药性突变株可用梯度培养皿法
温度敏感突变型筛选
TS（Ts; ts）突变株 （temperature-sensitive mutant）
指仅在某个温度范围内显示与野生型不同表型的突变型。
高温敏感突变型：在某个温度以上显示出和野生型不同表型。 低温敏感突变型：在某个温度以下显示出与野生型不同表型。 如果发生这类突变的基因控制的特性是生长繁殖不可缺少 的，那么就会形成条件致死突变型。 温度敏感突变型（高温）是最常用的一类条件致死突变型 基因功能研究、育种
解除反馈阻遏
解除反馈抑制
通常抗反馈抑制和抗反馈阻遏突变株是通过 抗结构类似物突变的方法筛选出来的 ◆ 结构类似物与末端产物结构相似，能与阻遏蛋白或变构 酶结合，阻止产物的合成，引起反馈调节作用； 但不能代替末端产物参与生物合成 ◆ 抗结构类似物突变株即使在结构类似物存在下，仍可 合成末端产物
末端产物
许可温度(permissive temperature)
保持原来正常性状的温度
限制性温度(restrictive temperature〉 非许可温度 (non-permissive temperature)
显现突变型性状的温度
TS突变株 在许可温度下能正常生长，其表型和野生型没有区 别；在非许可温度下不能生长或微弱生长，表性与野生型不 同。
1
自然选育
• 不经人工处理．利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为 自然选育（spontaneous mutation）：选育、定向培育 • 自然突变：多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应 • 多因素低剂量的诱变效应：指在自然环境中存在着低剂量的宇宙 射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生 的诱变物质等的作用引起的突变。 • 互变异构效应：指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构， 会引起碱基的错配。引起自然突变的几率为10-8-10-9 • 自然突变的结果：一种是菌种退化；一种是对生产有益的突变
优良菌种的选育
诱变剂的选择
1 ．碱基类似物具有很高的特异性，但很 少使用，回复突变率高，效果不大。 2 ．亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造 成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲 基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲 基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。
3 ．吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途 径的完全中断。 4 ．紫外线仍十分有效。电离辐射是造 成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它 能造成不可回复的缺突变。但它可能 影响邻近基因的性能。
第一节 自然选育
不经人工处理，利用微生物的自然突变 进行菌种选育的过程称为自然选育。
多因素低剂量的诱变效应
互变异构效应。
多因素低剂量的诱变效应
是在自然环境中存在着低剂量的宇宙射 线、各种短波、低剂量的诱变物质和微生 物自身代谢产物的诱变物质等的作用引起 的突变。
互变异构效应
是指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间 变构引起碱基错配。例如胸腺嘧啶T和鸟嘌 呤G可以酮式或烯醇式出现，胞嘧啶C和腺嘌 呤A可以氨基或亚氨基式出现。
生长谱测定的方法先将缺陷型菌株培养后，收 集菌体，制备成细胞悬液，与MM培养基(融化并 凉至50℃)混合并倾注平皿。待凝固后，分别在 平皿的5～6个区间放上不同的营养组合的混合物 或吸饱此组合营养物的滤纸圆片。培养后会在某 组合区长出，就可测得所需营养。—个平皿测一 个菌。确定是哪类物质的缺陷型。（氨基酸、维 生素、碱基缺陷型）
(五)分离和筛选
筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大 量的达到初步要求的分离菌落为目的， 以量为主。 复筛则是精选，以质为主，也就是以精 确度为主。因此在具体方法上就有差异 .
1、淘汰野生型
①基本培养基（M．M）——能满足某一菌种的野生 型或原养型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。
第三章、优良菌种的选育
第三章、优良菌种的选育导言优良生产菌种应具备的基本特性：（1）生产菌种应具有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力。
（2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近似的副产物及其它产物。
（3）生长繁殖能力强，有较快的生长速率，产生孢子的菌种应该具有较强的产生孢子能力。
（4）能高效地将原料转化为产品。
（5）具有利用广泛来源原料的能力，并对发酵原料成分的波动敏感性较小。
（6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用。
（前体：）（7）在发酵过程中产生的泡沫要少。
（8）具有抗噬菌体感染的能力。
（9）遗传特性稳定。
3-1自然选育定义：自然突变的结果：自然选育的特点：简单易行，可以纯化菌种，防止菌种退化，稳定产量。
但自然选育的效率低，应该经常跟诱变选育交替使用，提高育种效率。
自然选育的一般程序：3-2诱变选育导言3-2-1诱变育种的原理诱变育种的理论基础是基因突变，突变包括染色体畸变和基因突变两大类。
染色体畸变指的是，染色体或DNA片段发生缺失、易位、逆位、重复等。
基因突变指的是，DNA中的碱基发生变化，即点突变。
过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。
常用的诱变剂包括物理、化学、生物的三大类。
表3-1所示。
3-2-2诱变育种的基本方式导言3-2-2-1出发菌株的选择进行诱变的出发菌株的性能，对提高诱变效果和效率十分重要。
选择出发诱变菌株的注意事项：诱变育种的程序：3-2-2-2诱变剂的使用方法|------单一诱变剂处理：对野生菌株处理有效。
诱变方法||------复合诱变剂处理：对经过多次诱变处理的老菌株。
复合诱变剂处理|----同一诱变剂多次处理|----两种以上诱变剂先后分别处理|----两种以上诱变剂同时或多次处理举例：青霉菌的选育。
3-2-2-3诱变剂的剂量选择诱变剂的剂量与致死率有关，而致死率又与诱变率有关。
因此，可用致死率作为诱变剂剂量的选择依据。
关系：诱变率随诱变剂剂量的增加而提高，但达到一定程度后，反而下降。
优良菌种选育(原生质体融合)
洗涤菌体
酶解释放原生质体
洗涤菌体
酶解释放原生质体
分离纯化原生质体
分离纯化原生质体
AB原生质体等量混合
原生质体融合
再生
原生质体的融合方法
原生质体融 合方法
自发融合
融合概率低， 一般不推荐
诱导融合 激光诱导融合 电诱导融合
化学诱导融合
不需要仪器，操作 简单，但PEG对细胞 －16－ 有毒性，原生质体 融合率低 无毒无害，直观操作， 融合率较高，但需要在 专门的电融合仪
再生培养基
• • • 用MgSO4、甘露醇、山梨糖、蔗糖为渗透剂，不同的微 生物种类应选择不同的再生培养基。 营养因子，酵母膏、酪蛋白、氨基酸、糖类 原生质体保护剂扩张剂：牛血清白蛋白、人血清白蛋 白、明胶等对原生质体具有保护作用，同时起到原生 质体扩张剂作用，刺激原生质体再生。 加入再生细胞壁诱导物与前体物质：在培养基中加明 胶、细胞壁残片甚至纤维素都有刺激原生质体再生的 功能
纤维素酶 Cellulase
酵母裂解酶 Zymolyase β1,3葡聚糖酶
蜗牛酶 商品酶 Novozyme234来自 Trichoderma harzianum Lywallzyme 广东微生物研究所溶壁酶 Glucuronidase 葡聚糖苷酸酶
原生质体释放有关的因素
酶解时间：20min-7h左右，一般细菌酶解时间较短， 真菌酶解时间较长。 pH值：细菌如枯草芽孢杆菌最适pH7.5-8.5，低于 pH7对原生质体的制备率影响较大。真菌如黄青霉 菌最适pH为5.5，在pH值4.0-8.0范围内均可释放原 生质体。 预处理剂：青霉素，巯基乙醇，二硫苏糖醇 渗透压稳定剂：KCl，NaCl，CaCl2，MgSO4，蔗糖， 甘露糖，山梨醇。一般丝状真菌比较适宜以无机盐 为稳压剂，酵母菌则使用糖醇做稳压剂比较好。
优良菌种的选育
１、原核表达系统
原核生物不适宜表达需后加工处理的那一部分真核基因
优点：简单易行，可与生产同步进行。 优点：简单易行，可与生产同步进行。 缺点：频率低， 次分裂。 缺点：频率低，10-8—10-9 /次分裂。 次分裂
二、诱变选育
诱导微生物发生突变进行的菌种选育， 诱导微生物发生突变进行的菌种选育，包 诱变和筛选两个步骤 两个步骤。 括诱变和筛选两个步骤。 原理：染色体畸变；基因突变。 原理：染色体畸变；基因突变。
④物敏突变： 物敏突变：
如：氟乙酸抑制顺乌头酸酶，氟乙酸敏感突变型， 氟乙酸抑制顺乌头酸酶，氟乙酸敏感突变型， 顺乌头酸酶活性极低，更敏感， 顺乌头酸酶活性极低，更敏感，异柠檬酸产量 柠檬酸积累。 少，柠檬酸积累。
三、杂交育种
长期诱变会使菌种生活能力下降。 长期诱变会使菌种生活能力下降。 借助有性重组， 借助有性重组，使不同菌株的遗传物质 得以交换（获优良性状集中的重组体）。 得以交换（获优良性状集中的重组体）。 1.细菌的杂交育种 细菌的杂交育种
应用：解决了一些药物或材料来源困难， 应用：解决了一些药物或材料来源困难，或制造技术复
杂，或造价昂贵而无法大量生产和应用的问题。 或造价昂贵而无法大量生产和应用的问题。 产生了巨大的经济和社会效益。 产生了巨大的经济和社会效益。 工业生产的意义： 工业生产的意义： 基因的表达产量； 表达产物的稳定性； 基因的表达产量； 表达产物的稳定性； 产物的生物活性； 产物分离纯化。 产物的生物活性； 产物分离纯化。 （一）基因表达系统 从育种的角度考虑,最重要的是目的基因的高效表达 最重要的是目的基因的高效表达。 从育种的角度考虑 最重要的是目的基因的高效表达。 原核表达系统； 真核表达系统 真核表达系统． １.原核表达系统；２.真核表达系统． 原核表达系统
优良菌种选育
第三章工业微生物优良菌种选育从自然界分离所得的野生菌种，不论在产量上或质量上均不适应微生物工程的要求，因此从自然界存在的产生某种代谢产物的菌种，经筛选分离和优良菌选育，已成为微生物工程菌种管理上的必要程序。
故优良菌种的选育是为生产提供各种类型的突变株，大幅度提高菌种产生利用价值代谢产物特别是基因工程，细胞工程和蛋白质工程等较为定向技术的发展，促进菌种选育技术不断更新，进而研制出众多有价值的微生物工程产品。
微生物工程优良菌种的选育方法包含自然选育、诱变选育、抗噬菌体菌种的选育、杂交选育、原生质体融合技术、基因工程技术等等。
微生物工程评价生产菌种优劣的标准和菌种选育工作的研究目标是实现工业化生产。
也就是说，选育的菌种特性能否满足工业化生产的实际需要，是否具有工业化生产价值和实际利用价值。
因此，一株优良的生产菌种应该具备如下的特性：①菌种的生长繁殖能力强，具较强的生长速率，产生孢子的菌种应具有较强的产孢子能力。
这样有利于缩短发酵培养周期，减少种子罐的级数，最终得以减少设备投资和运转费用。
同时，还可以减少菌种在扩大生产过程中可能发生的生产下降，或杂菌污染的可能性。
②菌种的培养基和发酵原料来源广泛、价格便宜、尤其对发酵原料成分的波动敏感性较小。
③对需要添加的前体物质具有耐受能力，且不能将这些前体物质作为一般碳源利用。
④菌种应具有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力，高产菌株的应用，可以在不增加投资的情况下，大幅度提高企业的生产能力。
⑤能高效地将原料转化为产品，这样可以降低生产成本，提高产品的市场竟争力。
⑥在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的副产物及其它产物，这样不但可以提高营养物质的有效转化率，还会减少分离纯化的难度，降低成本，提高产品质量。
⑦在发酵过程中产生的泡沫要少，这对提高装料系数，提高单罐产量，降低成本具有重要意义。
⑧具有抗噬菌体感染的能力。
⑨菌株遗传特性稳定，以保证发酵能长期、稳定地进行，有利于实施最佳的工艺控制。
优良菌种选育(杂交育种)综述
接合 （Conjugation）
“雄性”菌株（F+），
F+
有性菌毛
“雌性”菌株（F-），
《杂交的方法，直接混合法》
1. 分别培养直接亲本菌株, 至对 数期 2. 离心，洗涤，加新鲜培养液 3. 混合，离心，放置：让亲本菌 株间的染色体进行连接、交换 和重组 4. 稀释，涂布于平皿 5. 筛选
《杂交的方法，滤纸上混合》
《分离子》
• 杂合二倍体经过染色体杂交和单倍化后产生的子细胞, 称为分离子。 • 亲本分离子：基因型和直接亲本一样 • 原养型分离子：同野生型，失去了亲本的营养缺陷型 标记，能在基本培养基上生长。进入筛选程序。 • 异养型分离子 :与两直接亲本的一个相同 亲本 杂合二倍体 分离子
A+BA-B+
A+BA-B+
本科生 Bachelor 讲 听
硕士研究生 Master 老师 ↓ 课题 ↓ 实验 ↓ 结果 ↓ 论文
博士研究生 Doctor
解决方案1 解决方案2
结果1 结果2
基因重组过程近似细菌，育种方法与霉菌相似．
放线菌的遗传体系和杂交原理：
异核现象：同一细胞（菌丝）含不同基因型的染色体
接合现象：发生部分染色体转移（交换），形成部分合子 异核系的形成：部分合子产生的无性繁殖系。染色体融合 能在基本培养基上生长 重组体的形成：异核系不稳定。经过重组，分离，得 到重组子
《放线菌杂交过程》
３、霉菌的杂交育种
《在固体培养基上的一些形态》
《霉菌杂交的原理和杂交技术》
• 霉菌杂交育种是利用准性生殖过程中的基因重 组和分离现象。 • 准性生殖过程：不通过有性生殖的基因重组过 程。 • 将不同菌株的优良特性集合到一个新菌株中。
菌种的优良选育
二、诱变育种的基本方法
•出发菌株的选择与纯化 •处理菌悬液的制备 •诱变处理 •中间培养 •突变株的筛选
(一)出发菌株的选择与纯化
自 多因素低剂量的诱变效应
然
如：宇宙各种短波辐射、低浓度诱变物质、微生
突
物自身代谢产生的诱变物质（如过氧化氢）
变
原 因
互变异构效应
四种碱基第六位上氨基和酮基的异构
几率：10-8～10-9
自然突变会产生两种结果：
一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰 退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。 另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突 变成为正突变。
化学诱变机制
①通过掺入DNA分子而引起突变。
例如碱基类似物(5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤等) 它们通过代谢作用掺入DNA分子中起诱变作用，所以 对于代谢作用基本上停顿了的细胞不起作用，对于 离开细菌的噬菌体不起作用，对于离体的DNA也不起 作用。
②通过和DNA直接起化学反应。
多数化学诱变剂属于这一类型。由于它们和DNA发 生化学反应，所以在代谢作用几乎停顿的细胞中(例如 芽胞)、在离开细菌的噬菌体中、在离体的DNA中，都 可以诱发突变。例如亚硝酸能使腺嘌呤脱去氨基而成 为次黄嘌呤，使胞嘧啶脱去氨基而成为尿嘧啶。
主要环节
• 以合适的诱变剂处理 • 用合适的方法淘汰负效应变异株
一、诱变育种的原理
• 能诱发基因突变，并使突变率提高到超过自然 突变水平的物理、化学因子、生物物质统称为 诱变剂。
物理：紫外，快中子等 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍等 生物物质：噬菌体
第4章 优良菌种选育
若此酶是某蛋白质、核苷酸合成途径中所需的 酶，该突变株在高温下的表型就是营养缺陷型。
（4）敏感突变
柠檬酸经顺乌头酸酶催化，转化为异柠檬酸。 生产上为了提高柠檬酸的产量，必须抑制顺乌头酸酶 活性，防止异柠檬酸的产生。 氟乙酸可抑制顺乌头酸酶活性，通过诱变处理造成顺 乌头酸酶结构基因的突变，有可能造成酶活力下降，那 么此菌株必然对氟乙酸更加敏感，即不足于抑制野生菌 顺乌头酸酶活力的某一氟乙酸浓度，会对突变型产生抑 制作用。
4.3 杂交育种
生产上，长期使用诱变剂处理，会使菌种的生
活能力逐渐下降，如生长周期延长、孢子量减少、 代谢减慢、产量增加缓慢。 因此有必要利用杂交育种的方法，提高菌种的
生产能力。
杂交育种的目的是：
（1）将不同菌株的遗传物质进行交换、重组；
（2）将不同菌株的优良性状集中在重组体中；
（3）克服长期诱变引起的生活力下降等缺陷。
这两种突变均是由于代谢失调，它们有共同的 表型，即在细胞中已经有了大量的末端产物时，仍 不断合成这一产物。但其代谢失调的原因不同。
通常抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株是 通过抗结构类似物突变的方法筛选出来的。 结构类似物与末端产物有相似的结构，能 与阻遏蛋白或变构酶结合，阻止产物的合成， 引起反馈调节作用，但它们不能代替末端产物 参与生物合成，它们的浓度不会降低，因此它 们与阻遏蛋白或变构酶结合也是不可逆的。未 突变的细胞因代谢受阻，不能合成某种产物而 死亡。抗反馈调节突变菌株则即使在结构类似 物存在下，仍可合成末端产物形成菌落。
（2）抗噬菌体菌株的选育
噬菌体的感染常给工业生产造成巨大的损失。
而且噬菌体很容易发生变异，使对噬菌体原具 有抗性的菌株失去抗性，所以需要不断选育抗性 菌株。 有研究表明，细菌对噬菌体的抗性是基因突变 的结果，这种抗性可以发生在接触噬菌体以前， 与噬菌体的存在与否无关。
菌种的优良选育
L－缬氨酸的诱变育种途径：
（1）切断和改变平行代谢途径 （2）解除菌体自身的反馈抑制 （3）增加前体物质的合成
• 切断和改变平行代谢途径：
由图1可以看出，缬氨酸和异亮氨酸的生物合 成途径是平行进行的，缬氨酸、亮氨酸与异亮氨 酸的生物合成途径中公用了三种酶:即乙酰乳酸合 成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基脱水酶。选 育亮氨酸、异亮氨酸营养缺陷型突变株可以使用 于合成三种氨基酸的公用酶系完全用于缬氨酸的 生物合成，进而提高缬氨酸的产量。
（3）等离子输入
较新的诱变方法，变异幅度大，有较高的突变率，较 广的突变谱；再者突变体的遗传性能比较稳定，回复突变 率低。
(四)中间培养
由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一 个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过 程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性 状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定 菌株都是极为重要的。
• 增加前体物质的合成：
由图 1可 以看出生物合成的前体物质是丙酮酸，为 了积累更多的缬氨酸，必须提高丙酮酸的产量，可以选育 以琥珀酸为唯一碳源生长慢、丙氨酸缺陷型以及氟丙酮敏 感突变株。Kyawa等选 育出的缬氨酸突变株在以葡萄糖为 唯一碳源的培养基中进行培养时对丙酮酸类似物比较敏感， 通过选育丙酮酸类似物敏感突变株，降低了丙酮酸脱氢酶 的活性，达到了积累丙酮酸的目的。丙酮酸的积累有利于 高产L-缬氨酸。
③通过一对核苷酸的插入或缺失。
吖啶黄、吖啶橙等染料能够引起移码突变。所谓 移码就是密码编组的移动。
使用化学诱变剂的优缺点：
优点： 1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。 2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，
设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐 射进行工作时，设备费用大，并要注意安全性。 缺点：
食用菌优良菌种的选育
食用菌菌种选育导言优良生产菌种应具备的基本特性：（1）生产菌种应具有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力。
（2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近似的副产物及其它产物。
（3）生长繁殖能力强，有较快的生长速率，产生孢子的菌种应该具有较强的产生孢子能力。
（4）能高效地将原料转化为产品。
（5）具有利用广泛来源原料的能力，并对发酵原料成分的波动敏感性较小。
（6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用。
（前体：）（7）在发酵过程中产生的泡沫要少。
（8）具有抗噬菌体感染的能力。
（9）遗传特性稳定。
3-1自然选育定义：自然突变的结果：自然选育的特点：简单易行，可以纯化菌种，防止菌种退化，稳定产量。
但自然选育的效率低，应该经常跟诱变选育交替使用，提高育种效率。
自然选育的一般程序：3-2诱变选育导言3-2-1诱变育种的原理诱变育种的理论基础是基因突变，突变包括染色体畸变和基因突变两大类。
染色体畸变指的是，染色体或DNA片段发生缺失、易位、逆位、重复等。
基因突变指的是，DNA中的碱基发生变化，即点突变。
法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。
常用的诱变剂包括物理、化学、生物的三大类。
表3-1所示。
3-2-2诱变育种的基本方式导言3-2-2-1出发菌株的选择进行诱变的出发菌株的性能，对提高诱变效果和效率十分重要。
选择出发诱变菌株的注意事项：诱变育种的程序：3-2-2-2诱变剂的使用方法|------单一诱变剂处理：对野生菌株处理有效。
诱变方法||------复合诱变剂处理：对经过多次诱变处理的老菌株。
复合诱变剂处理|----同一诱变剂多次处理|----两种以上诱变剂先后分别处理|----两种以上诱变剂同时或多次处理举例：青霉菌的选育。
3-2-2-3诱变剂的剂量选择诱变剂的剂量与致死率有关，而致死率又与诱变率有关。
因此，可用致死率作为诱变剂剂量的选择依据。
关系：诱变率随诱变剂剂量的增加而提高，但达到一定程度后，反而下降。
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酵母菌的杂交育种
双单特性：存在单倍体和二倍体的生活史, 二倍体生活力强，生产能力高，可 通过杂交得二倍体来育种。 方法：获单倍体细胞进行杂交。 杂交方式： 孢子与孢子； 孢子与单倍体细胞； 单倍体细胞间。
《酵母菌的生活史》
《酵母菌的杂交》
杂交过程包括遗传标记菌株的选择，子囊 孢子诱导、接触、接合、接合子形成，直至 二倍体细胞出芽为止的一系列过程。
混合培养
异核体亲本分离子A Nhomakorabea异核现象
A
结合现象 染色体 连接 染色体 重组 分离
B
B
部分合子
异核系
重组体
《放线菌的杂交技术》
放线菌杂交方法: (一)平板杂交法（测定亲和性） (二)混合培养法 (三)玻璃纸法
《平板杂交法》
大量菌株（A组）与一个共同试验菌株（B）进行杂交 用来检测亲和性
A组 Ap-，phe+ B Ap+，pheA组和B的重组体
《分离子》
• 杂合二倍体经过染色体杂交和单倍化后产生的子细胞, 称为分离子。 • 亲本分离子：基因型和直接亲本一样 • 原养型分离子：同野生型，失去了亲本的营养缺陷型 标记，能在基本培养基上生长。进入筛选程序。 • 异养型分离子 :与两直接亲本的一个相同 亲本 杂合二倍体 分离子
A+BA-B+
A+BA-B+
A+B- + A-B+
A +B +
进入 筛选程序
A+B- or A-B+
名词解释
野生型 营养缺陷型 原养型 异养型 原养型分离子 异养型分离子 亲本分离子 A+B+ A+BA+B+ A+BA+B+ A+BA+BA+B+ A-B+ A-B+
A-B+ A-B+
4.3 杂交育种
1. 2. 3. 4. 细菌 放线菌 霉菌 酵母菌
优良菌种选育 杂交育种
优良菌种选育——要点
• • • • • 微生物优良生产菌种的特征 工业菌种的育种方针 自然突变选育 诱变选育 杂交育种 细菌 放线菌 霉菌 • 原生质体融合 • 基因工程技术
酵母菌
4.3 杂交育种
杂交(hybridization)
优点: • 改变亲株的遗传物质基础,扩大变异范围,使两 亲株的优良性状集中于重组体内,获得新品种。 • 丰富并促进遗传学理论的发展。
《霉菌杂交的过程》
亲本
异核体
杂合二倍体 原养型分离子
A+B-
A+B+ A-B+
A+B+
A+B+
《异核体》
同核体:同一种基因型的细胞核 异核体:是指两个基因型不同细胞核处在同一个细胞质里, 在生长过程中由对方提供所缺陷的营养因子,因而 营养得到互补。 要排除喂养现象 两个具有不同营养标记的亲本同时接种在一个培养基 上,互相间没有接触,但十分靠近,在生长过程中,双方产 生的代谢产物都为对方提供不能合成的营养物质,通过 培养基渗透扩散,得到补充,可以在基本培养基上生长繁 殖形成菌落这种现象称为喂养或互养。
(b)基本培养基衔接法 两亲本分别接种到基本培养基斜面两端， 适温培养后,衔接部分长出异核体菌丝丛。
《杂合二倍体的形成和检出》
• 杂合二倍体的形成和诱发：异核体内自发 核融合形成杂核二倍体的频率极低,一般为 10-6。常以人工诱变方法来提高频率 （紫 外照射、高温培养、樟脑熏蒸）。 • 杂合二倍体常常在异核体菌落上以角变或 斑点形态出现。
３、霉菌的杂交育种
《在固体培养基上的一些形态》
《霉菌杂交的原理和杂交技术》
• 霉菌杂交育种是利用准性生殖过程中的基因重 组和分离现象。 • 准性生殖过程：不通过有性生殖的基因重组过 程。 • 将不同菌株的优良特性集合到一个新菌株中。
• 原理和技术和放线菌相似
《霉菌杂交的过程》
异核体的形成：两不同性状细胞（菌丝）连接，导致一 细胞存在两个不同遗传型核。 杂合二倍体形成；异核体偶尔发生不同核的融合，形成 杂合核，为双倍体。 体细胞重组：杂合二倍体只具有相对稳定性，繁殖过程 发生染色体交换，单倍化，形成各种分 离子。
《选择直接亲本》
亲和力强、明显营养标记 亲和力试验可采用衔接法:将两个菌株共同接种于 基本斜面培养基中若能形成异核体菌丝丛,则表明 此两菌株具有亲和力,该组合即可用于杂交试验。
《异核体合成方法》
(a)完全培养基的混合培养法 两亲本混合接种于液体完全培养基中, 适温培养1-2d,待长出菌丝后,用生理盐水 洗涤,离心数次,把菌丝撕碎于基本培养基 平板上,培养7-8d后,长出异核体的菌丝丛, 挑取其上孢子置于基本培养基斜面保存。
1. 2. 3. 4. 将两个直接亲本菌株,分别培养至对数期 取同样量混合，过滤在滤膜上 将滤膜（菌面朝上）平放在平板培养基上 置于37℃培养,让亲本菌株间结合，染色体进 行连接、交换和重组
此法的效率比液体混合法效率高。
4.3 杂交育种
1. 2. 3. 4. 细菌 放线菌 霉菌 酵母菌
２、放线菌的杂交育种
1. 原始亲本：具有不同遗传背景的优质 出发菌株。 2. 直接亲本：具有遗传标记和亲和能力， 直接用于杂交配对的菌株。
《杂交育种的遗传标记》
1、营养缺陷型标记
其中A株为生物素、苯丙氨酸和半胱 氨酸缺陷,B株为苏氨酸、亮氨酸和 硫胺缺陷型。双亲本都不能在基本 培养基上生长,但杂交后代基因重组 后产生营养互补的原养型重组体可 在基本培养基上生长
《实验室子囊孢子的获得方法》
杂交配对的菌株必须是单倍体,所以首先要得 到单倍的子囊孢子，常用的孢子培养基为:无水醋 酸钠0.8%,氯化钾O.2%,琼脂2%,制成试管斜面。 子囊孢子获得采用蜗牛酶处理,水解子囊壁, 然后剧烈振荡,释放出子囊孢子,接着加人液体石 蜡,摇匀后孢子就聚集于液体石蜡层。
《单倍体接合能力及接合型的鉴定》
细菌
放线菌 杂交后
霉菌
酵母菌
筛选优良菌种
优良菌种选育——要点
• • • • 微生物优良生产菌种的特征 工业菌种的育种方针 自然突变选育 诱变选育 原理 基本方法 • 杂交育种 细菌 放线菌 霉菌 • 原生质体融合 • 基因工程技术
酵母菌
作业 为什么对杂交亲本标记？
有哪些遗传标记？ 原养型和野生型的区别？
本科生 Bachelor 讲 听
硕士研究生 Master 老师 ↓ 课题 ↓ 实验 ↓ 结果 ↓ 论文
博士研究生 Doctor
解决方案1 解决方案2
结果1 结果2
接合 （Conjugation）
“雄性”菌株（F+），
F+
有性菌毛
“雌性”菌株（F-），
《杂交的方法，直接混合法》
1. 分别培养直接亲本菌株, 至对 数期 2. 离心，洗涤，加新鲜培养液 3. 混合，离心，放置：让亲本菌 株间的染色体进行连接、交换 和重组 4. 稀释，涂布于平皿 5. 筛选
《杂交的方法，滤纸上混合》
４、酵母菌的杂交育种
通常有球状、卵圆状、柱状或假丝状等多种。
啤酒酵母
《酵母菌的代表属及利用价值》
（1）酵母菌属 例：啤酒酵母 利用价值： 食品加工 生产多种药剂
（2）裂殖酵母属
（3）假丝酵母属 例：热带假丝酵母 解脂假丝酵母 产朊假丝酵母
进行石油脱蜡
生产有机酸 处理污水及综合利用 监测重金属
（4）球拟酵母属
• 将获得的单倍体菌株分别与标准a型、α型 菌株混合培养, • 与标准a型菌株形成哑铃形接合子的待测菌 株为 α型。
α型
标准a型
《杂交》
• 将 a 型与 α型单倍体菌株混合接种于 YEPD 液体培养基中, 于 30 ℃摇床培养, 观察接 合子的形成情况,培养 20 h 后收集菌体, 涂 布 YEPD 平板, 挑取较大的单菌落, 鉴定菌 株的产孢能力, 能够产孢的菌株为二倍体杂 交株, 编号保存。
《微生物杂交育种基本程序》
1. 选择原始亲本 2. 诱变筛选直接亲本 3. 直接亲本之间亲和力鉴定 4. 杂交 5. 筛选重组体 6. 重组体分析 7. 鉴定。
《微生物杂交育种基本程序》
亲本的选择 亲本的标记和 亲和力测定 二倍体形成 重组及 重组体的分离
原始亲本
直接亲本
《杂交过程中亲本的选择》
基因重组过程近似细菌，育种方法与霉菌相似．
放线菌的遗传体系和杂交原理：
异核现象：同一细胞（菌丝）含不同基因型的染色体
接合现象：发生部分染色体转移（交换），形成部分合子 异核系的形成：部分合子产生的无性繁殖系。染色体融合 能在基本培养基上生长 重组体的形成：异核系不稳定。经过重组，分离，得 到重组子
《放线菌杂交过程》
接合 （Conjugation）
机制
(大肠杆菌的接合机制)
接合作用是由一种被称为 F因子的质粒介导 • F因子：是一种质粒，存在 与细胞质中，一般以游离状 态，有时又和染色体以结合 状态存在，是一种稳定的遗 传物质。为环状DNA双链结构。 上面有编码细菌产生性菌毛 及控制接合过程进行的20多 个基因。
影印
影印
完全培养基
基本培养基 + Ap
《混合培养法》
和细菌一样
A株
B株
原养型重组体，MM上生长
《玻璃纸法》
玻璃纸：有微孔可以吸收玻璃纸下的营养
A Ap-，phe+
在显微镜下收集异核系的菌丛
重组体 异核系
玻璃纸
玻璃纸
B Ap+，phe-
基本培养基 （Ap+）
基本培养基
完全培养基
4.3 杂交育种